Усовершенствованный метод для коллекции спинномозговой жидкости от наркотизированных мышей

Резюме

Этот протокол описывает улучшения техники для коллекции обильные цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) с не загрязнение от крови. С большей выборки и чистоты больше анализов может выполняться с использованием ФГО для дальнейшего понимания болезней, которые влияют на мозг и спинной мозг.

Аннотация

Спинномозговой жидкости (СМЖ) является ценным жидкости тела для анализа в неврологии исследований. Он является одним из жидкости в ближайший контакт с центральной нервной системой и таким образом, может использоваться для анализа состояние больной головного или спинного мозга без прямого доступа к эти ткани. Однако мышей, которые трудно получить от Чистерна magna из-за его близости к кровеносных сосудов, которые часто загрязняют образцы. Области сбора ФГО в мышей также сложно рассекать на и часто лишь небольшие образцы получены (максимум 5-7 мкл или меньше). Этот протокол описывает подробно технику, которая улучшает на текущие методы сбора для сведения к минимуму загрязнения от крови и обильные коллекции спинномозговой жидкости (в среднем, собранные 10-15 мкл). Этот метод может использоваться с другими методами рассечение ткани коллекции от мышей, как она не оказывает влияния любых тканей во время извлечения CSF. Таким образом головного и спинного мозга с этой техникой не затрагиваются и остаются нетронутыми. С большей сбор образцов спинномозговой жидкости и чистоты больше анализов могут быть использованы с этой жидкости для дальнейшей помощи неврологии исследований и лучше понять заболеваний головного и спинного мозга.

Введение

Спинномозговой жидкости является ценной жидкости тела для анализа в неврологии исследований. ФГО главным образом сделаны из плазмы крови, содержащий несколько клеток (нет красных кровяных клеток и только несколько белых кровяных клеток) и почти белка-бесплатно. Это один из жидкости в тесном контакте с центральной нервной системы (ЦНС) и он может передать многие электролитов из головного и спинного периферической системы. В организме человека, образцов спинномозговой жидкости могут быть собраны для помощи в диагностике болезней или для исследовательских целей в клинических испытаниях, как спинномозговой пункции (или поясничный прокол) несовершеннолетнего, инвазивные процедуры: CSF жидкости может отражать изменения в ЦНС без необходимости для прямого доступа к ним тканей. Таким образом в последние годы, для исследовательских целей в клинике, CSF образцы были получены от больных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и другими видами деменции^1,2,3. Существует много биомаркер анализов, которые были разработаны с использованием образцов спинномозговой жидкости для потенциально помочь в диагностике заболеваний в клинике^2,3. Однако есть много дебатов на надежность этих анализов результатов последовательным, чувствительных специально диагностировать болезни^4,5. Таким образом существует большая потребность развития лучше анализов и целевых показателей, которые могут быть найдены в спинномозговой жидкости, чтобы помочь в производстве стандартный метод диагностики нейродегенеративных заболеваний с большей чувствительностью и специфичностью. Ввиду потенциальной важности человеческого образцов спинномозговой жидкости в болезни коллекция спинномозговой жидкости от грызунов в неврологии исследования также представляет интерес.

Мышей являются важными животных в биологических и медицинских исследованиях и позволяют для проверки потенциальных терапевтических соединений и доказательства в концепция исследования перед клинические испытания на человеке. Однако у мышей трудно получить образцов спинномозговой жидкости из-за его близости к мозгу в маленькое животное, как обычный метод коллекции ФГО в мышах для получения через Чистерна magna, открытие между дорсальной поверхности продолговатого мозга и мозжечке. Это вызывает трудности в сборе образцов спинномозговой жидкости, как трудно анализировать в этой области и в непосредственной близости от кровеносных сосудов, увеличивает риск заражения от клеток крови. Из-за эти трудности большинство исследователей могут получить только небольшое количество ЦСЖ для анализа (как правило, указывается как 5-7 мкл) и загрязнение образцов спинномозговой жидкости клетками крови является предметом главной озабоченности для анализа^{6,,78 , 9}. загрязнение крови может скрывать результаты и не действительно отражают состояние центральной нервной системы. Кроме того, небольшая выборка собранных может повлиять исследований как обычная сумма собранных от мышей является достаточно только одного измерения (в двух экземплярах или экземплярах) с помощью энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA). Таким образом образцов спинномозговой жидкости, обычно пул из нескольких мышей для того чтобы иметь достаточно образца для запуска нескольких анализов. Разработка протокола для обильные, незагрязненный коллекция спинномозговой жидкости от мышей значительно желаемого и будет полезным в улучшение нейронауки исследование с помощью грызунов.

В этом протоколе, техника для обильные (в среднем 10-15 мкл) коллекция ликвора из наркотизированных мышей подробно описан и улучшает на в настоящее время известный метод коллекции ФГО для сведения к минимуму загрязнения от крови¹⁰. Надежный протокол для ФГО коллекции будет помощь в разработке на основе спинномозговой жидкости биомаркеров анализов, которые могут быть использованы для помощи в диагностике заболеваний, а так же улучшить исследования в рамках механизмов, которые лежат в основе болезней центральной нервной системы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с политикой общества для неврологии (США) и Университет Фудань (Шанхай, Китай) этические комитетам. Эта процедура предназначена для хирургии-выживание.

