Zika Virus spécifique Diagnostic épitope découverte

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons une technique pour découvrir Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Ce protocole peut readly être adapté pour d’autres maladies infectieuses émergentes.

Résumé

Puces à haute densité de peptide permettent le criblage de plus de six mille peptides sur une lame de microscope standard unique. Cette méthode peut être appliquée pour la découverte de médicaments, identification des cibles thérapeutiques et l’élaboration du diagnostic. Nous présentons ici un protocole pour découvrir Zika virus (ZIKV) diagnostic des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray ». Un échantillon de sérum humain validé pour les infections ZIKV sont incubée avec un microarray peptides haute densité contenant l’ensemble des protéines ZIKV traduit en 3 423 unique 15 linéaire acides aminés (aa) les résidus avec un chevauchement de résidus 14-aa imprimé en double exemplaire. Coloration avec différents anticorps secondaires dans le même tableau, nous avons détecté des peptides qui lient l’immunoglobuline M (IgM) et les anticorps de l’immunoglobuline G (IgG) présents dans le sérum. Ces peptides ont été choisis pour plus des expériences de validation. Dans ce protocole, nous décrivons la stratégie suivie pour concevoir, traiter et analyser un microarray peptides haute densité.

Introduction

Diagnostic de virus (ZIKV) de zika basé sur les symptômes cliniques est difficile parce qu’elle partage des vecteurs, répartition géographique et des symptômes avec la Dengue et Chikungunya virus infection¹. Étant donné le risque de résultats défavorables de la grossesse chez les femmes infectées par ZIKV pendant la grossesse, il est important de distinguer entre les 3 virus. Bien que les tests de diagnostics moléculaires actuels sont spécifiques, ils sont seulement utiles dans le sang ou la salive au cours de la période relativement courte de l’infection aiguë^2,3. Analyses sérologiques sont essentiels pour le diagnostic en dehors de cette période initiale d’infection⁴.

Le développement d’un test sérologique spécifique de ZIKV est difficile pour deux raisons : tout d’abord, les antigènes de Zika répondant par le système immunitaire humain à ne sont pas actuellement connus ; et séquences d’acides aminés flavivirus seconde, conservée induisent la réactivité des anticorps. Notre objectif était de découvrir des peptides spécifiques ZIKV uniques à utiliser dans le diagnostic. Différentes approches ont été développées aux bibliothèques de peptide écran couvrant les protéines entières dont phage, bactérienne, et surface de levure afficher^{5,6,7,8,9, 10}. Notre stratégie a consisté à utiliser un microarray peptides haute densité qui permet des projections de sérologique rapide et peu coûteuse haut débit^11,12 , et par la suite les peptides identifiés peuvent être utilisés pour améliorer l’actuelle sérologique tests pour la détection de l’infection à ZIKV.

Ce protocole permet la découverte de Zika virus diagnostique des peptides spécifiques en utilisant un peptide haute densité « microarray » (Figure 1). La biopuce peptide haute densité a été produite à l’aide de la technologie d’impression laser peptide. La séquence entière de protéine ZIKV composé de 3 423 résidus d’acide aminé issu de la souche polynésienne Français (GenBank : KJ776791.2), a été imprimé sur une lame de verre standard dans des blocs de 15 résidus linéaires avec un chevauchement de 14 acides aminés en double exemplaire pour une total de 6 846 taches de peptide. Outre les peptides de séquence protéique Zika entières, la biopuce utilise hémagglutinine grippe peptides (HA) pour les contrôles internes.

Un Zika validé positive échantillon de sérum provenant de Wadsworth Center (Albany, NY), servait à identifier des immunoglobulines M (IgM) et peptides réactifs immunoglobuline G (IgG). Après incubation avec l’exemple du jour au lendemain, la biopuce était tachée avec un anticorps conjugué fluorochrome secondaire (anti-homme IgM ou anti-IgG humaines) et analysée sur un scanner de microarray. Quantification des intensités spots et annotation de peptide a été réalisée avec un logiciel spécifique fourni par la même société qui a fabriqué la biopuce.

Protocole

Ces données font partie d’une étude en cours menée au Collège de dentisterie de l’Université de New York et ont été approuvées par l’Institutional Review Board de la New York University School of Medicine, la CISR # H10-01894. Les échantillons cliniques utilisées dans cette étude ont été dépersonnalisées échantillons précédemment utilisés pour le diagnostic et avec la permission de la Wadsworth Center de New York State Department of Health, Albany, NY.

1. installation de la coulisse de Microarray peptides ZIKV haute densité dans un bac spécifique d’Incubation

1. Gérer la lame de verre par les bords à l’aide de gants sans poudre. Les dimensions de lame de verre sont 75,4 mm par 25,0 mm et 1 mm d’épaisseur. Placez la diapositive dans le bac de l’incubation avec la surface de la puce vers le haut.
2. Placez le côté brillant du joint vers le bas sur la surface imprimée de microarray. Afin d’assurer une bonne position, recouvrir les trous de vis de la garniture et la plaque de base.
3. Placer la partie supérieure de la barre d’État sur le sceau pour créer une chambre de microarray.
4. Fixez la lame dans la barre d’État en serrant tout aussi les vis moletées l’un après l’autre à la main dans un modèle alternatif à partir de l’angle supérieur gauche, suivie en bas à droite. Placez le couvercle du bac à l’incubation.

2. contexte Interaction Detection : Coloration la biopuce avec anticorps secondaires

Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (tampons standards et de blocage, des anticorps secondaires dilués) dans le coin de la chambre de microarray.

1. Incuber les puces avec un tampon standard (1 x en solution saline tamponnée au Phosphate (PBS), 0,05 % de Tween 20, pH 7,4, filtré avec un filtre de 0,45 µm) (volume total de 2 000 µL/microarray) pendant 15 min à température ambiante (RT) dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
2. Retirez le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray. Remplir porte-diapositive vide avec diapositives vides pour éviter la rupture de la diapositive de microarray.
3. Bloquer la biopuce avec le tampon de blocage (volume total de 2 000 µL/microarray) pendant 60 min à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
4. Retirer le tampon de blocage en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
5. Incuber le microarray avec l’anticorps secondaire, fluorochrome d’IgM anti-humaine conjuguée, dilué 1:5 000 (volume total de 2 000 µL/microarray) dans la coloration de la mémoire tampon (10 % bloquant un tampon en mémoire tampon standard) pendant 30 min à ta dans le noir dans un agitateur orbital à 140 tr/min.
6. Supprimer l’anticorps secondaire en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
7. Laver la biopuce 3 x, 1 min par lavage avec le tampon standard (volume total de 2 000 µL/microarray à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
8. Immerger la diapositive 2 x dans un tampon de plongement fraîchement préparé (1 mM Tris, pH 7,4), (volume total de 200 mL).
9. Sécher la biopuce soigneusement, pendant environ 1 min, en aspirant l’excès de liquide très soigneusement du haut vers le bas de la diapositive sans toucher la surface de glissement. Analyser la lame dans un scanner de microarray de lecteur.

3. exposition de la biopuce pour héberger le sérum

ATTENTION : Pour effectuer cette étape dans des conditions de sécurité de laboratoire, niveau de biosécurité 2 (BSL-2) en raison de la nature infectieuse potentielle de l’échantillons de sérum. Travailler au sein d’une classe II hotte de sécurité biologique (BSC).

1. Inactiver l’échantillon de sérum à 56 ° C pendant 30 min et centrifuger à 16 000 FRC pendant 5 min à 4 ° C¹³.
   Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (coloration, tampon standard et du sérum dilué) dans le coin de la chambre de microarray.
2. Diluer l’échantillon de sérum dans un tampon coloration commençant par une dilution de 1 : 1 000 (volume total de 2 000 μL/microarray). Gardez-le à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
3. Incuber la biopuce avec le tampon de coloration (volume total de 2 000 μL/microarray) pendant 15 min à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
4. Retirer le tampon de coloration en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
5. Incuber le microarray avec l’échantillon de sérum dilué pendant la nuit à 4 ° C dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
6. Retirer l’échantillon de sérum dilué en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
7. Laver la biopuce 3 x, 1 min par lavage avec le tampon standard (volume total de 2 000 μL/microarray à ta dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.

4. la coloration avec des anticorps de contrôle marqués et des anticorps secondaires

Remarque : Utilisez une pipette pour déposer les solutions (tampons standards, secondaire dilué et anticorps de l’étiquette) dans le coin de la chambre de microarray.

1. Diluer l’anticorps secondaire dans le tampon de coloration.
   NOTE : Fluorochrome de IgM anti-humain utilisation conjugués anticorps ou anti-humain fluorochrome conjugués anticorps à une dilution de 1:5,000 (volume total de 2 000 µL/microarray) dans un tampon de coloration.
2. Anticorps de Mix contrôle étiquette (anticorps monoclonal anti-HA fluorochrome conjuguées) à une dilution de 1 : 1 000 (volume total des 2 000 µL/microarray) tampon de coloration avec l’anticorps secondaire préalablement diluée en souillant la mémoire tampon.
3. Incubez avec la biopuce pendant 30 min à ta dans le noir dans un agitateur orbital à 140 tr/mn.
4. Retirez le mélange du secondaire dilué et anticorps de l’étiquette en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.
5. Laver 3 x avec un tampon standard (volume total de 2 000 µL/microarray). Chaque lavage est pendant 1 min dans un agitateur orbital à 140 tr/mn. Après chaque lavage, enlever le tampon standard en aspirant avec une pipette dans le coin de la chambre de microarray.

5. les biopuces à balayage

1. Immerger la diapositive 2 x dans le buffer à pendage fraîchement préparé (1 mM Tris, pH 7,4) (volume total de 200 mL).
2. Sécher la biopuce soigneusement, environ 1 min, en aspirant très soigneusement du haut vers le bas de la diapositive sans toucher la surface de glissement.
3. Scan de la biopuce, suivant les instructions du scanner. Placez la lame sur le scanner avec la surface imprimée vers le haut.
4. Créez un nouveau projet et sélectionnez la zone de lecture optique. Définir les paramètres du scanner comme : résolution : 21 µm, intensité pour 700 à 800 canaux nm : 7,0, qualité de numérisation : médium et Offset : 0,8.
5. Acquérir et enregistrez l’image raw scan sous un format de fichier TIFF 16 bits en niveaux de gris.

6. Microarray Analysis, à l’aide d’un logiciel spécifique

1. Ouvrez l’image brute (image TIFF). Ouvrez le fichier grid array.
2. Aligner la grille de tableau à l’image du scan avec les touches de flèche souris ou le clavier de l’ordinateur.
3. Sélectionnez « Quantifier la sélection » dans le logiciel spécifique, ce qui crée un fichier de lecture qui contient l’intensité du signal pour chaque tache, la valeur d’arrière-plan et la séquence peptidique correspondante.
   Remarque : Ce fichier de sortie peut également être importé dans un programme de feuille de calcul pour une analyse complémentaire et la représentation graphique.

7. stockage de « microarray »

1. Stocker la biopuce scellée dans l’obscurité à 4 ° C sous oxygène-gaz azote ou argon gratuit.

Résultats

Les résultats obtenus en utilisant le protocole décrit sont indiquées à la Figure 2 et la Figure 3. Aucune interaction de fond ont été notées en pré souillant la biopuce avec secondaire anti-homme IgM (données non présentées). Coloration avec un anti-homme IgM conjugué a entraîné plusieurs zones au-dessus des intensités de fluorescence vert fond indiquant la liaison de ces peptides avec IgM dans l...

Discussion

Nous avons conçu un protocole utilisant un microarray peptides haute densité contenant la séquence entière de la protéine du virus Zika (souche polynésienne Français). La biopuce a été fabriquée par impression 3 423 différents peptides linéaires qui se chevauchent. Chaque peptide était 15 acides aminés et variait selon qu’un résidu de son voisin le plus proche dans la séquence (p. ex., résidus 14 chevauchement). Bien que chevauche plus courtes peut être imprimés, la cartographie des épitope...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEPperCHIP Custom Peptide Microarray	PEPperPRINT	PPC.001.001	Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1	PEPperPRINT	PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)	PEPperPRINT	PPC.037.002
PepSLide Analyzer	PEPperPRINT	PSA.004.001	14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer	Rockland	MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800	Rockland	609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680	Thermo Scientific	SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System	LI-COR
Orbital shaker device	IKA	MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator	Adobe
Deltagraph	Redrocks