Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados

Resumen

Este protocolo describe una técnica mejorada para la abundante colección de líquido cefalorraquídeo (LCR) sin contaminación de la sangre. Con la mayor colección de la muestra y la pureza, se pueden realizar análisis más uso de CSF para mejorar nuestra comprensión de las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.

Resumen

El líquido cerebroespinal (CFS) es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. Es uno de los fluidos en contacto más cercano con el sistema nervioso central y por lo tanto, se puede utilizar para analizar el estado enfermo del cerebro o la médula espinal sin acceder directamente a estos tejidos. Sin embargo, en los ratones es difícil de obtener de la cisterna magna debido a su proximidad a los vasos sanguíneos, que a menudo contaminan las muestras. El área de recolección de LCR en ratones también es difícil de diseccionar a y a menudo sólo pequeñas muestras se obtienen (máximo de 5-7 μl o menos). Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora en los métodos actuales de colección para minimizar la contaminación de la sangre y permiten la abundante colección de LCR (en promedio que 10-15 μl se pueden recoger). Esta técnica puede utilizarse con otros métodos de disección para la colección de tejidos de ratones, como no afecta ninguna tejidos durante la extracción de la CSF. Así, el cerebro y la médula espinal no se ven afectadas con esta técnica y permanecen intactos. Con pureza y una mayor recolección de muestra de LCR, análisis más pueden utilizarse con esta investigación de la neurociencia de líquido para más ayuda y entienden mejor las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.

Introducción

El LCR es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. El LCR se hace principalmente de plasma de sangre, que contiene pocas células (sin glóbulos rojos y sólo unas pocas células blancas de la sangre) y está casi libre de proteínas. Es uno de los fluidos en contacto con el sistema nervioso central (SNC) y puede pasar muchos electrolitos del cerebro y la médula espinal del sistema periférico. En los seres humanos, CSF muestras se pueden recoger para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad o para fines de investigación en ensayos clínicos, como una punción raquídea (punción lumbar) es un procedimiento invasivo, menor: el líquido cefalorraquídeo puede reflejar los cambios en el SNC sin tener que acceder directamente a estos tejidos. Así, en los últimos años, para fines de investigación en la clínica, se han obtenido muestras de CSF de pacientes de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y otras demencias^1,2,3. Hay muchos análisis de biomarcadores que se han desarrollado utilizando muestras de CSF para potencialmente ayudar en el diagnóstico de enfermedades en la clínica^2,3. Sin embargo, hay mucho debate sobre la fiabilidad de estos ensayos para producir resultados consistentes y sensibles para diagnosticar específicamente la enfermedad^4,5. Por lo tanto, hay una gran necesidad para el desarrollo de mejores ensayos y objetivos, que pueden encontrarse en el líquido cefalorraquídeo, para ayudar en la producción de una técnica estándar para diagnosticar enfermedades neurodegenerativas con mayor sensibilidad y especificidad. Debido a la importancia potencial de muestras humanas de la CSF en la enfermedad, la colección del LCR de los roedores en la investigación de la neurociencia es también de interés.

Ratones son animales importantes en la investigación biológica y médica y permiten la prueba de potenciales compuestos terapéuticos y estudios de prueba de concepto antes de ensayos clínicos en humanos. Sin embargo, en ratones es difícil obtener muestras CSF debido a su proximidad al cerebro en un animal pequeño, como el método de recolección de LCR en ratones es obtenerlo a través de la cisterna magna, una abertura entre el cerebelo y la superficie dorsal de la médula oblongada. Esto causa dificultad en la recolección de muestras de CSF como esta área es difícil de diseccionar a y en proximidad cercana a los vasos sanguíneos, aumentando el riesgo de contaminación de las células de la sangre. Debido a estas dificultades, la mayoría de los investigadores sólo puede obtener una pequeña cantidad de LCR para análisis (generalmente indicado como μl 5-7) y la contaminación de muestras de CSF en las células de la sangre es una preocupación primaria para análisis^{6,7,8 , 9}. contaminación de la sangre puede ocultar resultados y no verdaderamente reflejan el estado del SNC. Además, muestra limitada recogida puede impacto investigación como en la cantidad habitual de ratones es suficiente sólo una medición (en duplicado o triplicado) usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Así, muestras CSF son agrupadas generalmente de varios ratones con el fin de tener suficiente muestra para ejecutar múltiples ensayos. Desarrollando un protocolo para la abundante, colección incontaminada de la CFS de ratones se desea grandemente y será beneficiosa en la mejora de la investigación de la neurociencia con roedores.

En el presente Protocolo, una técnica para la abundante (un promedio de 10-15 μl) colección de LCR de ratones anestesiados se describe en detalle y mejora en un método actualmente conocido de recolección de LCR para minimizar la contaminación de sangre¹⁰. Un protocolo robusto para recolección de LCR ayudará en el desarrollo de análisis de biomarcadores basados en la CSF, que podría utilizarse para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad, así como mejorar la investigación en los mecanismos que subyacen a las enfermedades que afectan el SNC.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron conforme a las políticas de la sociedad para la neurociencia (USA) y comités de ética de la Universidad de Fudan (Shanghai, China). Este procedimiento es una cirugía no supervivencia.

1. instalación de aparatos de la colección de LCR

1. Tire el vaso capilar (diámetro interno 0, 75 mm, diámetro externo de 1,0 mm) utilizando un extractor de micropipeta (como se muestra en Liu et al. ¹⁰; tubo capilar afilado se muestra en la figura 1).
2. Lugar un capilar en el porta capilar de vidrio afilado montado firmemente en un micromanipulador (figura 1A).
3. Romper la punta del tubo capilar afilado con pinzas rectas con un microscopio de disección, por lo que el diámetro interno de la punta rota es de 10-20 μm (figura 1).
4. Conecte una jeringa y un tubo delgado en el otro extremo del soporte del tubo capilar y conecte la jeringa y la sonda delgada con una válvula de tres vías.
5. Cambiar la válvula de tres vías para abrir y hundir la jeringa para soplar aire de la jeringa a través del tubo para el capilar para expulsar cualquier contaminante y crear la presión positiva en el tubo capilar de vidrio.
6. Repita esto unas cuantas veces por dis-conectar y volver a conectar la jeringa a la válvula de tres vías y elaborar la jeringa ~ 100-200 μL antes de la última re-conexión de la jeringa con la válvula de tres vías (figura 1B).
7. Mueva el instrumental quirúrgico con el capilar de vidrio al lado para evitar daños durante la disección del ratón.

Figura 1. Microscopio, instrumental quirúrgico y configuración capilar. (A) microscopio e instrumental quirúrgico con tubo capilar unida de configuración, así como una imagen más cercana de (B) la jeringa conectada y la válvula de tres vías para abrir (mostrado aquí) o cierre la tubería y (C) una intacta (derecha) y rota (izquierda) Punta capilar lista para recolección de LCR. Una vez roto, la punta del tubo capilar debe tener un diámetro interno de 0,75 mm, diámetro externo de 1,0 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. ratón disección

1. Anestesiar el ratón.
   Nota: para este protocolo, C57BL/6 y amiloide precursora proteínas/presenilin 1 (aplicación/PS1) transgénicos (modelo de ratón de la enfermedad de Alzheimer) de ratones fueron utilizado y anestesiado con hidrato de cloral 4% (en dH₂0) a 10 μl/g de peso del ratón vía intraperitoneal inyección.
2. Cuando completamente anestesiados, asegúrese de que el ratón es adecuadamente anestesiado. La respuesta de retirada a los pies, pizca, ligeramente extendiendo los miembros posteriores y pellizcos de los dedos del pie y observando una respuesta de retirada, se realiza para asegurar la anestesia adecuada. Compruebe pellizcando las cuatro extremidades; Si no hay reacción el ratón correctamente está anestesiado. Corte y recorte el pelo en la parte posterior de la cabeza del ratón por encima de los ojos, entre las orejas a la parte inferior del cuello usando tijeras de disección (figura 2A). Por otra parte, clippers o crema depilatoria puede utilizarse para ayudar en la eliminación del vello.
3. Fije la cabeza del ratón utilizando un adaptador de ratón (la parte posterior de la cabeza hacia arriba con la nariz apuntada hacia abajo en el ~ 45 °, figura 2A). Fijar barras de oído entre los oídos y los ojos del ratón y apriete. Asegúrese de que la cabeza no se mueva y esté asegurada firmemente en el adaptador presionando suavemente hacia abajo sobre la cabeza del ratón.
4. Vuelva a verificar la respuesta de retirada para dedo pellizco antes de realizar la incisión quirúrgica y regularmente después de eso para asegurar el plano quirúrgico de anestesia. Observe visualmente cualquier cambio en la frecuencia respiratoria durante el proceso de indicar cambios en los planos de la anestesia. Una técnica limpia, aséptica, puede utilizarse para esta cirugía no supervivencia corta. Usando tijeras y pinzas curvas, corte a través de la piel y la primera capa del músculo hasta la base del cráneo está expuesta con sólo una capa delgada de músculo.
   Nota: Corte a través de la piel de ratón en la parte posterior del cuello y luego se corta la piel a la mitad del cráneo entre las orejas y los ojos del ratón. Piel y el tejido pueden entonces tirar aparte y fuera de la zona sobre la cisterna magna.
5. Mientras que la observación mediante el microscopio de disección, diseccionar cuidadosamente lejos el último delgadas capas de músculo sobre la base del cráneo con unas pinzas y mover estas capas de músculo en el lado y fuera del área de interés. Si hay sangrado, utilizar bastoncillos de algodón para eliminar y ayudar a detener el sangrado.
6. Una vez que se expone la dura sobre la cisterna magna (forma triangular con 1-2 vasos sanguíneos recorren la zona; ambos lados o entre los vasos sanguíneos son ser óptimo para la inserción capilar y recolección de LCR, figura 2B), utilizar un mojado bastoncillo de algodón para limpiar la membrana y luego use un bastoncillo de algodón seco para secar el área.

Figura 2. Configuración del ratón y la disección con imágenes representativas de la inserción capilar para recolección de LCR. Configuración del ratón listo para la extracción de la CSF con (A) afeitó la cabeza sujetada en su lugar para disección y (B) una detallada imagen (vista de 10 x) de una dura ratón disecado que la cisterna magna (Flecha discontinua muestra un vaso sanguíneo por la zona y Flecha sólida muestra área óptima para la inserción capilar). Imágenes detalladas (vista de 10 x) de (C) afilan la punta del capilar de vidrio contra la dura de la cisterna magna, (D) el punto en el cual el capilar pinchazos casi dura, con alguna resistencia de dura y (E) la punta capilar aprovechada a través de la duramadre para recoger CSF. CSF debe ser un líquido claro en el capilar de vidrio (flecha punteada). Todas las barras de escala en la parte inferior derecha de cada imagen de microscopio indican 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. CSF colección de ratón anestesiado

