마 취 쥐에서 척수의 컬렉션에 대 한 개선된 방법

요약

이 프로토콜에는 혈액에서 오염 없이와 뇌 척추 액체 (CSF)의 풍부한 컬렉션에 대 한 향상 된 기술을 설명합니다. 큰 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석 두뇌 및 척수에 영향을 질병의 우리의 이해를 추가 CSF를 사용 하 여 수행할 수 있습니다.

초록

뇌 척추 액체 (CSF) 분석 신경 과학 연구에 대 한 귀중 한 체액 이다. 그것은 중앙 신 경계와 가까운 접촉에서 체액 중 하나입니다 하 고 따라서,이 조직에 직접 액세스 하지 않고 뇌 또는 척수의 병 상태를 분석에 사용할 수 있습니다. 그러나, 쥐 혈관의 친밀감 때문 시스테 마그나에서 얻기 어렵다,이 종종 샘플 오염. 마우스에 CSF 컬렉션에 대 한 지역에 해 부도 어렵습니다 그리고 종종 작은 샘플 (5-7 µ L의 최대 또는 더 적은) 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 자세하게에서 혈액 오염 최소화 (평균 10-15 µ L를 수집할 수 있습니다)에 CSF의 풍부한 컬렉션에 대 한 허용 하는 컬렉션의 현재 방법에 향상 하는 기술을 설명 합니다. 이 기술은 그것 CSF 추출 하는 동안 모든 조직에 영향을 하지 않습니다 마우스에서 조직 컬렉션에 대 한 다른 해 부 방법으로 사용할 수 있습니다. 따라서, 뇌와 척수가이 기법으로 영향을 받지 않습니다 하 고 그대로 유지. 큰 CSF 샘플 수집 및 순수성, 더 많은 분석이 더 액체 보조 신경 과학 연구에 사용할 수와 더 나은 두뇌 및 척수에 영향을 미치는 질병을 이해.

서문

CSF 분석 신경 과학 연구에 대 한 귀중 한 체액 이다. CSF는 주로, (아니 붉은 혈액 세포와만 몇 백혈구) 몇 셀을 포함 하 고는 거의 단백질-무료. 그것 하나는 체액의 중앙 신경 시스템 (CNS)와 가까이 접촉에서 이며 전달할 수 많은 전해질 밖으로 두뇌 및 척수 주변 시스템을. 인간에서는, CSF 샘플 수집 질병 진단에 도움이 될 수 있습니다 또는 임상 시험에서 연구 목적, 척추 수돗물 (또는 요 추 찔린)으로 사소한, 침략 적 절차: CSF 액체가에 직접 액세스 하지 않고 CNS에 변화를 반영할 수 있다 조직입니다. 따라서, 병원, 연구 목적을 위해 최근 몇 년 동안에서 CSF 샘플 Alzheimer의 질병, 다른 치 매^1,2,3같은 신경 퇴행 성 질환의 환자에서 얻이 되었습니다. 많은 잠재적으로 클리닉^2,3에서 질병 진단에 도움이 CSF 샘플을 사용 하 여 개발 된 바이오 마커 분석 실험을 확인 하 고 있습니다. 그러나, 구체적으로 진단 질병^4,5일관성, 민감한 결과를 이러한 분석의 신뢰성에 많은 논쟁이 있다. 그래서, 큰 감도와 특이성 신경 퇴행 성 질환을 진단 하는 표준 기술을 생산에 도움이 더 나은 분석 및 목표, CSF에서 찾을 수 있습니다, 개발에 대 한 중대 한 필요가 있다. 질병에서 인간 CSF 샘플의 잠재적인 중요성 때문 신경 과학 연구에 설치류에서 CSF의 컬렉션의 관심 이기도합니다.

