Ein verbessertes Verfahren zur Sammlung von Liquor cerebrospinalis aus narkotisierten Mäuse

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Technik für die reichhaltige Sammlung von zerebrospinale Flüssigkeit (CSF) ohne Kontamination aus Blut. Mit größeren Musterkollektion und Reinheit können weitere Analysen mit CSF, um unser Verständnis von Krankheiten zu fördern, die das Gehirn und das Rückenmark betreffen durchgeführt werden.

Zusammenfassung

Der Liquor cerebrospinalis (CSF) ist eine wertvolle Körperflüssigkeit für die Analyse in der neurowissenschaftlichen Forschung. Es ist eines der Flüssigkeiten im engsten Kontakt mit dem zentralen Nervensystem und kann daher verwendet werden, um den kranken Zustand des Gehirns oder des Rückenmarks zu analysieren, ohne direkten Zugriff auf diese Gewebe. Bei Mäusen ist es schwer zu bekommen aus der Cisterna Magna wegen seiner guten Anbindung an den Blutgefäßen, verunreinigen die jedoch oft Proben. Die CSF-Sammlung bei Mäusen ist auch schwerlich zu sezieren und oft nur kleine Proben (maximal 5-7 µL oder weniger) erzielt werden. Dieses Protokoll beschreibt im Detail eine Technik, die über die aktuellen Methoden der Sammlung zu minimieren Kontamination aus Blut und ermöglichen die reichhaltige Sammlung von CSF (im Durchschnitt 10-15 µL gesammelt werden können) verbessert. Diese Technik kann mit anderen Dissektion Methoden für Gewebe-Sammlung von Mäusen, verwendet werden, da es keinem Gewebe während der CSF Extraktion auswirkt. So im Gehirn und Rückenmark sind mit dieser Technik nicht betroffen und bleiben intakt. Mit größeren CSF Musterkollektion und Reinheit weitere Analysen können mit dieser Flüssigkeit weiter Hilfe neurowissenschaftliche Forschung verwendet werden und Krankheiten, die das Gehirn und das Rückenmark besser zu verstehen.

Einleitung

CSF ist eine wertvolle Körperflüssigkeit für die Analyse in der neurowissenschaftlichen Forschung. Die GfK besteht hauptsächlich aus Blutplasma, mit wenigen Zellen (keine roten Blutkörperchen und nur ein paar weiße Blutkörperchen) und ist fast frei von Protein. Es ist eine der Flüssigkeiten in engem Kontakt mit dem zentralen Nervensystem (ZNS) und es kann viele Elektrolyte aus dem Gehirn und Rückenmark an das periphere System übergeben. Beim Menschen, CSF Proben kann erhoben werden, um Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten oder für Forschungszwecke in klinischen Studien als eine Lumbalpunktion (oder Lumbalpunktion) ist eine kleinere, invasive Verfahren: die CSF Flüssigkeit kann Änderungen im ZNS ohne direkt auf diese zugreifen Gewebe. So wurden in den letzten Jahren zu Forschungszwecken in der Klinik, CSF Proben von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit und anderen Demenzerkrankungen^1,2,3gewonnen. Es gibt viele Biomarker-Assays, die entwickelt wurden, mit CSF Proben möglicherweise Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten in der Klinik^2,3. Allerdings gibt es viel Debatte über die Zuverlässigkeit dieser Tests zu konsistenten, sensible Ergebnissen um gezielt diagnostizieren Krankheit^4,5. So, gibt es ein großer Bedarf an der Entwicklung besserer Assays und Ziele, die im Liquor gefunden werden können, um Hilfe bei der Herstellung ein Standardverfahren zur diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen mit größere Sensitivität und Spezifität. Aufgrund der potenziellen Bedeutung des CSF Humanproben bei Krankheit ist die Sammlung von CSF von Nagetieren in der neurowissenschaftlichen Forschung auch von Interesse.

Mäuse sind wichtige Tiere in biologischen und medizinischen Forschung und für die Prüfung von möglichen therapeutischen Verbindungen und Proof-of-Concept-Studien vor der klinischen Studien am Menschen erlauben. Jedoch bei Mäusen ist es schwierig, CSF Proben wegen seiner Nähe zum Gehirn in ein kleines Tier zu erhalten, da die übliche Methode der CSF-Sammlung bei Mäusen ist es über die Cisterna Magna, eine Öffnung zwischen dem Kleinhirn und der dorsalen Oberfläche des der Medulla Oblongata zu erhalten. Dies führt zu Schwierigkeiten in CSF Proben zu sammeln, da dieser Bereich schwierig zu sezieren und in unmittelbarer Nähe für Blutgefäße, erhöht die Gefahr der Kontamination von Blutzellen. Aufgrund dieser Schwierigkeiten die meisten Forscher erhalten nur eine kleine Menge von CSF Analyse (in der Regel als 5-7 µL angegeben) und die Verunreinigung von CSF Proben von Blutkörperchen ist ein Hauptanliegen für Analysen^{6,7,8 , 9}. Blut Verunreinigungen kann Ergebnisse zu verschleiern und nicht wirklich spiegeln den Stand des ZNS. Darüber hinaus kann begrenzt Probe Forschung auswirken, da die üblichen Menge gesammelt von Mäusen nur einer Messung (in doppelt oder dreifach) reicht mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA). CSF Proben sind somit in der Regel aus mehreren Mäusen gebündelt, um genügend Blut mehrere Tests ausgeführt haben. Entwicklung eines Protokolls für die reichlich, unberührten Sammlung von CSF von Mäusen ist sehr erwünscht und werden bei der Verbesserung der neurowissenschaftlichen Forschung mit Nagetieren vorteilhaft.

In diesem Protokoll, eine Technik für die reichlich (durchschnittlich 10-15 µL) Sammlung von CSF von narkotisierten Mäuse wird ausführlich beschrieben und verbessert auf eine derzeit bekannte Methode der CSF Sammlung, Kontamination von Blut¹⁰zu minimieren. Ein robustes Protokoll für CSF Sammlung hilft bei der Entwicklung von CSF-basierte Biomarker Assays, die verwendet werden könnte, um Hilfe bei der Diagnose von Krankheiten sowie die Verbesserung der Forschung über die Mechanismen, die Erkrankungen des ZNS zugrunde liegen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien der Gesellschaft für Neurowissenschaften (USA) und der Fudan-Universität (Shanghai, China) ethischen Komitees durchgeführt. Dieses Verfahren ist für eine Operation nicht überleben.

1. Aufbau des CSF Sammlung Apparat

1. Ziehen Sie das Glas Kapillare (Innendurchmesser 0,75 mm, Außendurchmesser 1,0 mm) mit einer Mikropipette Abzieher (wie in Liu Et Al. gezeigt ¹⁰; geschärfte Kapillare ist in Abbildung 1dargestellt).
2. Statt einem geschärften Glas Kapillaren in die Kapillare Halterung fest montiert auf einem Mikromanipulator (Abbildung 1A).
3. Die Spitze der geschärften Kapillare mit geraden Zange unter dem sezierenden Mikroskop zu brechen, so dass der innere Durchmesser der gebrochenen Spitze geht 10-20 µm (Abbildung 1).
4. Das andere Ende der Kapillare Inhaber beimessen Sie einen dünnen Schlauch und eine Spritze, und schließen Sie den dünnen Schlauch und Spritze mit einem drei-Wege-Ventil.
5. Verschieben Sie das Dreiwege Ventil öffnen und stürzen die Spritze Luft aus der Spritze durch den Schlauch ins Glas Kapillare Verunreinigungen zu vertreiben und Überdruck in der Kapillare erstellen.
6. Wiederholen Sie dies einige Male von Dis-Anschluss wieder anschließen die Spritze an der drei-Wege-Ventil und die Spritze Ausarbeitung ~ 100-200 µL vor der letzten Wiederanschluss der Spritze mit dem drei-Wege-Ventil (Abb. 1 b).
7. Bewegen Sie der Mikromanipulator mit dem Glas Kapillare zur Seite beugen Schäden während der Maus Dissektion.

Abbildung 1: Mikroskop, Mikromanipulator und Kapillare Setup. (A) Mikroskop und Mikromanipulator mit Kapillare befestigt setup, sowie eine engere Bild (B) der angeschlossenen Spritze und drei-Wege-Ventil öffnen (hier gezeigt) oder schließen Sie die Leitungen und (C) eine ungebrochene (rechts) und gebrochen (links) Kapillare Spitze CSF abholbereit. Einmal gebrochen, die Spitze der Kapillare müssen einen inneren Durchmesser von 0,75 mm, Außendurchmesser von 1,0 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(2) Maus Dissektion

1. Die Maus zu betäuben.
   Hinweis: für dieses Protokoll, C57BL/6 und Amyloid Precursor Protein/Presenilin 1 (APP/PS1) transgenen Mäusen (Alzheimer-Krankheit-Maus-Modell) verwendet wurden und mit 4 % Chloral Hydrate (in dH₂0) 10 µL/g Maus Gewicht über intraperitoneale betäubt Injektion.
2. Wenn vollständig betäubt, sicherzustellen Sie, dass die Maus ausreichend betäubt ist. Der Rückzug auf Prise, Zehen leicht erweitern die Hinterbeine und kneifen die Zehen und gerade für einen Rückzug Reaktion wird durchgeführt, um ausreichende Anästhesie zu versichern. Überprüfen Sie durch Kneifen alle vier Gliedmaßen; die Maus ist richtig betäubt, wenn es keine Reaktion. Schneiden Sie und trimmen Sie die Haare am Hinterkopf der Maus über den Augen, zwischen den Ohren an der Unterseite des Halses mit einer Schere sezierenden (Abbildung 2A). Alternativ kann Klipper oder Enthaarungscreme verwendet werden, um Haarentfernung zu unterstützen.
3. Sichern Sie den Kopf der Maus mit einem Maus-Adapter (Rückseite der Kopf nach oben mit der Nase spitz nach unten bei ~ 45 °, Abb. 2A). Ohr-Balken zwischen die Ohren und Augen der Maus befestigen und festziehen. Stellen Sie sicher, dass der Kopf nicht bewegen und sicherte sich fest in den Adapter durch leichten Druck nach unten auf den Kopf der Maus.
4. Erneut Rücktritt Reaktion Prise vor chirurgischen Einschnitt bis Fuß und regelmäßig danach zu chirurgischen Flugzeug der Narkose zu gewährleisten. Visuell beachten Sie jede Änderung der Atemfrequenz während des Verfahrens um Änderungen in Flugzeugen der Anästhesie zeigen. Eine saubere, nicht-aseptische Technik einsetzbar für diese kurzen Operation nicht überleben. Mit Schere und gebogene Pinzetten, schneiden durch die Haut und die erste Schicht des Muskels, bis der Schädelbasis mit nur eine dünne Schicht des Muskels ausgesetzt ist.
   Hinweis: Durch die Maus Haut quer durch die Rückseite des Halses und dann schneiden Sie die Haut in der Mitte des Schädels zwischen den Ohren und Augen der Maus. Haut und Gewebe können auseinander und aus dem Bereich über der Cisterna Magna gezogen werden.
5. Während Betrachtung durch die sezierenden Mikroskop sezieren sorgfältig entfernt die letzte dünne Schichten des Muskels über die Schädelbasis mit Pinzette und bewegen diese Schichten der Muskulatur, zur Seite und aus dem Bereich von Interesse. Wenn es blutet, verwenden Wattestäbchen zu entfernen und helfen, die Blutung zu stoppen.
6. Sobald die Dura über die Cisterna Magna ausgesetzt ist (dreieckige Form mit in der Regel 1-2 große Blutgefäße durchzieht das Gebiet; beiderseits der oder zwischen den Blutgefäßen ist optimal für die Kapillare einsetzen und CSF Sammlung, Abb. 2 b), verwenden Sie einen nassen Wattestäbchen abwischen der Membran und dann mit einem trockenen Wattestäbchen Bereich trocknen.

Abbildung 2: Maus und Dissektion Setup mit repräsentativen Bilder der Kapillare Einfügung für CSF Sammlung. Einrichten der Maus bereit für CSF Extraktion mit (A) rasierte Kopf im Ort eingespannt, ausführliche Dissektion und (B) Bild (10 X Ansicht) von einem sezierten Maus Dura für die Cisterna Magna (gestrichelter Pfeil zeigt ein Blutgefäß durch die Gegend laufen und "solide Pfeil zeigt Bereich optimal für Kapillare einfügen). Detaillierte Bilder (10 X Ansicht) (C) geschärft Tipp des Glases Kapillare gegen Dura von Cisterna Magna, (D) der Punkt an dem die Kapillare fast Dura, mit einigem Widerstand von Dura und (E) die Kapillare Spitze tippte Punktionen ausgerichtet durch die Dura, CSF zu sammeln. CSF sollte eine klare Flüssigkeit in das Glas Kapillare (gestrichelte Pfeil) gesammelt werden. Alle Maßstabsleisten unten rechts neben jedem Mikroskopbild zeigen 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

(3) CSF Sammlung von narkotisierten Maus

1. Die Glas-Kapillare an der Rückseite des Kopfes Maus so ausrichten, dass der geschärfte Punkt direkt hinter der Membran am ist ein ~ 30-45 °-Winkel (Abbildung 2).
2. Tauchen Sie die Spritze einmal oder ein paar Mal und die Spritze erarbeiten ~ 100-200 µL (dafür gibt es keine Verunreinigungen und Kapillare in das Glas gibt es Unterdruck).
3. Der Mikromanipulator, bewegen Sie die Kapillare mit Hilfe kippen Sie näher an die Membran, bis Widerstand gesehen werden kann, aber nicht durchstechen Sie es (Abb. 2D).
4. Sobald Widerstand zwischen der Spitze der Kapillare und die Membran gesehen, klopfen Sie leicht das Kapillarrohr durch die Membran durch Klopfen auf die Mikromanipulator-Steuerelemente. Verwenden Sie das Mikroskop den geschärften Punkt der Kapillare Punktion der Cisterna Magna einsehbar. CSF sollte automatisch in das Kapillarrohr gezogen werden, sobald die Öffnung punktiert worden (Abb. 2E).
5. Lassen Sie die Kapillare langsam CSF sammeln. Wenn CSF nicht herausziehen mehr, ziehen Sie die Spritze eine kleine Menge langsam (~ 50 µL) erstelle ich mehr Unterdruck in der Kapillare, Auszug aus GFK.
   Hinweis: Alternativ kann die Kapillare vorsichtig und langsam aus dem Gehirn mit feinen Mikromanipulator steuert damit CSF fließen in die Kapillare wieder gezogen werden. Eine Gesamtmenge von ~ 10-15 µL CSF (~ 3-4 cm in die Kapillare) dauert ~ 10-30 min, und gelegentlich 20 µL oder mehr gesammelt werden können. Obwohl nicht absolut notwendig sind, empfiehlt es sich, ein Wärmekissen bei CSF Sammlung verwenden. CSF Sammlung erfolgte bei Raumtemperatur (~ 23 ° C).
6. Sobald die Höhe der gewünschten CSF gesammelt werden, schließen Sie den Schlauch durch die Verlagerung der Dreiweg-Ventil schließen (Beenden der CSF herausziehen).
7. Nehmen Sie die Spritze an den Schlauch angeschlossen und öffnen Sie und schließen Sie dann den Schlauch (um ausgeglichene Druck in der Kapillare, Tubing und den Bereich außerhalb der Kapillare zu erstellen). Schließen Sie die Spritze mit dem drei-Wege-Ventil, sondern Tauchen Sie die Spritze nicht.
8. Entfernen Sie vorsichtig die Glas-Kapillare aus die Maus mit dem Mikromanipulator.
9. Legen Sie dem Sammelrohr (1,5 mL Mikroröhrchen mit 1 µL 20 x Protease-Hemmer) unter dem geschärften Punkt des Glases Kapillare.
10. Öffnen Sie den Schlauch und Spritze vorsichtig stürzen: die CSF sollten fließen aus der Kapillare und in dem Sammelrohr.
11. Schnell nach der Entnahme, Zentrifugieren (Puls Spin für 5 s mit maximaler Geschwindigkeit mit einer Mini-Zentrifuge) der CSF Probe mit dem Proteaseinhibitor am unteren Rand das Sammelröhrchen mischen.
    Hinweis: CSF Proben können regelmÄÑig werden und dann zur weiteren Analyse bei-80 ° c gelagert Der Rest der Maus kann für andere Gewebe wie Gehirn und Rückenmark seziert. Die Maus ist in diesem Stadium noch am Leben und somit Blut kann auch gesammelt werden, wenn nötig.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Mit dem hier beschriebenen Verfahren (Abbildung 1 und Abbildung 2), sollte sofort in die Kapillare gesammelt CSF klar (Abb. 2E), nicht rosa oder rot sein. Wenn es eine rosa bis roten Schimmer auf die Flüssigkeit in der Kapillare gesammelt gibt, dann gab es Kontamination mit Blut.

Ein Beispiel für die Anwendung der CSF Probe mit dieser Met...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt im Detail eine Technik, die auf aktuellen Methoden¹⁰ der CSF-Sammlung zu minimieren Kontamination aus Blut und ermöglichen die reichhaltige Sammlung von CSF verbessert (durchschnittlich ~ 10-15 µL erzielt werden) von Mäusen. Wenn die Kapillare Spitze zu brechen, die Spitze der Kapillare sollte nicht zu klein (wie damals die CSF wird extrahiert werden sehr langsam) sein oder zu groß (wird nicht fein genug, um die CSF sammeln und Gewebe in der Kapillare eingereicht we...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic)	Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.	30037517	CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors	66 vision technology	54002
Dissecting curved forceps	66 vision technology	53072
Dissecting straight forceps	66 vision technology	53070
Mouse adapter (with ear bars)	Made in-house.	N/A	Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope	Meiji Labax	Model 15381
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Magnetic base for micromanipulator	Kanetec	MB-K
Glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-1000
Syringes (1ml)	Tansoole	02024692	For 1ml.
Microtubes (1.5ml)	Axygen	MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free	Calbiochem	539134
Human Aβ42 ELISA kit	Invitrogen	KHB3441
Piping (teflon tubing)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Cotton buds	Obtained from any household store/pharmacy.	N/A