JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Neste protocolo, descrevemos uma técnica para descobrir Zika vírus específico diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Este protocolo especialidade pode ser adaptado para outras doenças infecciosas emergentes.

Resumo

High-density do peptide microarrays permitir rastreio de peptídeos de mais de seis mil em um slide de microscopia simples padrão. Esse método pode ser aplicado para a descoberta de medicamentos, identificação do alvo terapêutico e desenvolvimento de diagnósticos. Aqui, apresentamos um protocolo para descobrir específico Zika vírus (ZIKV) diagnósticos peptides usando um microarray de peptídeo de alta densidade. Uma amostra de soro humano validada para infecção ZIKV foi incubada com um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a proteína inteira de ZIKV traduzida em 3.423 exclusivo 15 resíduos linear de aminoácidos (aa) com uma sobreposição de resíduo 14-aa impresso em duplicado. Coloração com anticorpos secundários diferentes dentro do mesmo conjunto, detectamos peptídeos que ligam a imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) anticorpos presentes no soro. Estes peptídeos foram selecionados para mais experiências de validação. Neste protocolo, descrevemos a estratégia adoptada para projetar, processar e analisar um microarray de peptídeo de alta densidade.

Introdução

Zika diagnóstico de vírus (ZIKV) com base nos sintomas clínicos é um desafio porque compartilha vetores, distribuição geográfica e sintomas de infecção de vírus Dengue e Chikungunya1. Dado o risco de resultados adversos da gravidez em mulheres infectadas com ZIKV durante a gravidez, é importante distinguir entre os 3 vírus. Embora os testes de diagnóstico moleculares atuais são específicos, eles são úteis apenas no sangue ou saliva durante o período relativamente curto de infecção aguda2,3. Ensaios sorológicos são essenciais para o diagnóstico fora deste período inicial de infecção4.

O desenvolvimento de um ensaio sorológico específico de ZIKV é um desafio por duas razões: primeiro, os antígenos Zika que o sistema imunológico humano responde não são atualmente conhecidos; e sequências de aminoácidos conservados, segundo flavivírus induzem reactividade cruzada do anticorpo. Nosso objetivo era descobrir exclusivos peptídeos ZIKV específicos para ser usado no diagnóstico. Diferentes abordagens têm sido desenvolvidos para bibliotecas de peptídeo de tela cobrindo toda proteínas incluindo fago, bacteriano, e superfície de levedura exibir5,6,7,8,9, 10. Nossa estratégia foi usar um microarray de peptídeo de alta densidade que permite rápida e barata elevado-throughput exames serológicos11,12 e posteriormente os peptídeos identificados podem ser usados para melhorar a corrente serológico ensaios para detecção da infecção por ZIKV.

Este protocolo permite a descoberta de Zika vírus específico diagnósticos peptídeos usando um microarray de peptídeo de alta densidade (Figura 1). O peptídeo high-density microarray foi produzido usando a tecnologia de impressão laser do peptide. A sequência de proteína inteira ZIKV constituído por resíduos de aminoácidos 3.423 baseia a estirpe da Polinésia francesa (GenBank: KJ776791.2), foi impresso em um slide de vidro padrão em blocos de 15 resíduos lineares com uma sobreposição de 14 resíduos de aminoácidos em duplicado para um total de 6.846 pontos de peptídeo. Além dos peptídeos de sequência de proteínas Zika todo, o microarray utiliza hemaglutinina gripe (HA) de peptídeos para controles internos.

Uma Zika validado positivos Obtida de Wadsworth Center (Albany, NY), de amostra de soro foi usada para identificar específicas imunoglobulina M (IgM) e imunoglobulina G (IgG) reativos peptídeos. Após a incubação com a amostra durante a noite, o microarray foi manchada com um anticorpo conjugado fluorocromo secundário (anti-humano IgM ou IgG anti-humano) e analisado em um scanner de microarray. Quantificação de intensidades local e anotação de peptídeo foi realizada com um software específico fornecido pela mesma empresa que fabricava o microarray.

Protocolo

Esses dados fazem parte de um estudo de investigação em curso realizado na New York University College of Dentistry e foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da New York University School of Medicine, IRB # H10-01894. Amostras clínicas utilizadas neste estudo foram identificadas de amostras anteriormente utilizadas para o diagnóstico e com a permissão de Wadsworth Center de Nova York Secretaria de estado da saúde, Albany, NY.

1. instalar o ZIKV de alta densidade de peptídeo Microarray deslize em uma bandeja de incubação específica

  1. Lidar com a lâmina de vidro pelas bordas usando luvas sem pó. As dimensões do slide de vidro são 75,4 mm 25,0 mm e 1 mm de espessura. Coloque o slide na bandeja de incubação com a superfície de microarray virada para cima.
  2. Coloque o lado brilhante do selo virado para baixo sobre a superfície impressa do microarray. Para garantir uma boa posição, sobrepõem-se os furos de parafuso do selo e a placa de base.
  3. Coloque a parte superior da bandeja para o selo para criar uma câmara de microarray.
  4. Fixe o slide na bandeja apertando igualmente os parafusos um após o outro com a mão em um padrão alternado, começando do canto superior esquerdo, seguido pelo canto inferior direito. Coloque a tampa da bandeja de incubação.

2. antecedentes interação deteção: Manchando o Microarray com anticorpos secundários

Nota: Utilize uma pipeta para depositar as soluções (padrão e bloqueio buffers, diluídos anticorpos secundários) no canto da câmara de microarray.

  1. Incubar o microarray com um buffer padrão (1 x salina tamponada fosfato (PBS), 0,05% de Tween 20, pH 7,4, filtrada com um filtro de 0,45 µm) (total de volume de 2.000 µ l/microarray) durante 15 minutos à temperatura ambiente (RT) em um agitador orbital a 140 rpm.
  2. Retire o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray. Preencha os titulares slide vazio com slides em branco para evitar a quebra da corrediça microarray.
  3. Bloquear o microarray com o tampão de bloqueio (volume total de 2.000 µ l/microarray) por 60 min em RT em um agitador orbital a 140 rpm.
  4. Retire o tampão de bloqueio por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
  5. Incubar o microarray com anticorpo secundário, fluorocromo de IgM anti-humano conjugado, diluído 1: 5.000 (volume total de 2.000 µ l/microarray) de coloração, o tampão (10% de bloqueio de buffer de buffer padrão) por 30 min em RT no escuro em um agitador orbital 140 rpm.
  6. Remova o anticorpo secundário por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
  7. Lave o microarray 3 x, 1 min por lavagem com tampão-padrão (volume total de 2.000 µ l/microarray em RT em um agitador orbital a 140 rpm. Depois de cada lavagem, remova o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
  8. Mergulhe a lâmina 2 x em um buffer de imersão recentemente preparado (1 mM Tris, pH 7,4), (volume total de 200 mL).
  9. Seca o microarray cuidadosamente, por cerca de 1 min, aspirando o excesso de líquido com muito cuidado da parte superior à parte inferior do slide sem tocar a superfície do slide. Analise o slide em um scanner leitor de microarray.

3. exposição do Microarray para hospedar o soro

Atenção: Execute esta etapa em condições de segurança do laboratório, nível de biossegurança 2 (BSL-2) devido à natureza infecciosa potencial das amostras de soro. Trabalhar dentro de uma classe II de segurança biológica (CSB).

  1. Inativar a amostra de soro a 56 ° C por 30 min e centrifugar rcf 16.000 por 5 min a 4 ° C13.
    Nota: Utilize uma pipeta para depositar as soluções (coloração, tampão-padrão e soro diluído) no canto da câmara de microarray.
  2. Dilua a amostra de soro em coloração buffer, começando com uma diluição de (volume total de 2.000 μL/microarray) 1:1,000. Mantê-lo em 4 ° C até o uso.
  3. Incube o microarray com buffer de coloração (volume total de 2.000 μL/microarray) por 15 min em RT em um agitador orbital a 140 rpm.
  4. Remova o buffer de coloração por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
  5. Incube o microarray com a amostra de soro diluído durante a noite a 4 ° C, em um agitador orbital a 140 rpm.
  6. Retire a amostra de soro diluído por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
  7. Lave o microarray 3 x, 1 min por lavagem com tampão-padrão (volume total de 2.000 μL/microarray em RT em um agitador orbital a 140 rpm. Depois de cada lavagem, remova o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.

4. coloração com anticorpos secundários e anticorpos controle rotulada

Nota: Utilize uma pipeta para depositar as soluções (buffers padrão, secundário diluído e anticorpos rótulo) no canto da câmara de microarray.