마우스 생물학과 의학 연구에 중요 한 동물 고 잠재적 치료 화합물 및 인간 임상 시험 전에 개념 증명 연구의 테스트에 대 한 허용 한다. 그러나, 쥐에서 어렵습니다 작은 동물, 뇌의 친밀감 때문에 CSF 샘플을 얻기 위해 생쥐에서 CSF 컬렉션의 일반적인 방법은 시스테 마그나, 소 뇌 수 질 oblongata의 등 쪽 표면 사이 개통을 통해 그것을 얻을 하는 것입니다. 어려움으로이 지역에 해 부 어렵다 CSF 샘플을 수집 하 고 혈관, 혈액 세포에서 오염의 위험이 증가에 가까운 근접에서 발생 합니다. 이러한 어려움 때문에 대부분 연구자만 분석 (일반적으로 5-7 µ L로 명시 된)에 대 한 CSF의 작은 금액을 가져올 수 있습니다 및 혈액 세포에 의해 CSF 견본의 오염 분석^6,,78 에 대 한 주요 관심사는 ^{, 9}. 혈액 오염 결과 보이지 않게 수 고 하지 진정으로 CNS의 상태를 반영. 쥐에서 수집 된 일반적인 금액으로 충분 한 측정 (또는 3 중) 제한 된 샘플 수집 연구를 충격 하는 또한, 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA)을 사용 하 여. 따라서, CSF 샘플 충분 한 샘플을 여러 분석 실험을 실행 하기 위해 여러 마우스에서 일반적으로 풀링됩니다. 풍부한에 대 한 프로토콜을 개발, 쥐에서 CSF의 오염의 컬렉션은 크게 원하는 하 고 설치류를 사용 하 여 신경 과학 연구를 개선에 도움이 될 것입니다.

이 프로토콜, 풍부한 기술 (평균 10-15 µ L) 마 취 쥐에서 CSF의 컬렉션 자세히 설명 하 고 피¹⁰에서 오염을 최소화 하기 위해 CSF 컬렉션의 현재 알려진된 방법에 향상. CSF 컬렉션에 대 한 강력한 프로토콜 CSF 기반 바이오 마커 분석, 질병 진단에 도움이 CNS에 영향을 미치는 질병의 기반이 되는 메커니즘을 연구 개선 하는 데 사용 수의 개발에 도움이 됩니다.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

프로토콜

모든 동물 실험 신경 과학 (미국), 복 단 대학 (상하이, 중국) 윤리 위원회에 대 한 협회의 정책에 따라 수행 했다. 이 절차는 비 생존 수술입니다.

1입니다. CSF 컬렉션 장치 설치

1. 유리 모 세관 당겨 (내경 0.75 m m, 외부 직경 1.0 m m) 같이 사용 하는 micropipette 끌어당기는 사람 (리 우 외. ¹⁰; 날카롭게 모 세관에에서 표시 됩니다 그림 1).
2. 장소는 날카롭게 유리 모 세관 홀더 micromanipulator (그림 1A)에 단단히 장착으로 모 세관.
3. 그 깨진된 팁의 내부 직경에 대 한 날카롭게 모 세관의 끝 해 현미경 직선 겸 휴식 10-20 µ m (그림 1C).
4. 모 세관 소유자의 다른 쪽 끝을 얇은 튜브와 주사기를 첨부 하 고 얇은 튜브 및 주사기 3 방향 밸브를 연결.
5. 3 방향 밸브를 열고 유리 모 세관 튜브에 긍정적인 압력 만들고 어떤 오염 물질을 추방 하는 모 세관 튜브를 통해 주사기에서 타격 공기를 주사기 플런지 이동 합니다.
6. 반복이 몇 번 표시 연결 다시 3 방향 밸브에 주사기를 연결 하 고 주사기를 그리기 여 ~ 100-200 µ L 주사기 3 방향 밸브 (그림 1B)와 함께 마지막 다시 연결 하기 전에.
7. 유리 모 세관 micromanipulator 마우스 해 부 동안 손상을 방지 하기 위해 측면으로 이동 합니다.

그림 1입니다. 현미경, micromanipulator, 및 모 세관 설치. (A) 현미경과 연결 된 모 세관으로 micromanipulator 설치, (B)의 이미지를 가까이 뿐만 아니라 연결 된 주사기 및 3-방향 밸브를 엽니다 (그림 참조) 하거나 파이핑, 및 (C) 연속적인된 (오른쪽) (왼쪽) 깨진 모 세관 팁 CSF 컬렉션에 대 한 준비입니다. 0.75 m m의 내경, 외경의 1.0 m m. 모 세관의 끝을 해야, 일단 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

