Beyin omurilik sıvısı imzalat fareler gelen topluluğu için geliştirilmiş bir yöntem

Özet

Bu iletişim kuralı beyin-omurilik sıvısı (bos) kan yok kirlenme ile bol topluluğu için geliştirilmiş bir teknik anlatılmaktadır. Daha fazla örnek toplama ve saflık ile daha fazla analiz anlayışımız beyin ve omurilik etkileyen hastalıkların daha fazla için CSF kullanarak gerçekleştirilebilir.

Özet

Beyin-omurilik sıvısı (bos) nörolojik araştırma analizi için değerli bir vücut sıvısı var. Bu sıvılar merkezi sinir sistemi ile yakın temas biridir ve böylece, doğrudan bu dokuların erişmeden beyin ya da omurilik hastalıklı durumunu analiz etmek için kullanılabilir. Ancak, kan damarlarının Sisterna magna yakınlığı nedeniyle elde etmek zordur farelerde, hangi sık sık örnekleri kontamine. Fareleri koleksiyonunda CSF için alan da için incelemek zordur ve genellikle sadece küçük örnekleri (5-7 µL en fazla veya daha az) elde edilir. Bu protokol üzerinde toplama kan kirlenme en aza indirmek ve bol koleksiyonda CSF (on ortalama 10-15 µL toplanan) izin vermek için geçerli yöntemleri geliştirir bir teknik ayrıntılı olarak anlatılmaktadır. CSF çekme sırasında herhangi bir doku etkilemez gibi bu tekniği fareler, doku koleksiyonundan için diğer diseksiyon yöntemleri ile kullanılabilir. Böylece, beyin ve omurilik bu tekniği ile etkilenmez ve sağlam kalır. Büyük CSF örnek toplama ve saflık ile daha fazla analizler bu sıvı daha fazla yardım nörolojik araştırma ile kullanılabilir ve daha iyi anlamak beyin ve omurilik etkileyen hastalıklar.

Giriş

Bos analizi nörolojik araştırma için değerli bir vücut sıvısı var. Bos öncelikle kan plazma kaç hücre (hiçbir kırmızı kan hücreleri ve sadece bir kaç beyaz kan hücreleri) içeren yapılır ve neredeyse protein ücretsizdir. Sıvılar merkezi sinir sistemi (MSS) ile yakın temas içinde biridir ve birçok elektrolit beyin ve omurilik periferik sisteme geçmek. İnsanlarda, CSF örnekleri hastalık teşhis yardım toplanabilir veya klinik araştırma amaçlı bir omurilik sıvısı (veya lomber ponksiyon) olarak bu küçük, invaziv bir işlemdir: CSF sıvı bunlar doğrudan erişmek zorunda kalmadan MSS değişiklikleri yansıtabilir doku. Böylece, klinikte, araştırma amacıyla son yıllarda CSF örnekleri nörodejeneratif hastalıklar Alzheimer hastalığı ve diğer demans^1,2,3gibi hastalardan elde edilmiştir. Orada potansiyel olarak hastalıkları Kliniği^2,3' te tanılamada yardımcı olmak için CSF numuneleri kullanılarak geliştirilen birçok biyomarker deneyleri. Ancak, özellikle hastalık^4,5tanılamak için tutarlı, hassas sonuçlar üretmek için bu deneyleri güvenilirliğini çok tartışma var. Standart bir teknik üretiminde daha fazla duyarlılık ve özgüllük ile nörodejeneratif hastalıkları teşhis etmek için yardım etmek için daha iyi deneyleri ve bos içinde bulunabilir, hedefler geliştirilmesi için büyük bir ihtiyaç vardır. Potansiyel insan CSF örnekleri hastalık nedeniyle, nörolojik araştırma kemirgen CSF koleksiyonundan da ilgi önemlidir.