  1. Dilua o anticorpo secundário no buffer de coloração.
    Nota: O fluorocromo de IgM anti-humano uso conjugado anticorpo ou anticorpo conjugado anti-humano IgG fluorocromo a uma diluição de 1:5,000 (volume total de 2.000 µ l/microarray) no buffer de coloração.
  2. Anticorpo de rótulo de controle de mistura (anticorpo monoclonal anti-HA conjugados a fluorocromo) a uma diluição de 1:1,000 (volume total de 2 000 µ l/microarray) na coloração de tampão com anticorpo secundário previamente diluído em tampão de coloração.
  3. Incube com o microarray por 30 min em RT no escuro em um agitador orbital a 140 rpm.
  4. Retire a mistura de secundário diluído e anticorpos rótulo por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.
  5. Lave 3x com tampão-padrão (volume total de 2.000 µ l/microarray). Cada lavagem é por 1 min em um agitador orbital a 140 rpm. Depois de cada lavagem, remova o tampão-padrão por aspiração com uma pipeta do canto da câmara de microarray.

5. Microarray digitalização

  1. Mergulhe a lâmina 2 x em buffer mergulhando recentemente preparada (1 mM Tris, pH 7,4) (volume total de 200 mL).
  2. Seque o microarray cuidadosamente, em torno de 1 min, aspirando cuidadosamente do topo para o fundo do slide sem tocar a superfície do slide.
  3. Digitalize o microarray, seguindo as instruções do scanner. Coloque o slide para o scanner com a superfície impressa voltada para cima.
  4. Crie um novo projeto e selecione a área de digitalização. Definir os parâmetros do scanner como: resolução: 21 µm, intensidade para canais de 700 e 800 nm: 7.0, qualidade de digitalização: médio e deslocamento: 0.8.
  5. Adquirir e salve a imagem raw de varredura como um formato de arquivo TIFF em tons de cinza de 16 bits.

6. Microarray Analysis usando um Software específico

  1. Abra a imagem raw (imagem TIFF). Abra o arquivo de grade do matriz.
  2. Alinhe a grade de matriz para a varredura de imagem com as teclas de seta do mouse ou o teclado do computador.
  3. Selecione "Quantificar seleção" no software específico, que cria um arquivo de leitura que contém a intensidade do sinal para cada local, o valor de plano de fundo e a correspondente sequência de peptídeo.
    Nota: Este arquivo de saída também pode ser importado para um programa de planilha para análise adicional e gráficos.

7. Microarray armazenamento

  1. Armazene o microarray selado no escuro a 4 ° C, sob livre gás nitrogênio ou argônio oxigênio.

Resultados

Os resultados obtidos utilizando o protocolo descrito são mostrados na Figura 2 e Figura 3. Não há interações de fundo foram observadas quando pre-manchando o microarray com anti-humano secundário IgM (dados não mostrados). Coloração com um anti-humano IgM conjugado resultou em diversas áreas acima as intensidades de fluorescência verde de fundo, indicando a ligação destes peptídeos com IgM na amos...

Discussão

Nós projetamos um protocolo utilizando um microarray de peptídeo de alta densidade contendo a toda sequência de proteína vírus Zika (estirpe da Polinésia francesa). O microarray foi fabricado pela impressão 3.423 diferentes sobreposição peptídeos lineares. Cada peptídeo foi 15 aminoácidos e variados por apenas um resíduo de seu vizinho mais próximo na sequência (ou seja, sobreposição de resíduo 14). Embora sobreposições mais curtas podem ser impressos, mapeamento de epítopo é mais preciso c...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Suporte atual é fornecido por uma concessão de suplemento administrativo SBIR (pequenos negócios inovação pesquisa) do NIDCRR44 DE024456. Concessão de NIDCR HIV que evoluiu fora NIDCR conceder U01 DE017855 para o desenvolvimento de um confirmação diagnóstico point-of-care para HIV. Reconhecemos com gratidão Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) para a assistência técnica e apoio gentil. Agradecemos também a NYU Langone Medical Center para o LI-COR Odyssey Imaging System.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
PEPperCHIP Custom Peptide MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)PEPperPRINTPPC.037.002
PepSLide AnalyzerPEPperPRINTPSA.004.00114-days free License for Windows
Rockland Blocking bufferRocklandMB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800Rockland609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging SystemLI-COR
Orbital shaker deviceIKAMTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe IllustratorAdobe
DeltagraphRedrocks

Referências

  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
  15. Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Imunologiaedi o 130Microarrayelevado throughput screeningimunoensaio de diagn stico pept deosZikaIgMIgG

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados