JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol için bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanarak Zika virüs belirli tanılama peptidler keşfetmek için bir teknik açıklar. Bu iletişim kuralı readly ortaya çıkan diğer bulaşıcı hastalıklar için adapte edilebilir.

Özet

Yüksek yoğunluklu peptid microarrays tek standart mikroskobu slaytta altı binden fazla peptidler tarama sağlar. Bu yöntem ilaç bulma, terapötik hedef tanımlama ve geliştirme için uygulanabilir teşhis. Burada, belirli Zika virüs (ZIKV) tanı peptidler yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanarak keşfetmek için bir protokol mevcut. ZIKV enfeksiyon 3,423 benzersiz 15 doğrusal amino asit (aa) kalıntıları bir 14-aa kalıntısı örtüşme ile tercüme tüm ZIKV protein içeren bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray ile inkübe için doğrulanmış bir insan serum örneği içinde yinelenen baskılı. Aynı dizi içinde farklı ikincil antikorlar ile boyama, immünglobulin M (IgM) ve immünoglobulin G (IgG) antikor serum içinde mevcut bağlayabilirsiniz peptidler tespit ettik. Bu peptidler daha fazla doğrulama denemeleri için seçildi. Bu protokol için tasarım, işlemek ve yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray çözümlemek için takip strateji tanımlarlar.

Giriş

Vektörel çizimler, dağılım ve belirtiler Dang Chikungunya virüsü enfeksiyonu ve1ile paylaşır çünkü Zika virüs (ZIKV) tanı klinik belirtiler dayalı meydan okuyor. Olumsuz gebelik çıktıları gebelik sırasında ZIKV ile enfekte kadınlarda için risk göz önüne alındığında, 3 virüs arasında ayırt etmek önemlidir. Geçerli moleküler tanı testleri belirli olmasına rağmen onlar sadece akut enfeksiyon2,3nispeten kısa dönemde kan ya da tükürük yararlıdır. Serolojik deneyleri enfeksiyon4bu başlangıç dönemi dışında tanı için gereklidir.

ZIKV belirli serolojik tahlil gelişimi iki nedenden dolayı zordur: ilk olarak, insan bağışıklık sistemi yanıt Zika antijenleri şu anda bilinmemektedir; ve ikincisi, korunmuş flaviviruses amino asit dizileri antikor olan teşvik. Hedefimiz işlem Tanı'daki kullanılmak üzere benzersiz ZIKV belirli peptidler keşfetmek oldu. FAJ, bakteriyel, dahil olmak üzere tüm proteinler kapsayan ekran peptid kitaplıkları için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir ve Maya yüzey görüntülemek5,6,7,8,9, 10. Hızlı ve ucuz yüksek üretilen iş serolojik gösterimleri11,12 izin veren bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanmak bizim strateji olmuştur ve daha sonra belirlenen peptidler geçerli serolojik geliştirmek için kullanılabilir deneyleri ZIKV enfeksiyon algılanması için.

Bu iletişim kuralı bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray (şekil 1) kullanarak Zika virüs belirli tanılama peptidler keşfi sağlar. Yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray peptid lazer baskı teknolojisi kullanılarak üretilmiştir. 3,423 amino asit kalıntıları eklenmesi ile oluşan tüm ZIKV protein sıra tabanlı Fransız Polinezya strain (GenBank: KJ776791.2), 14 amino asit kalıntılarında için yinelenen bir çakışma ile 15 doğrusal kalıntılarının bloklar halinde standart cam slayt üzerinde yazılı bir Toplam 6,846 peptid noktalar. Tüm Zika protein sıra peptidler yanı sıra Mikroarray grip hemagglutinin kullanır (HA) peptidler iç kontrol için.

Bir Zika olumlu Wadsworth Merkezi'nden (Albany, NY), elde edilen serum örneği belirli immünglobulin M (IgM) ve immünoglobulin G (IgG) Reaktif peptidler tanımlamak için kullanılan geçerliliği. Örnek ile gecede kuluçka sonra Mikroarray bir ikincil fluorochrome konjuge antikoru (Anti-insan IgM veya anti-insan IgG) ile lekeli ve Mikroarray tarayıcı üzerinde analiz. Miktar spot yoğunluklarda ve peptid ek açıklama Mikroarray üretilen aynı şirket tarafından sağlanan özel bir yazılım ile gerçekleştirildi.

Protokol

Bu veri, New York University College, diş hekimliği bir devam eden araştırma parçasıdır ve New York Üniversitesi Tıp Fakültesi, IRB kurumsal inceleme kurulca onaylanmış # H10-01894. Bu çalışmada kullanılan klinik örnekler daha önce kullanılan tanı ve izinle üzerinden Wadsworth Center, New York Dışişleri Bakanlığı Sağlık, Albany, NY de-tespit edildi.

