Une méthode améliorée pour la collecte du liquide céphalo-rachidien de souris anesthésiés

Résumé

Ce protocole décrit une technique améliorée pour la collection abondante de liquide céphalo-rachidien (LCR) sans la contamination du sang. Avec une plus grande collecte d’échantillons et de la pureté, des analyses plus peuvent être effectuées à l’aide de CSF pour faire avancer notre compréhension des maladies qui affectent le cerveau et la moelle épinière.

Résumé

Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un liquide organique précieux pour l’analyse de la recherche en neurosciences. Il est l’un des fluides en contact plus proche avec le système nerveux central et ainsi, peut être utilisé pour analyser l’État malade du cerveau ou la moelle épinière sans accéder directement à ces tissus. Cependant, chez les souris, qu'il est difficile d’obtenir de la magna de cisterna en raison de sa proximité aux vaisseaux sanguins, qui contaminent souvent échantillons. La zone pour collection CSF chez la souris est aussi difficile à décortiquer à et souvent seulement de petits échantillons sont obtenus (maximum de 5-7 µL ou moins). Ce protocole décrit en détail une technique qui améliore les méthodes actuelles de collecte pour minimiser la contamination du sang et permettre la collection abondante du LCR (en moyenne que 10-15 µL peuvent être collectées). Cette technique peut servir à d’autres méthodes de dissection pour la collection de tissus provenant de souris, car il n’influe pas sur les tissus lors de l’extraction de la CSF. Ainsi, le cerveau et la moelle épinière ne sont pas affectés par cette technique et restent intacts. Avec une plus grande collecte d’échantillons de CSF et pureté, des analyses plus peuvent être utilisés avec ce fluide d’autre aide la recherche en neurosciences et mieux comprennent les maladies qui touchent le cerveau et la moelle épinière.

Introduction

Le CSF est un liquide organique précieux pour l’analyse de la recherche en neurosciences. Le CSF est principalement fabriqué à partir de plasma sanguin, contenant peu de cellules (sans culots globulaires et seulement quelques cellules de sang blanches) et est presque exempt de protéines. C’est l’un des fluides en contact étroit avec le système nerveux central (CNS) et il peut passer des électrolytes beaucoup du cerveau et la moelle épinière vers le système périphérique. Chez l’homme, échantillons de LCR peuvent être recueillis pour aider à diagnostiquer la maladie ou à des fins de recherche dans les essais cliniques, comme une ponction lombaire (ou ponction lombaire) est une procédure invasive mineure : le fluide de CSF peut refléter des changements dans le système nerveux central sans avoir à accéder directement à ces tissus. Ainsi, ces dernières années, à des fins de recherche à la clinique, les échantillons de LCR ont été obtenus de patients atteints de maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer et autres démences^1,2,3. Il existe plusieurs tests de biomarqueurs qui ont été développés en utilisant des échantillons de LCR pour éventuellement aider dans le diagnostic des maladies à la clinique^2,3. Cependant, il y a beaucoup de débats sur la fiabilité de ces tests pour produire des résultats constants et sensibles pour diagnostiquer précisément la maladie^4,5. Donc, il y a un grand besoin pour le développement de la meilleure des dosages et des objectifs qui peuvent être trouvés dans le LCR, pour aider à produire une technique standard pour diagnostiquer les maladies neurodégénératives avec plus de sensibilité et de spécificité. En raison de l’importance potentielle des échantillons de LCR humaines dans la maladie, la collection du CSF de rongeurs dans la recherche en neurosciences est également intéressant.

Les souris sont des animaux importants dans la recherche biologique et médicale et permettant l’analyse de composés thérapeutiques potentiels et les études de validation avant d’essais cliniques humains. Cependant, chez les souris il est difficile d’obtenir des échantillons de LCR en raison de sa proximité au cerveau dans un petit animal, étant donné que la méthode habituelle de CSF collection chez la souris doit l’obtenir par l’intermédiaire de la cisterna magna, une ouverture entre le cervelet et la surface dorsale du bulbe rachidien. Cela provoque des difficultés dans la collecte d’échantillons de LCR car cette zone est difficile à décortiquer à et à proximité des vaisseaux sanguins, augmentant le risque de contamination par les globules. En raison de ces difficultés, la plupart des chercheurs ne peuvent obtenir une petite quantité de LCR pour analyse (habituellement soit le µL 5-7) et la contamination des échantillons de LCR par les globules est une préoccupation majeure pour les analyses^{6,7,8 , 9}. contamination de sang peut obscurcir les résultats et ne reflète pas véritablement l’état de la CNS. En outre, limitée de l’échantillon recueillie peut avoir un impact recherche que la quantité habituelle provenant de souris suffit pour qu’une seule mesure (en double ou triple exemplaire) à l’aide de dosage immuno-enzymatique (ELISA). Ainsi, échantillons de LCR sont habituellement mis en commun de plusieurs souris afin d’avoir suffisamment d’échantillon pour exécuter plusieurs tests. Élaboration d’un protocole pour les abondants, collection non contaminée du FSC provenant de souris est vivement souhaitée et sera bénéfique dans l’amélioration de la recherche en neurosciences à l’aide de rongeurs.

Dans ce protocole, une technique pour les abondantes (en moyenne 10-15 µL) collection de peste porcine classique chez des souris anesthésiés est décrit en détail et améliore sur une méthode actuellement connue de collection de CSF pour minimiser la contamination du sang,¹⁰. Un protocole robuste pour collection CSF facilitera le développement de dosages de biomarqueurs axée sur le CSF, qui pourrait être utilisé pour aider à diagnostiquer la maladie, en plus d’améliorer la recherche sur les mécanismes qui sous-tendent les maladies affectant le système nerveux central.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été effectuées conformément aux politiques de la société des neurosciences (USA) et des comités d’éthique Fudan University (Shanghai, Chine). Cette procédure est pour une chirurgie sans survie.

1. installation d’appareils de Collection CSF

1. Tirez le verre capillaire (diamètre intérieur 0,75 mm, diamètre extérieur 1,0 mm) en utilisant un micropipettes (comme le montre Liu et al. ¹⁰; affûtée capillaire est illustré dans la Figure 1).
2. Place un verre affuté capillaire dans le capillaire support monté solidement sur un micromanipulateur (Figure 1 a).
3. Casser l’extrémité du capillaire affuté avec une pince droite sous un microscope à dissection, afin que le diamètre intérieur de la pointe cassée est sur 10 à 20 µm (Figure 1).
4. Fixez un tube mince et une seringue à l’autre extrémité du porte-capillaire et relier le tube mince et la seringue avec un robinet à trois voies.
5. Changer le robinet à trois voies pour ouvrir et plonger la seringue à souffler de l’air de la seringue à travers la tubulure sur le verre capillaire d’expulser tous les contaminants et créer une pression positive dans le tube capillaire.
6. Répétez ceci plusieurs fois par dis-connexion et re-connecter la seringue à la vanne trois voies et établissant la seringue ~ 100-200 µL avant le dernier rebranchement de la seringue avec le robinet à trois voies (Figure 1 b).
7. Déplacer le micromanipulateur avec le verre capillaire sur le côté pour éviter tout dommage au cours de la dissection de la souris.

Figure 1. Microscope, micromanipulateur et installation capillaire. (A) Microscope et micromanipulateur capillaire jointe setup, ainsi qu’une image plus proche de (B) la seringue connecté et la vanne trois voies pour ouvrir (ci-contre) ou fermer la tuyauterie et (C) un ininterrompue (droit) et cassé (gauche) pointe capillaire prête pour la collecte de la CSF. Une fois cassé, l’extrémité du capillaire doit avoir un diamètre intérieur de 0,75 mm, diamètre extérieur de 1,0 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

2. Dissection de la souris

1. Anesthésier la souris.
   Remarque : pour ce protocole, C57BL/6 et amyloïde précurseur protéique/préséniline 1 (APP/PS1) transgéniques souris (modèle murin de la maladie d’Alzheimer) ont été utilisés et anesthésiés à l’hydrate de chloral de 4 % (en dH₂0) à 10 µL/g de poids de la souris par voie intrapéritonéale injection.
2. Lorsque complètement anesthésiés, veiller à ce que la souris est anesthésiée convenablement. La réponse de retrait à l’orteil pincée, en légère extension des membres postérieurs et vous pincer les doigts et je regarde pour une réponse de retrait, est réalisée afin d’assurer une anesthésie adéquate. Vérifier en pinçant toutes les quatre membres ; s’il n’y a aucune réaction de la souris est correctement anesthésiée. Couper et tailler les cheveux à l’arrière de la tête de la souris par dessus les yeux, entre les oreilles vers le bas de la nuque à l’aide de ciseaux de dissection (Figure 2 a). Alternativement, tondeuses ou la crème dépilatoire peut être utilisée pour aider à l’épilation.
3. Fixer la tête de la souris à l’aide d’un adaptateur de souris (l’arrière de la tête vers le haut avec le nez pointé vers le bas à ~ 45 °, Figure 2 a). Fixer les barres d’oreilles entre les oreilles et les yeux de la souris et serrer. Assurez-vous que la tête ne peut pas bouger et est attachée fermement dans l’adaptateur en appuyant doucement sur la tête de la souris.
4. Revérifiez la réponse de retrait aux pieds pincée avant de faire l’incision chirurgicale et régulièrement par la suite pour assurer un plan chirurgical de l’anesthésie. Visuellement, Notez tout changement de la fréquence respiratoire au cours de la procédure pour indiquer les changements dans les plans de l’anesthésie. Une technique propre et non aseptiques, peut être utilisée pour cette chirurgie sans survie courte. À l’aide de ciseaux et pinces courbées, couper à travers la peau et la première couche de muscle jusqu'à ce que la base du crâne est exposée avec seulement une fine couche de muscle.
   NOTE : Couper à travers la peau de souris à l’arrière du cou et couper la peau vers le bas au milieu du crâne entre les oreilles et les yeux de la souris. Peau et du tissu puis peuvent être tirés à part et hors de la zone au cours de la cisterna magna.
5. Alors que Regarde un à travers le microscope à dissection, disséquer attentivement loin le dernier minces couches de muscle sur la base du crâne à l’aide de pinces et déplacer ces couches de muscle sur le côté et hors de la zone d’intérêt. Si le saignement se produit, utiliser des cotons-tiges pour enlever et contribuer à faire cesser le saignement.
6. Une fois que la dure-mère au fil de la cisterna magna est exposée (en forme de triangle avec habituellement 1-2 gros vaisseaux sanguins qui traversent la zone ; d’ou entre les vaisseaux sanguins est optimale pour une insertion capillaire et collection de CSF, Figure 2 b), utiliser un humide coton-tige pour nettoyer la membrane puis utilisez un coton-tige sec pour sécher la zone.

Figure 2. Une configuration souris et dissection avec des images représentatives d’insertion capillaire pour collection CSF. Le programme d’installation de souris prête pour l’extraction de la CSF avec (A) rasé tête fixée en place pour la dissection et (B) d’image (10 x avis) d’une souris disséquée dura couvrant la cisterna magna (flèche en pointillé indique un vaisseau sanguin qui traverse la région et flèche pleine montre zone optimale pour insertion capillaire). Images détaillées (vue de x 10) (C) affûté pointe de verre capillaire aligné contre dura de cisterna magna, (D) le point auquel le capillaire perforations presque la dura, avec une certaine résistance de la dure-mère et (E), la pointe capillaire taraudé par le biais de la dure-mère pour recueillir des CSF. CSF devrait être un liquide clair, recueilli dans le capillaire de verre (flèches en pointillés). Toutes les barres d’échelle en bas à droite de chaque image microscopique indiquent 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

3. CSF Collection de souris anesthésiée

1. Alignez le capillaire de verre à l’arrière de la tête de la souris de sorte que le point affûté est juste derrière la membrane à un ~ angle de 30-45 ° (Figure 2).
2. Plonger la seringue une fois ou quelques fois et établit la seringue ~ 100-200 µL (pour s’assurer il n’y a aucun contaminant et il y a une pression négative dans le verre capillaire).
3. En utilisant le micromanipulateur, déplacer le capillaire incliner plus près de la membrane jusqu'à ce que la résistance peut être vu, mais ne pas percer il (Figure 2D).
4. Une fois que la résistance est observée entre l’extrémité du capillaire et la membrane, Tapotez doucement le tube capillaire à travers la membrane en cognant sur les contrôles de micromanipulateur. Utiliser le microscope pour voir le point aiguisé de la ponction capillaire dans la cisterna magna. CSF devrait être tracée dans le tube capillaire automatiquement une fois que l’ouverture a été percé (Figure 2E).
5. Laisser le tube capillaire pour recueillir lentement CSF. Si la CSF a arrêté faisant ressortir, dessiner la seringue vers le haut un peu lentement (~ 50 µL) pour créer une pression négative plus dans le capillaire pour extraire la CSF.
   Remarque : Vous pouvez également le capillaire peut être doucement et lentement tiré hors du cerveau en utilisant les contrôles de micromanipulateur fine pour permettre le CSF s’écouler dans le tube capillaire à nouveau. Un montant total de ~ 10-15 µL de CSF (~ 3-4 cm dans le tube capillaire) prend ~ 10-30 min et parfois de 20 µL ou plus peuvent être collectées. Bien que pas absolument nécessaire, il est recommandé d’utiliser un coussin chauffant pendant la collecte de la CSF. Collection de la CSF a été réalisée à température ambiante (~ 23 ° C).
6. Une fois que le montant de CSF désirée est perçu, fermer le tube en déplaçant la vanne trois voies pour fermer (pour arrêter le dessin sur le LCR).
7. Retirez la seringue reliée au tuyau et ouvrez puis fermez le tube (pour créer pression égalisée dans le capillaire, les tubes et la zone en dehors du capillaire). Reconnecter la seringue avec le robinet à trois voies, mais ne pas plonger la seringue.
8. Retirez délicatement le capillaire de verre de la souris en utilisant le micromanipulateur.
9. Placer le tube de prélèvement (microtubes de 1,5 mL avec 1 µL de 20 x inhibiteur de protéase) sous le point aiguisé du verre capillaire.
10. Ouvrir le tube et plonger doucement la seringue : le CSF devrait s’écouler hors du capillaire et dans le tube de prélèvement.
11. Après le prélèvement, rapidement centrifuger (impulsion de spin pour 5 s à vitesse maximale en utilisant une centrifugeuse minie) le CSF à mélanger l’échantillon avec l’inhibiteur de protéase au bas de la tube de prélèvement.
    Remarque : Les échantillons de LCR peuvent être aliquotés et ensuite stockées pour une analyse ultérieure à-80 ° C. Le reste de la souris peut être disséqué pour les autres tissus, tels que le cerveau et la moelle épinière. La souris est toujours vivante à ce stade et donc sang peut également être collecté, si nécessaire.

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Résultats

Utilisant la procédure décrite ici (Figure 1 et Figure 2), la CSF immédiatement recueilli dans le tube capillaire doit être transparent (Figure 2E), pas rose ou rouge. S’il y a une rose à la teinte rouge vers le liquide recueilli dans le tube capillaire, puis il y a eu contamination par le sang.

Comme un exemple de l’application de...

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Discussion

Ce protocole décrit en détail une technique qui améliore le cours méthodes¹⁰ collection CSF pour minimiser la contamination du sang et permettre la collection abondante du CSF (en moyenne ~ 10-15 µL peuvent être obtenues) de souris. Lors de la rupture de la pointe capillaire, l’extrémité du capillaire ne doit pas être trop petite (comme à l’époque le CSF sera extrait de très lentement) ou trop gros (sera ne pas assez pour recueillir le CSF fine et tissus peuvent se loger dans le tu...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloral hydrate (used as anesthetic)	Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd.	30037517	CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors	66 vision technology	54002
Dissecting curved forceps	66 vision technology	53072
Dissecting straight forceps	66 vision technology	53070
Mouse adapter (with ear bars)	Made in-house.	N/A	Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope	Meiji Labax	Model 15381
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Magnetic base for micromanipulator	Kanetec	MB-K
Glass capillaries	World Precision Instruments	1B100-4
Micropipette puller	Sutter Instruments	Model P-1000
Syringes (1ml)	Tansoole	02024692	For 1ml.
Microtubes (1.5ml)	Axygen	MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free	Calbiochem	539134
Human Aβ42 ELISA kit	Invitrogen	KHB3441
Piping (teflon tubing)	World Precision Instruments	MMP-KIT	Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge	Tiangen Biotech	OSE-MC8
Cotton buds	Obtained from any household store/pharmacy.	N/A