Zika Virus específico diagnóstico del epítopo descubrimiento

Resumen

En este protocolo, se describe una técnica para descubrir Zika virus diagnóstico péptidos específicos utilizando microarrays de un péptido de alta densidad. Este protocolo readly puede ser adaptado para otras enfermedades infecciosas emergentes.

Resumen

Microarrays de alta densidad péptido permite detección de péptidos de más de 6 mil sobre un portaobjetos de microscopio estándar. Este método puede ser aplicado para el descubrimiento de medicamentos, identificación de objetivos terapéuticos y el desarrollo del diagnóstico. Aquí, presentamos un protocolo para descubrir Zika virus (ZIKV) diagnóstico péptidos específicos utilizando microarrays de un péptido de alta densidad. Una muestra de suero humano validada para infección por ZIKV fue incubada con una microarrays de alta densidad péptido que contiene la proteína ZIKV toda traducida en 3.423 única 15 lineal de aminoácidos (aa) los residuos con una superposición de residuos 14-aa impreso por duplicado. Coloración con los anticuerpos secundarios diferentes dentro de la misma matriz, detectamos péptidos que se unen a la inmunoglobulina M (IgM) y anticuerpos de inmunoglobulina G (IgG) en suero. Estos péptidos fueron seleccionados para experimentos de validación adicionales. En este protocolo, se describe la estrategia para diseñar, procesar y analizar un microarray de péptidos de alta densidad.

Introducción

Zika virus (ZIKV) diagnosis basada en los síntomas clínicos es desafiadora porque comparte vectores, distribución geográfica y los síntomas con Dengue y Chikungunya virus infección¹. Dado el riesgo de resultados adversos del embarazo en las mujeres infectadas con ZIKV durante el embarazo, es importante distinguir entre los 3 virus. Aunque las pruebas de diagnóstico moleculares actuales son específicas, son sólo útiles en sangre o saliva durante el relativamente corto período de infección aguda^2,3. Análisis serológicos son esenciales para el diagnóstico fuera de este período inicial de la infección⁴.

El desarrollo de un ensayo serológico específico ZIKV es difícil por dos razones: en primer lugar, los Zika antígenos que el sistema inmunológico humano responde a actualmente no se conocen; y secuencias de aminoácidos de flaviviruses segundo, conservado inducen reactividad cruzada del anticuerpo. Nuestro objetivo era descubrir el únicos péptidos específicos ZIKV a utilizarse en el diagnóstico. Se han desarrollado diferentes enfoques a las bibliotecas de péptidos pantalla cubriendo todas proteínas incluyendo fagos bacterianos, y mostrar la superficie de la levadura^{5,6,7,8,9, 10}. Nuestra estrategia era utilizar un microarray de péptidos de alta densidad que permite la rápida y de bajo costo alto rendimiento exámenes serológicos^11,12 y posteriormente los péptidos identificados se pueden utilizar para mejorar la corriente serológica ensayos para la detección de infección por ZIKV.

Este protocolo permite el descubrimiento de Zika virus diagnóstico péptidos específicos con un microarray de péptidos de alta densidad (figura 1). Los microarrays de alta densidad péptido fue producido usando la tecnología de impresión de láser de péptido. La secuencia de proteína entera ZIKV consisten en residuos de aminoácidos 3.423 basado en la cepa Polinesia francesa (GenBank: KJ776791.2), fue impreso en un portaobjetos de vidrio estándar en bloques de 15 residuos lineales con una superposición de 14 residuos de aminoácidos por duplicado para un total de 6.846 puntos del péptido. Además de los péptidos de secuencia de la proteína de Zika todos el microarray utiliza hemaglutinina de Influenza (HA) péptidos para controles internos.

Una Zika validado positivo muestra de suero obtenida del centro de Wadsworth (Albany, NY), se utilizó para identificar péptidos reactivas la inmunoglobulina G (IgG) y específicos de la inmunoglobulina M (IgM). Después de la incubación con la muestra durante la noche, el microarray fue teñido con un anticuerpo conjugado del fluorocromo secundario (anti-human IgM o anti-IgG humanas) y analizado en un escáner de microarreglos. Cuantificación de intensidades spot y péptido anotación fue realizada con un software específico suministrado por la misma compañía que fabricó el microarray.

Protocolo

Estos datos son parte de un estudio de investigación llevado a cabo en la Universidad de Odontología de la Universidad de Nueva York y fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de la New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Las muestras clínicas utilizadas en este estudio fueron muestras anónima utilizadas previamente para el diagnóstico y con el permiso de la Wadsworth Center de Nueva York Departamento del estado de salud, Albany, NY.

1. instalación de la corredera de Microarray ZIKV alta densidad péptido en una bandeja de incubación específica

1. Manejar lo portaobjetos de vidrio por los bordes con guantes sin polvo. Las dimensiones de la diapositiva de cristal son 75,4 mm 25,0 mm y 1 mm de espesor. Colocar el portaobjetos en la bandeja de incubación con la superficie de microarray hacia arriba.
2. Coloque la parte brillante del sello hacia abajo sobre la superficie impresa de microarrays. Para asegurar una buena posición, se superponen los orificios para tornillos del sello y la placa base.
3. Coloque la parte superior de la bandeja en el sello para crear una cámara de microarrays.
4. Asegure el portaobjetos en la bandeja apretando igualmente los tornillos uno después de otro con la mano en un patrón alterno a partir de la parte superior izquierda, seguida por la parte inferior derecha. Coloque la tapa de la bandeja de incubación.

2. detección de interacción antecedentes: La coloración el Microarray con anticuerpos secundarios

Nota: Utilice una pipeta para depositar las soluciones (buffers estándar y de bloqueo, anticuerpos secundarios diluidos) en la esquina de la cámara de microarrays.

1. Incubar el microarray con un tampón estándar (1 x 0,05% Tween 20 en tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4, filtrada con un filtro de 0.45 μm) (total de volumen de 2.000 μl/microarray) durante 15 min a temperatura ambiente (RT) en un agitador orbital a 140 rpm.
2. Quitar el tampón estándar por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays. Llenan los titulares diapositiva vacía de diapositivas en blanco para evitar la ruptura de la diapositiva microarray.
3. Bloquear el microarray con el tampón de bloqueo (volumen total de 2.000 μl/microarray) durante 60 min a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm.
4. Retire el amortiguador de bloqueo por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
5. Incubar el microarray con el anticuerpo secundario, fluorocromo de IgM anti-humano conjugada, diluido 1: 5.000 (volumen total de 2.000 μl/microarrays) en la tinción del almacenador intermediario (10% de bloqueo de la memoria del buffer estándar) por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital a 140 rpm.
6. Quitar el anticuerpo secundario por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
7. Lavar el microarray 3 x, 1 min por lavado con tampón estándar (volumen total de 2.000 μl/microarray a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Después de cada lavado, quite el buffer estándar de aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
8. Sumerja el portaobjetos 2 x en un búfer que sumerge recién preparado (1 mM Tris, pH 7.4), (volumen total de 200 mL).
9. Secar el microarray, aproximadamente 1 minuto, aspirando el líquido en exceso muy cuidadosamente desde la parte superior a la parte inferior de la diapositiva sin tocar la superficie del portaobjetos. Analizar la diapositiva en un lector de escáner de microarreglos.

3. exposición de los microarrays para suero

PRECAUCIÓN: Realice este paso en condiciones de seguridad de laboratorio, bioseguridad nivel 2 (BSL-2) debido a la potencial naturaleza contagiosa de las muestras de suero. Trabajo dentro de una clase II gabinete de seguridad biológica (BSC).

1. Inactivar la muestra del suero a 56 ° C por 30 min y centrifugar a 16.000 rcf durante 5 minutos a 4 ° C¹³.
   Nota: Utilice una pipeta para depositar las soluciones (coloración, buffer estándar y suero diluido) en la esquina de la cámara de microarrays.
2. Diluir la muestra de suero en tampón de tinción a partir de una dilución (volumen total de 2.000 μL/microarrays) de 1:1,000. Mantener a 4 ° C hasta su uso.
3. Incubar el microarray con el tampón de tinción (volumen total de 2.000 μL/microarray) durante 15 min a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm.
4. Eliminar el tampón de tinción por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
5. Incubar el microarray con la muestra de suero diluido durante la noche a 4 ° C en un agitador orbital a 140 rpm.
6. Retire la muestra de suero diluido por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
7. Lavar el microarray 3 x, 1 min por lavado con tampón estándar (volumen total de 2.000 μL/microarray a temperatura ambiente en un agitador orbital a 140 rpm. Después de cada lavado, quite el buffer estándar de aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.

4. la coloración con los anticuerpos secundarios y Control etiquetado

Nota: Utilice una pipeta para depositar las soluciones (tampones estándar, secundaria diluido y etiqueta anticuerpos) en la esquina de la cámara de microarrays.

1. Diluir el anticuerpo secundario en el tampón de tinción.
   Nota: Fluorocromo de uso anti-human IgM conjugado anticuerpo o anticuerpo anti-humana IgG fluorocromo conjugado a la dilución de 1:5,000 (volumen total de 2.000 μl/microarrays) en tampón de tinción.
2. Mezcla control etiqueta anticuerpo (monoclonal anti-HA fluorocromo conjugado) a una dilución de 1:1,000 (volumen total de 2 000 μl/microarrays) en tampón de tinción con anticuerpo secundario previamente diluido en tampón de tinción.
3. Incubar con el microarray por 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad en un agitador orbital a 140 rpm.
4. Retire la mezcla del secundario diluido y etiqueta anticuerpos por aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.
5. Lavar 3 veces con tampón estándar (volumen total de 2.000 μl/microarrays). Cada colada es de 1 min en un agitador orbital a 140 rpm. Después de cada lavado, quite el buffer estándar de aspiración con una pipeta de la esquina de la cámara de microarrays.

5. Análisis de Microarray

1. Sumerja el portaobjetos 2 x en búfer recién preparado de inmersión (1 mM Tris, pH 7.4) (volumen total de 200 mL).
2. Seque el microarray cuidadosamente, alrededor de 1 minuto, aspirando muy cuidadosamente desde la parte superior a la parte inferior de la diapositiva sin tocar la superficie del portaobjetos.
3. Análisis microarray siguiendo las instrucciones del escáner. Colocar el portaobjetos sobre el escáner con la superficie impresa hacia arriba.
4. Cree un nuevo proyecto y seleccione el área de exploración. Definir los parámetros del escáner como: resolución: 21 μm, intensidad para canales de 700 y 800 nm: 7.0, de análisis de calidad: media y desvío: 0.8.
5. Adquirir y guardar la imagen raw de exploración como un formato de archivo TIFF de 16 bits en escala de grises.

6. Análisis de microarrays utilizando un Software específico

1. Abra la imagen raw (imagen TIFF). Abra el archivo de la red matriz.
2. Alinee la red matriz para el análisis de imagen con teclas de flecha de ratón o el teclado del ordenador.
3. Seleccionad "cuantificar" en el software específico, que crea un archivo de lectura que contiene la intensidad de la señal de cada punto, el valor de fondo y la correspondiente secuencia de péptido.
   Nota: Este archivo de salida también se puede importar en un programa de hoja de cálculo para análisis adicional y graficar.

7. microarrays de almacenamiento

1. Almacenar los microarrays en la oscuridad a 4 ° C en gas libre de nitrógeno o argón oxígeno.

Resultados

Se muestran los resultados obtenidos con el protocolo descrito en la figura 2 y la figura 3. No hay interacciones de fondo fueron observadas cuando la tinción el microarray con secundario anti-humano IgM (datos no mostrados). Tinción con un anti-human IgM conjugado dio lugar a varias áreas sobre intensidades de fluorescencia verde de fondo, lo que indica la Unión de estos péptidos con IgM en la muestra de s...

Discusión

Hemos diseñado un protocolo de utilización de un microarray de alta densidad péptido que contiene la secuencia de proteína de virus Zika entera (cepa Polinesia francesa). El microarray fue fabricado por péptidos lineales superpuestas diferentes 3.423 impresión. Cada péptido fue 15 aminoácidos y variados por un único residuo de su vecino más cercano en la secuencia (es decir, superposición de residuos 14). Aunque se superpone más corto puede ser impreso, Mapeo epitopo es más preciso con traslapos má...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEPperCHIP Custom Peptide Microarray	PEPperPRINT	PPC.001.001	Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1	PEPperPRINT	PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)	PEPperPRINT	PPC.037.002
PepSLide Analyzer	PEPperPRINT	PSA.004.001	14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer	Rockland	MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800	Rockland	609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680	Thermo Scientific	SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System	LI-COR
Orbital shaker device	IKA	MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator	Adobe
Deltagraph	Redrocks