1. Alinee el tubo capilar de vidrio en la parte posterior de la cabeza de ratón para que el afilado es justo detrás de la membrana en un ~ ángulo de 30-45 ° (figura 2).
2. Sumir la jeringa una vez o unas cuantas veces y elaborar la jeringa ~ 100-200 μl (para asegurarse de que no son contaminantes y hay presión negativa en el vaso capilar).
3. Mediante el micromanipulador, mueva el tubo capilar punta cerca de la membrana hasta que la resistencia puede verse, pero lo (Figura 2D) pinchar no.
4. Una vez que la resistencia se ve entre la extremidad del tubo capilar y la membrana, golpee suavemente el tubo capilar a través de la membrana por la anulación de los controles de instrumental quirúrgico. Usar el microscopio para ver el punto afilado de la punción capilar en la cisterna magna. CSF automáticamente debe ser dibujada en el tubo capilar una vez que la apertura ha sido perforada (Figura 2E).
5. Dejar el tubo capilar para recoger lentamente la CSF. Si el CSF ha dejado sacar, extraer lentamente la jeringa una pequeña cantidad (~ 50 μL) para crear presión más negativa en el capilar para extraer al CSF.
   Nota: Como alternativa, el capilar se puede suavemente y poco a poco sacar del cerebro usando los controles del micromanipulador fina para permitir que la CSF fluya dentro del tubo capilar nuevo. Un total de ~ 10-15 μl de la CFS (~ 3-4 cm en el tubo capilar) toma ~ 10-30 min y de vez en cuando 20 μl o más pueden ser recogidos. Aunque no es absolutamente necesario, se recomienda utilizar una almohadilla de calor durante la recolección de LCR. Recolección de LCR se realizó a temperatura ambiente (~ 23 ° C).
6. Una vez se recoge la cantidad de LCR deseado, cierre el tubo desplazando la válvula de tres vías para cerrar (para dejar de dibujar hacia fuera el líquido cefalorraquídeo).
7. Sacar la jeringa conectada a la tubería y abra y cierre el tubo (para crear presión ecualizada en el tubo capilar, tubo y la zona exterior del tubo capilar). Vuelva a conectar la jeringa con la válvula de tres vías, pero no sumergir la jeringa.
8. Suavemente Retire el capilar de vidrio el ratón utilizando el instrumental quirúrgico.
9. Coloque el tubo de colección (microtubos de 1.5 mL con 1 μl de 20 x inhibidor de la proteasa) bajo el punto de afilado del vaso capilar.
10. Abra el tubo y sumergirse suavemente la jeringa: el CSF debe fluir fuera del tubo capilar y en el tubo de la colección.
11. Después de la recolección, centrifugar rápidamente (pulso centrifugado durante 5 s a máxima velocidad utilizando una centrífuga mini) el LCR para mezclar la muestra con el inhibidor de la proteasa en la parte inferior del tubo de colección.
    Nota: Las muestras CSF pueden ser alícuotas y almacena para su posterior análisis a-80 ° C. El resto del ratón puede ser disecado para otros tejidos, como cerebro y médula espinal. El ratón está todavía vivo en esta etapa y así puede también ser extraído sangre, si es necesario.

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Resultados

Utilizando el procedimiento descrito aquí (figura 1 y figura 2), el CSF recogido inmediatamente en el tubo capilar debe ser claro (Figura 2E), no color de rosa o rojo. Si hay un color de rosa a la tonalidad rojiza al líquido en el capilar, luego hubo contaminación con sangre.

Como un ejemplo de la aplicación de la muestra de LCR obtenid...

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Discusión

Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora las actuales métodos¹⁰ de recolección de LCR para minimizar la contaminación de la sangre y permitir la abundante colección de LCR (promedio ~ 10-15 μl pueden obtenerse) de ratones. Al romper la punta del capilar, la punta del tubo capilar no debe ser demasiado pequeña (como el LCR se extraerán muy lentamente) o demasiado grandes (no ser fina suficiente para recoger el LCR y tejido puede alojarse en el capilar). Debe tenerse cui...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic)	Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.	30037517	CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors	66 vision technology	54002
Dissecting curved forceps	66 vision technology	53072
Dissecting straight forceps	66 vision technology	53070
Mouse adapter (with ear bars)	Made in-house.	N/A	Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope	Meiji Labax	Model 15381
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Magnetic base for micromanipulator	Kanetec	MB-K
Glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-1000
Syringes (1ml)	Tansoole	02024692	For 1ml.
Microtubes (1.5ml)	Axygen	MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free	Calbiochem	539134
Human Aβ42 ELISA kit	Invitrogen	KHB3441
Piping (teflon tubing)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Cotton buds	Obtained from any household store/pharmacy.	N/A