1. ZIKV yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray slayt yükleme içinde belirli bir kuluçka tepsi

  1. Cam slayt pudrasız eldiven kullanarak kenarları tarafından ele. Cam slayt 75.4 mm 25.0 mm ve 1 mm kalın boyutlardır. Slaydı yukarı dönük olacak şekilde Mikroarray yüzeyli kuluçka tepsisine yerleştirin.
  2. Aşağıya doğru Mikroarray yazdırılan yüzeye karşı karşıya mühür parlak yanına koyun. İyi bir pozisyon sağlamak için vida deliklerini taban plakası ve mühür üst üste.
  3. Üst kısmındaki tepsiyi Mikroarray odası oluşturmak için mühür üzerine yerleştirin.
  4. Slayt içinde belgili tanımlık tepsi eşit taktıktan birbiri ardına sağ alt tarafından takip sol üst başlayarak bir alternatif model elle sıkılaştırma tarafından güvenli. Kuluçka tepsisi kapağını yerleştirin.

2. arka plan etkileşim algılama: Mikroarray ikincil antikorlar ile boyama

Not: bir pipet (Standart ve engelleme arabellekleri, seyreltilmiş ikincil antikorlar) çözümleri Mikroarray odası köşede yatırmak için kullanabilir.

  1. Standart arabelleği (0,45 µm filtre ile filtre 1 fosfat tamponlu tuz (PBS), %0.05 ara 20, pH 7.4, x) ile Mikroarray kuluçkaya (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray), oda sıcaklığında (RT) üzerinde bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde 15 dakika.
  2. Standart arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın. Boş slayt sahipleri Mikroarray slayt kırma önlemek için boş slaytlar ile doldurun.
  3. RT üzerinde bir orbital Çalkalayıcı 140 RPM, 60 dk için engelleme arabellek (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray) ile Mikroarray engelleyin.
  4. Engelleme arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.
  5. İkincil antikor, Birleşik Anti-insan IgM fluorochrome ile Mikroarray kuluçkaya, RT, 30 dk içinde bir orbital Çalkalayıcı 140, karanlık için (%10 standart arabellek arabellek engelleme) seyreltilmiş 1: boyama içinde 5.000 (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray) tampon d/dak.
  6. İkincil antikor Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.
  7. 3 Mikroarray yıkama x, 1 min başına yıkama ile standart arabellek (2.000 µL/Mikroarray RT bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde tarih itibariyle toplam hacmi. Her yıkama sonra standart arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.
  8. Slayt 2 sokmak içine taze hazırlanmış daldırma arabellek (1 mM Tris, pH 7,4) x, (toplam hacmi 200 mL).
  9. Mikroarray dikkatle, yaklaşık 1 dakika için slayt altına çok dikkatli bir şekilde üstten aşırı sıvı slayt yüzeyine dokunmadan alıyorum tarafından kuru. Slayt içinde a microarray tarayıcı okuyucu analiz.

3. Serum barındırması Mikroarray pozlama

Dikkat: Seviye 2 (BSL-2) serum örnekleri potansiyel bulaşıcı doğası nedeniyle laboratuvar güvenlik koşulları altında bu adımı gerçekleştirin. Bir sınıf II biyolojik güvenlik içinde dolap (BSC) çalışır.

  1. Serum örneği için 30 dk 56 ° C'de ve 16.000 rcf, santrifüj 4 ° C135 min için devre dışı bırakabilirsiniz.
    Not: bir pipet (boyama, standart tampon ve seyreltik serum) çözümleri Mikroarray odası köşede yatırmak için kullanabilir.
  2. Serum örneği boyama arabelleği 1:1,000 (toplam hacmi 2.000 μL/Mikroarray) seyreltme ile başlayan sulandırmak. 4 ° C'de kullanımı kadar devam et.
  3. RT bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde tarih itibariyle 15 dakika Mikroarray boyama arabelleği (toplam hacmi 2.000 μL/Mikroarray) ile kuluçkaya.
  4. Boyama arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.
  5. Gecede 4 ° C'de bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde üzerinde seyreltik serum örneği ile Mikroarray kuluçkaya.
  6. Seyreltik serum örneği tarafından Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum kaldırın.
  7. 3 Mikroarray yıkama x, 1 min başına yıkama ile standart arabellek (2.000 μL/Mikroarray RT bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde tarih itibariyle toplam hacmi. Her yıkama sonra standart arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.

4. ikincil antikorlar ve etiketli denetim antikorlar ile boyama

Not: bir pipet (Standart arabellekleri, seyreltilmiş ikincil ve etiket antikorlar) çözümleri Mikroarray odası köşede yatırmak için kullanabilir.