Fareler önemli hayvan biyolojik ve tıbbi araştırma ve potansiyel terapötik bileşiklerin ve prototip, çalışmaların insan klinik çalışmalarda önce test için izin. Sisterna magna, beyincik ve medulla oblongata dorsal yüzeyi arasında bir açıklık ile elde etmek için her zamanki yöntem CSF koleksiyon farelerde olduğu gibi Ancak, farelerde bu CSF örnekleri için küçük bir hayvan, beyinde yakınlığı nedeniyle elde etmek zordur. Bu zorluk bu alan için incelemek zor olduğu gibi CSF örnekleri toplama ve kan damarları, kan hücreleri kirlenme riski artan yakın neden olur. Bu zorluklar nedeniyle çoğu araştırmacı sadece CSF az miktarda (genellikle 5-7 µL belirtilen) analiz için elde edebilirsiniz ve kan hücreleri tarafından CSF örnekleri kirlenme analizleri^6,7,8 için birincil bir sorundur ^{, 9}. kan kirlenme karanlık sonuçları ve değil gerçekten MSS durumunu yansıtır. Fareler toplanan zamanki miktar (içinde yinelenen ya da nüsha) tek bir ölçüm için yeterli Ayrıca, sınırlı örnek toplanan araştırma olabilir etkisi enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) kullanarak. Böylece, CSF örnekleri genellikle birden çok fare birden çok testleri çalıştırmak için yeterli örnek için havuza. Bir iletişim kuralı için bol geliştirmek, kirlenmemiş CSF koleksiyonundan fareler büyük ölçüde istenen ve kemirgenler kullanarak nörolojik araştırma geliştirmeye faydalı olacaktır.

Bu protokol, bol bir tekniği (ortalama 10-15 µL) imzalat fareler CSF koleksiyonundan ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve kan¹⁰kirlenme en aza indirmek için CSF koleksiyonunun karşılaşabileceği bilinen bir yöntem geliştirir. CSF koleksiyonu için sağlam bir protokol yanı sıra hastalığı teşhis yardım araştırma MSS etkileyen hastalıkların altında yatan mekanizmaları geliştirmek için kullanılan olabilir CSF tabanlı biyomarker deneyleri, geliştirilmesinde yardımcı olacak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Neuroscience (ABD) ve Bund'a Üniversitesi (Shanghai, Çin) etik Komiteler için toplum ilkelerine uygun olarak yapıldı. Bu yordam için bir hayatta kalma sigara cerrahidir.

1. Kurulum bos toplama aparatı

1. Cam kapiller çekin (iç çap 0,75 mm, dış çap 1.0 mm) (Liu ve ark. içinde gösterildiği gibi bir micropipette çektirmenin kullanarak ¹⁰; bilenmiş kılcal şekil 1' de gösterilen).
2. Yer bilenmiş cam kapiller yuvasına kapiller sıkıca bir micromanipulator (şekil 1A) monte.
3. Böylece ucu kırık iç çapını hakkında bir diseksiyon mikroskop altında düz Forseps ile bilenmiş kılcal ucunu kırmak 10-20 µm (şekil 1 c).
4. İnce bir tüp ve bir şırınga kapiller sahibi diğer ucunu takın ve ince bir tüp ve şırınga üç yollu vana ile bağlayın.
5. Açmak ve şırınga cama herhangi bir kirletici uzaklaştırdığını ve pozitif basınç kapiller tüpünde Kılcal Boru aracılığıyla şırıngadan blow hava atılmak için üç yollu vana kaydır.
6. Bunu bir kaç kez dis bağlanma ve üç yollu vana şırınga yeniden bağlanma ve şırınga çizim tarafından tekrar ~ 100-200 µL üç yollu vana (şekil 1B) şırınga son yeniden bağlantı önce.
7. Micromanipulator kılcal cam tarafında fare diseksiyon sırasında zarar görmesini önlemek için hareket.

Şekil 1. Mikroskop, micromanipulator ve kapiller Kur. (A)mikroskop micromanipulator bağlı kılcal ile kurulum ve, (B) daha yakın bir görüntü yanı sıra bağlı şırınga ve açmak için üç yollu vana (burada gösterilen) veya yakın boru ve (C) bir kırılmamış (sağ) ve (sol) kırık Kapiler uç CSF koleksiyonu için hazır. Kırık sonra kılcal ucu var bir 0,75 mm iç çap, dış çap 1.0 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

2. fare diseksiyon

1. Fare anestezi.
   Not: Bu iletişim kuralı, C57BL/6 ve amiloid precursor protein/presenilin 1 (APP/PS1) transgenik için (Alzheimer hastalığı fare modeli) fare kullanılan ve 10 µL/g mayi ile fare ağırlık itibariyle % 4 kloral hidrat (dH₂0)'ile anestezi enjeksiyon.
2. Tam anestezi, fare yeterli anestezi sağlamak. Çimdik, biraz arka bacaklarda uzanan ve ayak parmakları pinching ve para çekme yanıt için izlerken tarafından baştan aşağı çekilmesi yanıt yeterli anestezi sağlamak için gerçekleştirilir. Tüm dört bacaklarda pinching tarafından kontrol edin; herhangi bir tepki ise fare düzgün anestezi. Kesme ve fareyi gözler, kulaklar diseksiyon makası (şekil 2A) kullanarak boyun altına arasında yukarıda başkanı arkasında saç kesme. Alternatif olarak, makas veya depilatory krem saç kaldırma yardım etmek için kullanılabilir.
3. Fare fare bağdaştırıcısı kullanılarak başkanı güvenli (baş aşağı yöne Burnu yukarı dönük olacak şekilde geri ~ 45 °, şekil 2A). Kulak barlar arasında kulakları ve gözleri fare düzeltmek ve sıkın. Baş taşıyamazsınız ve sıkıca'deki bağdaştırıcı fare baş hafifçe iterek tarafından güvenlik altına alınır emin olun.
4. Para Çekme yanıt çimdik cerrahi kesi yapmadan önce baştan aşağı yeniden denetleyin ve düzenli olarak bundan sonra cerrahi anestezi boyutunda sağlamak için. Görsel olarak solunum hızı herhangi bir değişiklik değişiklikler anestezi uçaklarda belirtmek için bu yordamı sırasında dikkat edin. Temiz, aseptik non-teknik bu kısa hayatta kalma ameliyat için kullanılabilir. Kafatasının sadece kas ince bir tabaka ile maruz kadar makas ve eğri forseps kullanarak, cilt ve kas ilk katman kesilmiş.
   Not: fare deri yoluyla boyun sırtına kesin ve sonra kulakları ve gözleri fare arasında kafatasının ikiye deriyi kesme. Sonra cilt ve doku üzerinde Sisterna magna apart ve bölgeden ayrılabilir.
5. Görüntüleme diseksiyon mikroskop aracılığıyla dikkatle incelemek iken uzakta son katmanları kas forseps kullanarak kafatası tabanı üzerinde ince ve bu katmanları kas tarafa ve ilgi alanı dışına taşıyabilirsiniz. Orada kanıyor, pamuk tomurcukları kaldırmak ve kanamayı durdurmak yardımcı olmak için kullanın.
6. Dura Sisterna magna üzerinden maruz bir kez (üçgen şekli ile genellikle 1-2 büyük kan damarları alan; çalışan iki tarafında veya kan damarları arasına kapiller ekleme ve CSF koleksiyonu, şekil 2Biçin en iyi yöntemdir), ıslak kullanın membran silmek için pamuk bud temiz ve kuru pamuklu bud alan kuru için kullanın.

Şekil 2. Fare ve diseksiyon Kur kapiller ekleme CSF koleksiyonu için temsil edici görüntülerle. Fare CSF çekme(a)için hazır kurulum traş diseksiyon ve (B) görüntü Sisterna magna kapsayan bir disseke fare dura (10 x görünümü) ayrıntılı için yere sabitlenmiş kafa (Kesikli ok gösterir alanı üzerinden çalışan bir kan damarı ve katı ok alanı için ideal kapiller ekleme gösterir). Detaylı resimleri (10 x görünümü) (C) cam kapiller Sisterna magna, (D) nokta hangi kılcal deliyor neredeyse dura dura ve (E) Kapiler uç vurdu bazı direnç ile dura karşı uyumlu ucu bilenmiş CSF toplamak için beyin zarı. CSF berrak bir sıvı cam kapiller (noktalı ok) toplanan olmalıdır. Tüm ölçek her mikroskop görüntünün sağ alt 100 µm. Çubuklarõn Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. bos koleksiyonundan imzalat fare

1. Şekilde hemen arkasında membran bilenmiş noktasıdır fare kafasının arkasına için cam kılcal hizalayın bir ~ 30-45 derecelik açıyla (şekil 2C).
2. Dalma şırınga bir kez veya birkaç kez ve şırınga çizmek ~ (orada hiçbir kirletici ve orada negatif basınç bardakta kapiller emin olmak için) 100-200 µL.
3. Micromanipulator kılcal hareket kullanarak direnç görülebilir kadar yakın membran için ipucu, ama bu (şekil 2B) Delme değil.
4. Bir kez direnç kapiller ucu ve membran arasında görülür, yavaşça micromanipulator denetimlere çalıyor tarafından kapiller membran tüpten dokunun. Mikroskop kapiller ponksiyon bilenmiş turistik Sisterna magna görmek için kullanın. CSF otomatik olarak çizilmiş kılcal tüpe açılış delinmiş bir kez (şekil 2E).
5. Yavaş yavaş CSF toplamak için kılcal bırakın. Bos çizim durdurulmuşsa, yavaş yavaş şırınga küçük bir miktar yukarı çizmek (~ 50 µL) daha negatif basınç kapiller CSF çıkarmak için oluşturmak için.
   Not: Alternatif olarak, kılcal nazikçe ve yavaşça tekrar kılcal damar akmaya CSF izin vermek için iyi micromanipulator denetimlerini kullanarak beyin dışarı çekilebilir. Toplam miktarı ~ 10-15 µL CSF, (~ kılcal 3-4 cm) alır ~ 10-30 dakika ve zaman zaman 20 µL veya daha fazla toplanan. Kesinlikle gerekli olmasa da, bir ısı yastık CSF toplama sırasında kullanılması önerilir. CSF koleksiyonu oda sıcaklığında gerçekleştirilen (~ 23 ° C).
6. İstenen CSF miktarı toplanır sonra tüp (CSF çizim önlemek için) kapatmak için üç yollu vana ilerletmeniz kapatın.
7. Kablo kanalları için bağlı şırınga çıkarmak ve açın ve boru (kılcal, boru ve alanının dışında kılcal equalized basınç oluşturmak için) kapatın. Üç yollu vana şırınga yeniden, ama belgili tanımlık tenkıye Dalma değil.
8. Yavaşça cam kılcal micromanipulator kullanarak fare çıkarın.
9. Toplama tüp (20 x proteaz inhibitörü 1 µL ile 1.5 mL mikrotüpler) altında camın üzerine bilenmiş kapiller getirin.
10. Tüp aç ve yavaşça şırınga Dalma: bos kılcal ve toplama tüp içine akışı gerekir.
11. Toplandıktan sonra hızlı bir şekilde santrifüj kapasitesi (pulse tur 5 mini santrifüj kullanarak maksimum hızda s) örnek toplama tüp alt proteaz inhibitörü ile karıştırmak için bos.
    Not: CSF örnekleri bölünmemeli olabilir ve daha fazla analiz-80 ° C'de depolanan Fare geri kalanı için beyin ve omurilik gibi diğer dokulara disseke. Fare bu aşamada hala yaşıyor ve böylece kan da, gerekirse toplanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Burada özetlenen yordamı (Resim 1 ve Şekil 2) kullanarak, hemen kılcal içinde toplanan CSF açık (şekil 2E), değil pembe ya da kırmızı olmalıdır. Bir pembe kılcal içinde toplanan sıvı için kırmızı renklendirmek için ise, o zaman kan ile kirlenme vardı.

Bu yöntemle CSF örnek uygulamalara örnek olarak toplanan gibi p...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı ayrıntılı olarak geçerli yöntemleri¹⁰ kan kirlenme en aza indirmek ve CSF bol koleksiyonu için izin vermek için CSF koleksiyonunun artıran bir teknik anlatılmaktadır (ortalama ~ 10-15 µL elde edilebilir) fare üzerinden. Kapiler uç kırma zaman kılcal ucu (sonra da bos hulâsa çok yavaş) çok küçük olmamalı veya (çok büyük-ecek değil var olmak yeterli bos toplamak için ince ve doku içinde kılcal teslim olmak). CSF koleksiyonu için alan dissekan zaman...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic)	Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.	30037517	CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors	66 vision technology	54002
Dissecting curved forceps	66 vision technology	53072
Dissecting straight forceps	66 vision technology	53070
Mouse adapter (with ear bars)	Made in-house.	N/A	Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope	Meiji Labax	Model 15381
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Magnetic base for micromanipulator	Kanetec	MB-K
Glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-1000
Syringes (1ml)	Tansoole	02024692	For 1ml.
Microtubes (1.5ml)	Axygen	MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free	Calbiochem	539134
Human Aβ42 ELISA kit	Invitrogen	KHB3441
Piping (teflon tubing)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Cotton buds	Obtained from any household store/pharmacy.	N/A