1. Установка СМЖ коллекции аппарата

1. Потяните стеклянные капиллярные (внутренний диаметр 0,75 мм, наружный диаметр 1,0 мм) с помощью съемника микропипеткой (как показано в Лю et al. ¹⁰; заостренный капиллярные показано на рис. 1).
2. Место четкая стеклянный капилляр в капиллярной держатель твердо установленный на микроманипулятор (рис. 1A).
3. Разорвать кончик заостренный капилляра пинцетом прямо под микроскопом рассечения, таким образом, чтобы внутренний диаметр сломанной кончик о 10-20 мкм (рис. 1 c).
4. Прикрепите тонкую трубку и шприц в другой конец капиллярной владельца и подключить тонкая трубка и шприц с трехходовой клапан.
5. Сдвиг трехходовой клапан открытия и окунуться шприц удар воздуха из шприца через трубку в стеклянный капилляр высылать любых загрязнений и создать положительное давление в капиллярной трубке.
6. Повторите это несколько раз, дис подключения и повторного подключения шприц на трехходовой клапан и составление шприц ~ 100-200 мкл до последнего повторного подключения шприца с трехходовой клапан (рис. 1B).
7. Переместите микроманипулятор с стеклянный капилляр в сторону, чтобы предотвратить повреждение во время вскрытия мыши.

Рисунок 1. Микроскоп, микроманипулятор и капиллярной установке. (A) микроскопа и микроманипулятор с капиллярной придает установки, а также ближе образ (B) подключенных шприц и трехходовой клапан открыть (показано ниже) или закрыть трубопровод и (C) непрерывной (справа) и сломанной (слева) капиллярные Совет готов к коллекции CSF. После сломанной, кончик капилляра должен иметь внутренний диаметр 0,75 мм, наружный диаметр 1,0 мм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

2. рассечение мыши

1. Анестезировать мышь.
   Примечание: для этого протокола, C57BL/6 и амилоид прекурсоров протеина/Пресенилин 1 (APP/PS1) трансгенных мышей (модель мыши болезни Альцгеймера) были использованы и наркозом с 4% хлораль гидрат (в dH₂0) на 10 мкл/g вес мыши через внутрибрюшинного инъекции.
2. Когда полностью под наркозом, убедитесь, что мышь адекватно под наркозом. Вывода ответа до пят пинча, слегка расширяя задних конечностей и защемления пальцев и наблюдать для вывода ответа, выполняется для обеспечения адекватной анестезии. Проверить, щипать все четыре конечности; Если реакции нет мыши должным образом под наркозом. Вырезать и подстригать волосы на затылке мыши сверху глаз, между ушами в нижней части шеи, с использованием рассечения ножницы (рисунок 2A). Кроме того ножницы или депиляционный крем может использоваться для помощи в удалении волос.
3. Закрепите головку мыши с помощью мыши адаптер (задней части головы вверх с носом указал вниз ~ 45 °, рис. 2A). Исправьте уха баров между ушами и глазами мыши и затянуть. Убедитесь, что голова не может двигаться и плотно крепится в адаптер, осторожно нажимая вниз на голову мыши.
4. Повторная проверка вывода ответа до пят щепотку до принятия хирургический разрез и регулярно впоследствии обеспечить хирургические плоскости анестезии. Визуально отметить любое изменение частоты дыхания во время процедуры, чтобы указать изменения в плоскостях анестезии. Чистый, асептическая, техника может использоваться для этого короткого хирургии-выживание. С помощью ножниц и Изогнутый пинцет, прорваться через кожу и первый слой мышц до основания черепа подвергается лишь тонким слоем мышц.
   Примечание: Cut через кожу мыши через заднюю часть шеи, а затем вырезать кожу вниз в середине черепа между ушами и глазами мыши. Кожи и тканей может затем быть вытащил друг от друга и из области над Чистерна magna.
5. Во время просмотра путем рассечения Микроскоп, тщательно анализировать прочь последний тонких слоев мышц над основания черепа с помощью щипцов и переместить эти слои мышц в сторону и из области интересов. Если есть кровотечение, использовать ватные палочки для удаления и помочь остановить кровотечение.
6. После того, как дура над Чистерна magna подвергается (треугольной формы с обычно 1-2 крупных кровеносных сосудов работает через район; обе стороны или между кровеносных сосудов является оптимальным для капиллярной вставки и CSF коллекции, Рисунок 2B), используйте мокрой ватным тампоном протирать мембраны и затем использовать сухой ватной палочкой для сухой области.

Рисунок 2. Мыши и рассечение установки с представителя изображения капиллярного вставки для коллекции ФГО. Настройка мыши готовы для извлечения Ликвора с (A) бритая голова, зажат в месте рассечения и (B) подробные изображения (10 x вид) расчлененных мыши Дура, охватывающих Чистерна magna (пунктирная стрелка показывает кровеносный сосуд, проходит через области и твердых стрелка показывает область оптимального для капиллярной вставки). Детальные изображения (вид x 10) (C) заостренным кончиком стеклянный капилляр соответствие против Дура Чистерна magna, (D) точки на котором капилляра почти проколы Дура, с некоторым сопротивлением Дура и (E) капиллярной кончик постучал через Дура собирать CSF. Спинномозговой жидкости должна быть прозрачной жидкости, собранные в стеклянный капилляр (пунктирная стрелка). Все шкалы полосы на нижней правой части каждого изображения микроскопа указывают 100 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

3. CSF коллекции от наркотизированных мыши

1. Совместите стеклянный капилляр в задней части головы мыши, таким образом, чтобы точка заостренный позади мембраны на ~ под углом 30-45 ° (рис. 2 c).
2. Плунге шприц один раз или несколько раз и подготовки шприц ~ 100-200 мкл (чтобы убедиться, есть без загрязняющих веществ и отрицательное давление в стекла капилляров).
3. С помощью микроманипулятор, переместить капилляра Совет ближе к мембране, до тех пор, пока можно увидеть сопротивление, но не проколов его (Рисунок 2D).
4. После сопротивления видели между кончиком капилляра и мембраны, аккуратно коснитесь капиллярную трубку через мембрану, сбивая микроманипулятор элементов управления. Используйте Микроскоп, чтобы увидеть заостренный точки капиллярного прокол в Чистерна magna. CSF автоматически быть втянутыми в капиллярную трубку после прокола открытия (Рисунок 2E).
5. Оставьте капиллярные медленно собирать CSF. Если CSF был остановлен, растягивая, нарисуйте шприцем вверх небольшой объем медленно (~ 50 мкл) для создания более отрицательное давление в капилляр для извлечения из спинномозговой жидкости.
   Примечание: в качестве альтернативы, капилляр может быть аккуратно и медленно вытащил мозга с помощью тонкой микроманипулятор элементов управления позволяет CSF течь в капилляр снова. Общее количество ~ 10-15 мкл ликвора (~ 3-4 см в капилляр) занимает ~ 10-30 мин и иногда 20 мкл и более могут быть собраны. Хотя не обязательно, рекомендуется использовать пусковую площадку тепла во время сбора CSF. CSF коллекция была выполнена при комнатной температуре (~ 23 ° C).
6. После сбора количество желаемых ФГО, закройте трубку, сдвигая трехходовой клапан закрыть (чтобы остановить, растягивая ФГО).
7. Вынуть шприц, подключенных к трубы и откройте и закройте трубы (для создания сравнял счет давления в капилляр, труб, а также область за пределами капилляра). Подключите шприц с трехходовой клапан, но не окунайте шприца.
8. Осторожно выньте стеклянный капилляр из мыши, с помощью микроманипулятор.
9. Место коллекции трубки (1,5 мл пробирок с 1 мкл 20 x ингибитор протеазы) под точкой заостренный стекла капилляров.
10. Откройте трубы и аккуратно окунуться шприц: ФГО должны вытекать из капилляра и в коллекции трубку.
11. После сбора, быстро центрифуги (импульсный счетчик для 5 s на максимальной скорости, используя мини-центрифуга) Ликвора смешать образца с ингибитором протеазы в нижней части трубки коллекции.
    Примечание: Образцов спинномозговой жидкости могут быть aliquoted и затем сохраняются для дальнейшего анализа на-80 ° C. Остальная часть мыши можно расчлененный для других тканей, таких как мозг и спинной мозг. Мышь на данном этапе все еще жив, и таким образом крови могут также быть собраны, при необходимости.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Используя описанную здесь (рис. 1 и рис. 2), спинномозговой жидкости, немедленно, собранных в капилляр должно быть ясно (Рисунок 2E), не розовый или красный. Если есть розовый с красным оттенком жидкости, собранные в капилляр,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает подробно технику, которая улучшает текущие методы¹⁰ ФГО коллекции для сведения к минимуму загрязнения от крови и обильные коллекции ликвора (в среднем ~ можно получить 10-15 мкл) от мышей. Когда нарушение капиллярного кончик, кончик капилляра не должно ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic)	Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.	30037517	CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors	66 vision technology	54002
Dissecting curved forceps	66 vision technology	53072
Dissecting straight forceps	66 vision technology	53070
Mouse adapter (with ear bars)	Made in-house.	N/A	Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope	Meiji Labax	Model 15381
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Magnetic base for micromanipulator	Kanetec	MB-K
Glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-1000
Syringes (1ml)	Tansoole	02024692	For 1ml.
Microtubes (1.5ml)	Axygen	MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free	Calbiochem	539134
Human Aβ42 ELISA kit	Invitrogen	KHB3441
Piping (teflon tubing)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Cotton buds	Obtained from any household store/pharmacy.	N/A