2. 마우스 해 부

1. 마우스 anesthetize
   참고:이 프로토콜, C57BL/6 및 아 밀 로이드 선구자 단백질/presenilin 1 (APP/PS1) 유전자 변형에 대 한 마우스 (알츠하이머병 마우스 모델)이 사용 되었고 4 %chloral 하이드 레이트 (dH₂0)에서 복을 통해 마우스 무게 10 µ L/g에와 취 사출입니다.
2. 완전히 마 취 때 마우스 취 적절 하 게 확인 합니다. 약간 뒷 다리 사지를 확장 하 고 발가락을 꼬 집 고 철수 응답에 대 한 보고 꼬집어, 발가락을 철수 응답 적절 한 마 취를 보장 하기 위해 수행 됩니다. 모든 4 개의 사지;를 곤란 하 게 하 여 확인 아무 반응입니다 마우스 제대로 마 취. 고 해 위 (그림 2A)를 사용 하 여 목의 아래쪽에 귀 사이 눈 위에서 마우스의 머리 뒤쪽 머리 손질. 또는, 또는 depilatory 크림 머리 제거에 도움을 사용할 수 있습니다.
3. 마우스 어댑터를 사용 하 여 마우스의 머리를 보호 (에 아래로 지적 코를 가진 위로 머리 향하도록 뒤로 ~ 45 °, 그림 2A). 귀 바 귀와 마우스의 눈 사이 수정 하 고 조입니다. 머리 수 없습니다 이동 하 고 마우스의 머리에 부드럽게 밀어 어댑터에 단단히 확보 되었는지 확인 합니다.
4. 발가락 수술 절 개를 하기 전에 대 타를 철수 응답을 다시 확인 하 고 정기적으로 마 취의 수술 비행기를 그 후. 시각적으로 절차를 마 취의 비행기에 변화를 나타내는 동안 호흡 속도에 변화를 note. 깨끗 하 고 무 균 기술은이 짧은 생존 비 수술에 대 한 사용할 수 있습니다. 두개골의 기지는 근육의 단지 얇은 층으로 노출 될 때까지 피부와 근육의 첫 번째 레이어를 통해 잘라가 위를 사용 하 여 곡선된 겸 자.
   참고: 마우스 피부를 통해 목의 뒷면에 걸쳐 고 귀와 마우스의 눈 사이 두개골의 중간 아래 피부를 잘라. 피부와 조직 수 다음 수 떨어져와 지역에 당겨 시스테 마그나.
5. 보기 해 현미경을 통해 신중 하 게 멀리 해 부 동안 마지막 집게를 사용 하 여 두개골의 기지에 근육의 층을 얇은 하 고 측면을 관심의 영역에서 근육의 이러한 레이어를 이동 합니다. 거기는 출혈 하는 경우 목화 꽃 봉 오리를 사용 하 여 제거 하 고 출혈을 멈추게 하는 데 도움이.
6. 경질 시스테 마그나에 노출 되 면 (삼각형 모양와 일반적으로 1-2 큰 혈관; 영역을 통해 실행 양쪽의 또는 혈관 사이 최적입니다 모 세관 삽입 및 CSF 컬렉션, 그림 2B), 젖은 사용 목화 꽃 봉 오리를 막 닦아 깨끗 하 고 마른 면봉을 사용 하 여 건조 한 지역.

그림 2입니다. CSF 컬렉션에 대 한 모 세관 삽입의 대표 이미지와 함께 마우스 및 해 부 설치. 마우스 (A)와 CSF 추출에 대 한 준비의 설치는 해 부와 (B) 세부 시스테 마그나를 취재 해 부 마우스 경질의 이미지 (10 x 뷰)에 대 한 장소에 고정 머리를 면도 (점선된 화살표 표시는 지역을 통해 실행 하는 혈관 및 단단한 화살표 영역을 표시 모 세관 삽입에 대 한 최적의) 합니다. (C)의 상세한 이미지 (10 x 보기) 날카롭게 시스테 마그나, (D) 포인트는 모 세관 거의 구멍 도청 경질, 및 (E) 모 세관 팁에서 일부 저항 경질의 경질에 대 한 정렬 유리 모 세관의 끝 통해 수집 CSF를 경질. CSF는 투명 한 액체 유리 모 세관 (점선된 화살표)에서 수집 해야 합니다. 각 현미경 이미지의 오른쪽 하단에 모든 규모 막대 표시 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

3. CSF 컬렉션 마 취 마우스에서

1. 날카롭게 포인트에서 막 바로 뒤에 유리 모 세관 마우스 머리의 뒤에 정렬 한 ~ 30-45 ° 각도 (그림 2C).
2. 뛰어내리는 주사기를 한 번 또는 몇 번 하 고 주사기를 세우 ~ 100-200 µ L (되도록 아무 오염 물질 고 거기에 부정적인 압력 유리 모 세관).
3. 모 세관 이동 micromanipulator를 사용 하 여 저항을 볼 수 있는 때까지 막에 가까이 팁 하지만 (그림 2D) 그것을 puncturing 하지.
4. 일단 저항 모 세관의 팁과 막 본은, 부드럽게 노크 micromanipulator 컨트롤에 의해 멤브레인을 통해 모 세관 튜브를 누릅니다. 시스테 마그나에 모 세관 펑크의 날카로운된 포인트를 볼 수 있는 현미경을 사용 합니다. CSF 자동으로 그려야 모 세관 튜브로 일단 개통 구멍 되었습니다 (그림 2E).
5. 천천히 CSF를 수집을 모 세관을 둡니다. CSF 밖으로 그리기 중지 되었습니다, 그린 작은 금액을 주사기 천천히 (~ 50 µ L) CSF를 추출 하는 모 세관에서 더 부정적인 압력을 만들려고.
   참고: 또는, 모 세관 수 부드럽게 그리고 천천히 오게 될 CSF 다시 모 세관으로 흐르는 것을 허용 하도록 잘 micromanipulator 컨트롤을 사용 하는 두뇌. 총 금액 ~ CSF의 10-15 µ L (~ 모 세관에 3-4 cm) 걸립니다 ~ 10-30 분 및 때때로 20 µ L 이상의 수집 될 수 있습니다. 절대적으로 필요 하지 않지만 CSF 수집 중 열 패드를 사용 하는 것이 좋습니다. CSF 컬렉션 실내 온도에서 수행 되었다 (~ 23 ° C).
6. 일단 원하는 CSF의 금액을 수집 (CSF를 끌어 중지) 닫습니다 3 방향 밸브를 이동 하 여 튜브를 닫습니다.
7. 주사기에 튜브에 연결에 밖으로 가십시오 그리고 열고 튜브 (모 세관, 튜브, 그리고 모 세관 외부 영역에서 평준화 압력을 만드는)를 닫습니다. 3-방향 밸브와 주사기를 다시 연결 하지만 주사기를 빠지게 하지 마십시오.
8. 부드럽게는 micromanipulator를 사용 하 여 마우스에서 유리 모 세관을 제거 합니다.
9. 유리의 날카로운된 지점에서 컬렉션 튜브 (protease 억제제 x 20의 1 µ L와 1.5 mL microtubes) 장소 모 세관.
10. 튜브를 열고 부드럽게 주사기 플런지: 모 세관 그리고 컬렉션 튜브에 CSF 흐른다 한다.
11. 수령 후, 신속 하 게 원심 (5 회전 펄스 미니 원심 분리기를 사용 하 여 최대 속도로 s) 컬렉션 튜브의 하단에 프로 테아 제 억제 물 샘플 혼합 CSF.
    참고: CSF 견본 aliquoted 수-80 ° c.에 추가 분석을 위해 저장 하 고 마우스의 나머지는 뇌와 척수와 같은 다른 조직에 대 한 해 부 수 있습니다. 마우스가이 단계에서 아직도 살아 이며 따라서 혈액도 수집 될 수 있습니다, 필요한 경우.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

결과

(그림 1 및 그림 2) 여기에 설명 된 절차를 사용 하 여, 모 세관에 즉시 수집 CSF 클리어 (그림 2E), 분홍색 또는 빨간색 이어야 한다. 액체는 모 세관에서 수집에 붉은 가미에 분홍색 경우 혈액으로 오염이 했다.

CSF 샘플의 응용 프로그램의 예를 들어가이 방법으로...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

토론

이 프로토콜 설명 자세히 혈액 오염 최소화 및 CSF의 풍부한 컬렉션에 대 한 허용 CSF 컬렉션의 현재 방법¹⁰ 에 향상 (평균 ~ 10-15 µ L를 얻을 수 있다) 쥐에서. 모 세관 끝을 깨는, 모 세관의 끝 해서는 안됩니다 (그럼 CSF 추출 됩니다 매우 느리게) 너무 작은 또는 너무 큰 (되지 않습니다 CSF 수집을 충분히 잘 하 고 조직 모 세관에서 제기 될 수 있다). 주의 해야 때 CSF 컬렉션에 대 한 영...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic)	Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.	30037517	CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors	66 vision technology	54002
Dissecting curved forceps	66 vision technology	53072
Dissecting straight forceps	66 vision technology	53070
Mouse adapter (with ear bars)	Made in-house.	N/A	Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope	Meiji Labax	Model 15381
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Magnetic base for micromanipulator	Kanetec	MB-K
Glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-1000
Syringes (1ml)	Tansoole	02024692	For 1ml.
Microtubes (1.5ml)	Axygen	MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free	Calbiochem	539134
Human Aβ42 ELISA kit	Invitrogen	KHB3441
Piping (teflon tubing)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Cotton buds	Obtained from any household store/pharmacy.	N/A