שיטה משופרת עבור אוסף של נוזל של עכברים מורדם

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטת משופרת עבור אוסף עשיר של נוזל מוחי שדרתי (CSF) עם שום זיהום מדם. עם אוסף מדגם גדול יותר, טוהר, ניתוחים נוספים ניתן לבצע באמצעות נוזל מוחי-שדרתי כדי לקדם את ההבנה שלנו של מחלות המשפיעות על המוח ואת חוט השדרה.

Abstract

נוזל מוחי שדרתי (CSF) הוא נוזל גוף יקר עבור ניתוח מחקר מדעי המוח. הוא נחשב לאחד הנוזלים במגע קרוב עם מערכת העצבים המרכזית, לפיכך, יכול לשמש כדי לנתח את מצב חולה במוח או בחוט השדרה ללא גישה ישירה רקמות אלו. עם זאת, בעכברים שקשה לי לקבל מגנה cisterna בשל הקרבה שלו לכלי הדם, אשר לזהם לעיתים קרובות דגימות. האזור לאוסף CSF בעכברים גם קשה לנתח כדי, דוגמיות קטנות לעיתים קרובות בלבד מתקבלים (מרבי של 5-7 µL או פחות). פרוטוקול זה מתאר בפירוט טכניקה שיפור שיטות הנוכחי של איסוף כדי לצמצם זיהום מדם ולאפשר עבור אוסף עשיר של CSF (בממוצע שניתן לאסוף 10-15 µL). ניתן להשתמש בטכניקה זו עם שיטות אחרות לנתיחה לאיסוף רקמות של עכברים, כפי שזה לא משפיע כל רקמות במהלך שאיבת נוזל מוחי-שדרתי. לפיכך, המוח וחוט השדרה אינם מושפעים בטכניקה זו, נותרו ללא פגע. עם אוסף גדול של מדגם CSF, טוהר, ניתוחים יותר ניתן להשתמש עם מחקר מדעי המוח זה סיוע נוזלים נוספת, להבין טוב יותר מחלות התוקפות את המוח ואת חוט השדרה.

Introduction

CSF הוא נוזל גוף יקר עבור ניתוח מחקר מדעי המוח. CSF בעיקר זני פלזמה, המכיל מספר תאים (לא תאי דם אדומים, רק מספר כדוריות הדם), כמעט ללא חלבון. זה אחד הנוזלים קשר הדוק עם מערכת העצבים המרכזית (CNS), זה יכול להתעלף אלקטרוליטים רבים מן המוח וחוט השדרה במערכת ההיקפית. בבני אדם, שדרתי אפשר לאסוף כדי לסייע באבחון המחלה או למטרות מחקר בניסויים קליניים, בדיקת נוזל עמוד השדרה (או ניקור מותני) היא הליך מינורי, פולשני: נוזל CSF יכול לשקף שינויי מערכת העצבים ללא צורך לגשת ישירות אל אלה רקמות. לכן, בשנים האחרונות, למטרות מחקר במרפאה, הושגו שדרתי מחולים של מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, אחרים^2,1,dementias³. ישנם מבחני סמן רבים אשר פותחו באמצעות דגימות נוזל מוחי-שדרתי פוטנציאל לסייע באבחון מחלות של המרפאה^2,3. עם זאת, יש לויכוחים על האמינות של מבחני אלה כדי להפיק תוצאות עקביות, רגיש במיוחד לאבחון המחלה^4,5. . כך, שאין צורך גדול להתפתחותם של מבחני טוב יותר של מטרות, אשר ניתן למצוא ב- CSF, כדי לסייע בהפקת טכניקה סטנדרטית כדי לאבחן מחלות ניווניות עם יותר רגישות וספציפיות. בשל חשיבות פוטנציאל אנושי המוחי-שדרתי במחלה, האוסף של CSF מן מכרסמים חקר המוח הוא גם עניין.

עכברים הם חיות חשוב במחקר ביולוגי ורפואי ולאפשר לבדיקה של תרכובות טיפולית פוטנציאל ולימודי הוכחה הרעיון לפני ניסויים קליניים בבני. עם זאת, בעכברים קשה להשיג דגימות נוזל מוחי-שדרתי עקב שלה קרבה אל המוח של חיים קטן, כפי השיטה הרגילה של CSF אוסף בעכברים היא כדי להשיג את זה דרך המלון cisterna, פתח בין המוח לבין המשטח הגבי של המוח המוארך. זה גורם קושי באיסוף דגימות נוזל מוחי-שדרתי ככל שהאזור הזה קשה לנתח כדי, בקרבה לכלי הדם, מעלה את הסיכון של זיהום מתאי הדם. בשל קשיים אלה, רוב החוקרים ניתן להשיג רק כמות קטנה של נוזל מוחי-שדרתי לניתוח (בדרך כלל מסר µL 5-7), הזיהום של שדרתי על ידי כדוריות הדם היא הדאגה העיקרית עבור ניתוחים-^6,-^7,-^{8 , 9}. זיהום דם יכול להסתיר תוצאות, לא שיקפו את המצב של מערכת העצבים. יתר על כן, מוגבלת דגימה שנאספו יכולים להשפיע מחקר כפי שנאסף עכברים. הכמות הרגילה מספיקה לכל מדידה אחת בלבד (בכפול או משולש) שימוש assay מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה). לפיכך, שדרתי הם בדרך כלל איחדו של עכברים מרובים כדי שיהיה מספיק הדגימה כדי להריץ מבחני מרובים. פיתוח פרוטוקול להצפנה שופע, נערבב מהאוסף של CSF עכברים הוא נכסף, יהיה מועיל לשיפור חקר המוח באמצעות מכרסמים.

ב פרוטוקול זה, טכניקה עבור שפע (ממוצע של 10-15 µL) מהאוסף של CSF עכברים ומורדמת מתואר בפירוט ומשפר על שיטה הידועות כרגע של CSF אוסף כדי לצמצם זיהום דם¹⁰. פרוטוקול חזקים לאוסף CSF יסייעו בפיתוח של מבחני סמן מבוסס-CSF, אשר יכול לשמש כדי לסייע באבחון המחלה, כמו גם לשפר את המחקר לתוך המנגנונים העומדים בבסיס מחלות התוקפות את מערכת העצבים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בוצעו בהתאם למדיניות החברה מדעי המוח (ארה ב), ועדות אתיות אוניברסיטת פודאן (שנגחאי, סין). ההליך זה ניתוח ההישרדות.

1. כיוונון של CSF אוסף מכשיר

1. משוך את הזכוכית נימי (הקוטר הפנימי 0.75 מ מ, הקוטר החיצוני 1.0 מ מ) באמצעות של פולר micropipette (כפי שמוצג ליו. et al. ¹⁰; נימי מחודדים מוצג באיור1).
2. המקום נימי לתוך בעל נימי זכוכית מחודדים בחוזקה רכוב על micromanipulator (איור 1 א').
3. שבור את הקצה של נימי מחודדים עם מלקחיים ישר תחת מיקרוסקופ ויבתר, כך הקוטר הפנימי של קצה שבור על 10-20 מיקרומטר (איור 1C).
4. לצרף הקצה השני של בעל נימי צינורית דקה ומזרק, וחבר את צינורית דקה ואת המזרק עם שסתום-כיוונית.
5. משמרת את השסתום משולשת לפתוח, לצלול את המזרק לשידור המכה של המזרק דרך הצנרת אל הזכוכית נימי כדי לגרש כל מזהמים וליצור הלחץ בצינור נימי.
6. . אני חוזר זה כבר כמה פעמים על ידי והחסרונות חיבור התחברות מחדש את המזרק לשסתום משולשת, ממלאים את המזרק ~ 100-200 µL לפני חיבור מחדש האחרון של המזרק עם השסתום משולשת (איור 1B).
7. העבר את micromanipulator עם נימי הזכוכית בצד כדי למנוע נזק במהלך ניתוח העכבר.

איור 1. מיקרוסקופ, micromanipulator והגדרת נימי. מיקרוסקופ (א) micromanipulator עם נימי מצורף התקנה, כמו גם תמונה מקרוב (B) את המזרק מחובר ושסתומים -כיוונית לפתוח (המוצג כאן) או לסגור את צנרת, ו- (ג) רצופה (מימין) שבור (שמאל) צינור קפילר עצה מוכן לאיסוף CSF. לאחר שבר, הקצה של נים צריכה של הקוטר הפנימי של 0.75 מ מ, הקוטר החיצוני של 1.0 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

2. העכבר לנתיחה

1. עזים ומתנגד העכבר.
   הערה: עבור זה פרוטוקול, C57BL/6 ועמילואיד קודמן החלבון/presenilin 1 (APP/PS1) הטרנסגניים עכברים (מחלת אלצהיימר העכבר מודל) היו בשימוש, מרדימים עם 4% כלורין (ב- dH₂0) ב 10 µL גרם של משקל העכבר באמצעות בקרום הבטן זריקה.
2. כשהוא מורדם לחלוטין, ודא כי העכבר. הוא מורדם במידה מספקת. התגובה נסיגה שאורך צביטה, על ידי מעט הארכת הגפיים האחוריות, צובט את הבהונות ולצפות לתגובה גמילה, מבוצע כדי להבטיח הרדמה נאותה. בדוק על-ידי צובט כל ארבעת הגפיים; אם אין תגובה העכבר הוא מורדם כראוי. לחתוך ו לקצץ את השיער בעורף של העכבר מעל העיניים, בין האוזניים לחלק התחתון של הצוואר באמצעות מספריים ויבתר (איור 2 א). לחלופין, קוצץ או קרם depilatory יכול לשמש כדי לסייע בהסרת שיער.
3. לאבטח את הראש של העכבר באמצעות מתאם העכבר (מאחורי הראש כלפי מעלה עם האף מכוון למטה ~ 45 °, איור 2A). לסדר את האוזן ברים בין האוזניים לבין העיניים של העכבר והדק. ודא הראש לא יכול להזיז מובטח בחוזקה המתאם באמצעות בעדינות דוחף למטה אל ראשו של העכבר.
4. בדיקה חוזרת של נסיגה בתגובה טו קמצוץ לפני ביצוע הניתוח החתך באופן קבוע לאחר מכן כדי להבטיח המטוס כירורגי של הרדמה. מבחינה ויזואלית הערה כל שינוי קצב נשימה במהלך ההליך כדי לציין שינויים במישורים של הרדמה. טכניקה נקי, שאינו aseptic, יכול לשמש לניתוח ההישרדות קצר זה. באמצעות מספריים ומלקחיים מעוקל, לחתוך את העור ואת השכבה הראשונה של שריר עד לבסיס הגולגולת נחשפת רק שכבה דקה של השריר.
   הערה: לחתוך העור העכבר לרוחב החלק האחורי של הצוואר, ואז לחתוך את העור למטה באמצע הגולגולת בין האוזניים לבין העיניים של העכבר. העור ורקמות ואז ניתן למשוך בנפרד, אל מחוץ לאזור מעל מגנה cisterna.
5. בזמן צפייה מבעד למיקרוסקופ ויבתר, בזהירות לנתח משם האחרון דק שכבות של שרירים על הבסיס של הגולגולת באמצעות מלקחיים ולהעביר שכבות אלה של שריר בצד, אל מחוץ לאזור עניין. אם יש דימום, להשתמש צמר גפן כדי להסיר לעזור לעצור את הדימום.
6. לאחר השכבה הקשה של המוח על המלון cisterna חשוף (משולשת עם בדרך כלל 1-2 כלי דם גדולים רץ דרך האזור; משני הצדדים של או בין כלי הדם היא אופטימלית עבור הכניסה נימי ואוסף CSF, איור 2B), להשתמש רטוב ניצן כותנה תנקה את הקרום ולאחר מכן להשתמש במקלון צמר גפן יבש כדי לייבש את האזור.

באיור 2. ההתקנה דיסקציה של עכבר להחליפן בתמונות של נימי הכניסה לאוסף נוזל מוחי-שדרתי. כיוונון של העכבר מוכן לחילוץ CSF עם (A) גילחת את הראש כשכרטיס במקום לקבלת ניתוח ו- (B) מפורט (תצוגת x 10) דימוי דורא העכבר ביתור המכסים את מגנה cisterna (חץ מקווקו מציגה כלי דם העובר באזור, חץ מוצק מראה אזור אופטימלי נימי ההכנסה). תמונות מפורט (10 x תצוגה) של (C) להשחיז קצה זכוכית נימי מיושר נגד דורא של cisterna מגנה, (D) הנקודה שבה נימי כמעט פנצ'רים השכבה הקשה של המוח, בהתנגדות כלשהי של דורא, ו- (E) הטיפ נימי טפח דרך השכבה הקשה של המוח כדי לאסוף CSF. CSF צריך להיות נוזל צלול שליקט את הזכוכית של נימי (חץ מנוקד). כל קווי סרגל בחלק התחתון של כל תמונת מיקרוסקופ מציינים 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

3. CSF מהאוסף העכבר מורדם

1. יישר את נימי זכוכית לחלק האחורי של הראש העכבר כך נקודת מחודדים הוא ממש מאחורי הקרום ב ~ 30-45 ° זווית (איור 2C).
2. לצלול את המזרק פעם או כמה פעמים וצייר את המזרק ~ µL 100-200 (כדי לוודא יש חומציות, ויש לחץ שלילי בכוס נימי).
3. באמצעות את micromanipulator, להזיז את נימי עצה להתקרב הקרום עד שניתן לראות התנגדות, אך לא ניקב זה (איור דו-ממדי).
4. לאחר התנגדות הוא ראה בין קצה נים הקרום, טפח בעדינות את צינור קפילרי דרך הקרום על ידי דפיקות על הפקדים micromanipulator. השתמש במיקרוסקופ כדי לראות את נקודת מחודדים של נימי הניקוב לתוך המלון cisterna. CSF צריך באופן אוטומטי להיגרר את צינור קפילרי ברגע הפתיחה היה ניקבה (2E איור).
5. להשאיר את נימי לאסוף לאט CSF. אם CSF הפסיק ב"משיכת, לצייר את המזרק את כמות קטנה לאט (~ 50 µL) כדי ליצור לחץ שלילי יותר נימי להוציא החוצה נוזל מוחי-שדרתי.
   הערה: לחלופין, נימי יכול להיות ובאיטיות הוציא המוח באמצעות הפקדים micromanipulator בסדר כדי לאפשר CSF לזרום לתוך נימי שוב. סכום כולל של ~ 10-15 µL של CSF (~ 3-4 ס מ נים) לוקח ~ 10-30 דקות, מדי פעם 20 µL או יותר ניתן לאסוף. אמנם לא הכרחי, מומלץ להשתמש משטח חום במהלך האיסוף CSF. אוסף CSF בוצעה בטמפרטורת החדר (~ 23 ° C).
6. פעם אחת כמות נוזל מוחי-שדרתי הרצוי נאסף, לסגור הצנרת על ידי הסטה השסתום משולשת לסגור (כדי להפסיק לצייר החוצה את CSF).
7. להוציא את המזרק מחובר הצנרת, ו פתיחה ולאחר מכן סגירה הצנרת (כדי ליצור לחץ אוזן את נימי, אבובים, ובאזור בחוץ נימי). חבר מחדש את המזרק עם השסתום משולשת, אך לא לצלול את המזרק.
8. הסר בעדינות את נימי זכוכית העכבר באמצעות את micromanipulator.
9. למקם את הצינור אוסף (1.5 מ ל microtubes עם µL 1 של 20 x מעכב פרוטאז) תחת הנקודה מחודדים של הזכוכית נימי.
10. לפתוח את הצנרת, מזנקת בעדינות את המזרק: CSF צריך לזרום מתוך את נימי, לתוך הצינור אוסף.
11. לאחר אוסף, במהירות צנטריפוגה (דופק ספין בשביל 5 s במהירות מירבית באמצעות צנטריפוגה מיני) נוזל מוחי-שדרתי לערבב את הדגימה עם מעכבי פרוטאז בתחתית הצינורית אוסף.
    הערה: שדרתי יכולה להיות aliquoted, ולאחר מכן מאוחסנים לצורך ניתוח נוסף ב-80 מעלות צלזיוס. בשאר העכבר יכול ניסויים בשביל לרקמות אחרות, כגון המוח ואת חוט השדרה. העכבר עדיין בחיים בשלב זה, ולכן הדם יכולה גם להיות שנאספו, במידת הצורך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

שימוש בהליך שתואר כאן (איור 1 ואיור 2), נוזל מוחי-שדרתי מיד שליקט את נימי צריך להיות נקי (איור 2E), לא ורוד או אדום. אם יש ורוד כדי גוון אדום שליקט את נימי הנוזל, ואז היה זיהום בדם.

כמו לדוגמה של הי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר בפירוט טכניקה אשר משפר את שיטות הנוכחי¹⁰ של CSF אוסף לצמצם זיהום מדם ולאפשר האוסף בשפע של CSF (בממוצע ~ 10-15 µL ניתן להשיג) של עכברים. כאשר אתה מפר את הטיפ נימי, קצה נים לא צריך להיות קטן מדי (כמו שהיית CSF יחולצו לאט מאוד) או גדול מדי (וויל לא יהיה מספיק כדי לאסוף את נוזל מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic)	Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.	30037517	CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors	66 vision technology	54002
Dissecting curved forceps	66 vision technology	53072
Dissecting straight forceps	66 vision technology	53070
Mouse adapter (with ear bars)	Made in-house.	N/A	Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope	Meiji Labax	Model 15381
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Magnetic base for micromanipulator	Kanetec	MB-K
Glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-1000
Syringes (1ml)	Tansoole	02024692	For 1ml.
Microtubes (1.5ml)	Axygen	MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free	Calbiochem	539134
Human Aβ42 ELISA kit	Invitrogen	KHB3441
Piping (teflon tubing)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Cotton buds	Obtained from any household store/pharmacy.	N/A