  1. İkincil antikor boyama arabellekte sulandırmak.
    Not: Kullanım Anti-insan IgM fluorochrome antikor veya anti-insan IgG fluorochrome konjuge antikor 1:5,000 (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray) Boyama arabellekte bir seyreltme, Birleşik.
  2. Mix kontrol etiket antikor (monoklonal anti-HA fluorochrome Birleşik), daha önce tampon boyama seyreltilmiş ikincil antikor ile tampon boyama içinde 1:1,000 (toplam hacmi 2 000 µL/Mikroarray) seyreltme.
  3. RT, 30 dk içinde karanlık bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde Mikroarray ile kuluçkaya.
  4. Seyreltilmiş ikincil ve etiket antikorlar tarafından Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum kaldırın.
  5. 3 x standart arabellek (toplam hacmi 2.000 µL/Mikroarray) ile yıkayın. Her yıkama 1dk bir orbital Çalkalayıcı 140 devirde üzerinde içindir. Her yıkama sonra standart arabellek Mikroarray odası köşesinden bir pipet ile alıyorum tarafından kaldırın.

5. Mikroarray tarama

  1. Slayt 2 sokmak x içine taze hazırlanmış daldırma arabellek (1 mM Tris, pH 7,4) (toplam hacmi 200 mL).
  2. Kuru Mikroarray dikkatle, çok dikkatli bir şekilde en baştan slayt köküne slayt yüzeyine dokunmadan alıyorum tarafından yaklaşık 1 dk,.
  3. Tarayıcının talimatları Mikroarray inceden inceye gözden geçirmek. Slayt tarayıcı üzerine yazdırılan yüzeye yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin.
  4. Yeni bir proje oluşturmak ve tarama alanını seçin. Tarayıcı parametreleri olarak belirleme: çözünürlük: 21 µm, 700 ve 800 nm kanallar için yoğunluğu: 7.0, tarama kalitesi: Orta ve uzaklık: 0.8.
  5. Elde etmek ve tarama raw görüntü bir 16-bit gri tonlamalı TIFF dosya biçiminde kaydedin.

6. Mikroarray belirli bir yazılım kullanarak çözümleme

  1. Ham görüntü (TIFF İmaj) açın. Dizi kılavuz dosyasını açın.
  2. Bilgisayar fare veya klavye ok tuşları ile tarama görüntü dizi kılavuza hizalayın.
  3. "Ölçmek seçimi" sinyal yoğunluğu her nokta için arka plan değeri ve karşılık gelen peptit dizisi içeren bir okuma dosyası oluşturur belirli yazılımında seçin.
    Not: Bu çıkış dosyası Ayrıca ek çözümleme ve grafik için bir elektronik tablo programına aktarılabilir.

7. Mikroarray depolama

  1. Oksijen serbest azot veya argon gazı altında 4 ° C'de karanlıkta mühürlü Mikroarray saklayın.

Sonuçlar

Açıklanan protokolü kullanılarak elde edilen sonuçları Şekil 2 ' de gösterilen ve şekil 3. Hiçbir arka plan etkileşimleri Mikroarray ikincil Anti-insan IgM (veri gösterilmez) ile önceden boyama zaman kaydedilmiştir. Anti-bir insanla IgM boyama eşlenik yukarıda arka plan yeşil Floresans yoğunluklarını, IgM ile Bu peptidler (Şekil 2) ana bilgisayar serum örneğind...

Tartışmalar

Biz tüm Zika virüs protein (Fransız Polinezya zorlanma) sıra içeren bir yüksek yoğunluklu peptid Mikroarray kullanan bir iletişim kuralı tasarlanmıştır. Mikrodizi yazdırma 3,423 farklı örtüşen doğrusal peptidler tarafından üretildi. Her peptid 15 amino asitler yapıldı ve onun en yakın komşu sırada (Yani, 14 kalıntı örtüşme) üzerinden tek bir kalıntı tarafından çeşitli. Daha kısa örtüştüğü yazdırılabilmesi için epitope eşleme ile uzun örtüştüğü daha kesin olsa ...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Geçerli destek NIDCRR44 DE024456 bir SBIR (küçük iş yenilik araştırma) yönetim ek grant tarafından sağlanır. NIDCR dışında gelişti NIDCR HIV verme doğrulayıcı bir bakım noktası kontrol kalkınma HIV U01 DE017855 verin. Biz minnetle kabul Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) onun teknik yardım ve tür destek için. Ayrıca NYU Langone Tıp Merkezi LI-COR Odyssey görüntüleme sistemi için teşekkür ediyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
PEPperCHIP Custom Peptide MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)PEPperPRINTPPC.037.002
PepSLide AnalyzerPEPperPRINTPSA.004.00114-days free License for Windows
Rockland Blocking bufferRocklandMB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800Rockland609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging SystemLI-COR
Orbital shaker deviceIKAMTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe IllustratorAdobe
DeltagraphRedrocks

Referanslar

  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
  15. Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojisay 130Mikroarraytaramatan peptidlerZikaimmunoassayIgMy ksek den ge erek IgG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır