Zika-Virus spezifische diagnostische Epitop Entdeckung

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik, um Zika Virus spezifische diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid-Microarray entdecken. Dieses Protokoll kann für andere neu auftretende Infektionskrankheiten readly angepasst werden.

Zusammenfassung

High-Density-Peptid Microarrays erlauben Screening von mehr als sechs tausend Peptide auf einer einzigen Standard-Mikroskopie-Folie. Diese Methode kann für Arzneimittelforschung, therapeutischen Target-Identifizierung und Entwicklung von Diagnostika. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um spezifische Zika Virus (ZIKV) diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid-Microarray entdecken. Eine menschliche Serumprobe für ZIKV Infektion mit einer High-Density-Peptid Microarray enthält das gesamte ZIKV Protein übersetzt 3.423 einzigartige 15 linear (aa) Aminosäureresten mit einer 14-aa Rückstände Überlappung inkubiert wurde validiert in zweifacher Ausfertigung gedruckt. Färbung mit verschiedenen Sekundärantikörper innerhalb desselben Arrays, erkannt wir Peptide, die Bindung an Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG) Antikörper im Serum vorhanden. Diese Peptide wurden für weitere Validierung Experimente ausgewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Strategie zu entwerfen, zu verarbeiten und ein High-Density-Peptid-Microarray zu analysieren.

Einleitung

Zika Virus (ZIKV) Diagnose anhand der klinischen Symptome ist schwierig, weil es Vektoren, geographische Verbreitung und Symptome mit Dengue-Fieber und Chikungunya-Virus-Infektion¹teilt. Angesichts des Risikos für unerwünschte Schwangerschaft Ergebnisse bei Frauen während der Schwangerschaft mit ZIKV infiziert, ist es wichtig, zwischen den 3 Viren zu unterscheiden. Obwohl die aktuellen molekularer diagnostischer Tests spezifisch sind, sind sie nur während der relativ kurzen Zeit der akuten Infektion^2,3nützlich im Blut oder Speichel. Serologische Tests sind unerlässlich für die Diagnose außerhalb dieser Phase der Infektion⁴.

Die Entwicklung eines spezifischen serologischen ZIKV-Assays ist anspruchsvoll, aus zwei Gründen: Erstens der Zika-Antigene, die auf das menschliche Immunsystem reagiert sind derzeit nicht bekannt; und zweitens konservierten Flaviviren Aminosäuresequenzen veranlassen Antikörper Kreuzreaktivität. Unser Ziel war es, entdecken einzigartige ZIKV spezifische Peptide in der Diagnostik verwendet werden. Verschiedene Ansätze wurden entwickelt, um einen Bildschirm Peptid Bibliotheken für ganze Proteine einschließlich Phagen, bakterielle, und Hefe Oberfläche display^{5,6,7,8,9, 10}. Unsere Strategie war es, ein High-Density-Peptid-Microarray verwenden, die schnelle und kostengünstige Hochdurchsatz-serologische Untersuchungen^11,12 erlaubt und anschließend die identifizierten Peptide können zur Verbesserung der serologischen Assays für die Erkennung von ZIKV Infektion.

Dieses Protokoll ermöglicht die Entdeckung von Zika Virus spezifische diagnostische Peptide mit einer High-Density-Peptid Microarray (Abbildung 1). Die High-Density-Peptid-Microarray wurde mit der Peptid-Laserdrucktechnologie hergestellt. Die gesamte ZIKV Proteinsequenz bestehend aus 3.423 Aminosäurereste basierend auf dem französischen polynesischen Stamm (GenBank: KJ776791.2), wurde gedruckt auf einer standard-Glas-Folie in Blöcken von 15 lineare Rückstände mit einer Überlappung von 14 Aminosäurereste in doppelter Ausführung für eine insgesamt 6.846 Peptid Flecken. Neben der gesamten Zika Protein Sequenz Peptide, nutzt die Microarray Influenza Hämagglutinin (HA) Peptide für interne Kontrollen.

Ein Zika bestätigt positive Serumprobe gewonnenen Wadsworth Center (Albany, NY), verwendet wurde, um spezifische Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG) reaktive Peptide zu identifizieren. Nach Inkubation mit der Probe über Nacht, war die Microarray gebeizt mit einem sekundären Fluorochrom konjugierten Antikörper (Anti-Human IgM oder Anti-Human-IgG) und auf einem Microarray Scanner analysiert. Quantifizierung der spot Intensitäten und Peptid-Annotation erfolgte mit einer speziellen Software zur Verfügung gestellt von der gleichen Firma, die die Microarray hergestellt.

Protokoll

Diese Daten sind ein Teil einer laufenden Forschungsstudie an der New York University College of Dentistry und wurden von der Institutional Review Board der New York University School of Medicine, IRB genehmigt # H10-01894. In dieser Studie verwendete klinischen Proben wurden anonymisierte Proben zuvor verwendet, für die Diagnose und mit Erlaubnis von Wadsworth Center der New York State Department of Health, Albany, NY.

1. Installation der ZIKV High-Density-Peptid Microarray Slide in einem bestimmten Fach Inkubation

1. Die Glas-Folie an den Rändern mit puderfreien Handschuhen zu behandeln. Die Glas-Folie-Dimensionen sind 75,4 mm 25,0 mm und 1 mm dick. Legen Sie die Folie mit der Microarray-Oberfläche nach oben in das Fach der Inkubation.
2. Legen Sie die glänzende Seite der Dichtung mit Blick nach unten auf die Microarray bedruckte Oberfläche. Um eine gute Position zu gewährleisten, überschneiden sich die Schraubenlöcher der Dichtung und der Bodenplatte.
3. Legen Sie das Oberteil des Behälters auf die Dichtung zu eine Microarray-Kammer schaffen.
4. Sichern Sie die Folie in das Fach durch anziehen ebenso die Rändelschrauben nacheinander von Hand in einem wechselnden Muster, ausgehend von der oberen linken Ecke, gefolgt von unten rechts. Setzen Sie den Deckel des Fachs Inkubation.

2. Hintergrund Interaktion Erkennung: Färbung der Microarray mit Sekundärantikörper

Hinweis: Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösungen (standard und blockierende Puffer, verdünnte Sekundärantikörper) in der Ecke der Microarray-Kammer zu hinterlegen.

1. Microarray mit einem standard-Puffer (1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,05 % Tween 20, pH 7,4, mit einem 0,45 µm-Filter gefiltert) inkubieren (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) für 15 min bei Raumtemperatur (RT) auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min.
2. Entfernen Sie die standard-Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer. Füllen Sie leere Objekthalter mit leeren Folien, brechen die Microarray-Folie zu verhindern.
3. Die Microarray mit dem blockierenden Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) für 60 min bei RT auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min zu blockieren.
4. Entfernen Sie die blockierenden Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.
5. Inkubieren Microarray mit sekundären Antikörper, Anti-Human IgM Fluorochrom konjugiert, verdünnt 1: 5.000 (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) in der Färbung-Puffer (10 % Puffer im standard Puffer blockiert) für 30 min bei RT in der Dunkelheit auf einem Orbitalschüttler bei 140 u / min.
6. Entfernen Sie den sekundären Antikörper durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.
7. Waschen Sie die Microarray 3 X, 1 min pro Waschgang mit standard-Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray bei RT auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min. Entfernen Sie nach jedem Waschen die standard Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.
8. Tauchen Sie die Folie 2 X in einen frisch zubereiteten Dipp Puffer (1 mM Tris, pH 7,4), (Gesamtvolumen von 200 mL).
9. Trocknen der Microarray, für ca. 1 min, durch Absaugen überschüssigen Flüssigkeit sehr sorgfältig von oben nach unten von der Folie ohne Berührung der Oberfläche der Folie. Analysieren Sie die Folie in einem Microarray Scanner Reader.

(3) Exposition von Microarray Serum hosten

Achtung: Führen Sie diesen Schritt unter Laborbedingungen Sicherheit, Biosafety Level 2 (BSL-2) aufgrund der potenziellen infektiöse Natur der Serumproben. Arbeiten Sie innerhalb einer Klasse II biologischen Sicherheitsschrank (BSC).

1. Serumprobe bei 56 ° C für 30 min und Zentrifuge bei 16.000 Rcf für 5 min bei 4 ° C¹³zu inaktivieren.
   Hinweis: Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösungen (Färbung, standard-Puffer und verdünnte Serum) in der Ecke der Microarray-Kammer zu hinterlegen.
2. Verdünnen Sie Serumprobe in Färbung Puffer, beginnend mit einer 1:1,000 (Gesamtvolumen von 2.000 μL/Microarray) Verdünnung. Halten Sie es bei 4 ° C bis zur Verwendung.
3. 15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min die Microarray mit der Färbung Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 μL/Microarray) inkubieren.
4. Entfernen Sie die Färbung Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.
5. Inkubieren Sie die Microarray mit verdünnte Serumprobe über Nacht bei 4 ° C auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min.
6. Entfernen Sie die verdünnte Serumprobe durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.
7. Waschen Sie die Microarray 3 X, 1 min pro Waschgang mit standard-Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 μL/Microarray bei RT auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min. Entfernen Sie nach jedem Waschen die standard Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.

4. Färben mit Sekundärantikörper und beschrifteten Kontrolle Antikörper

Hinweis: Verwenden Sie eine Pipette, um die Lösungen (standard-Puffer, verdünnte Sekundar- und Label-Antikörper) in der Ecke der Microarray-Kammer zu hinterlegen.

1. Verdünnen Sie den sekundäre Antikörper in der Färbung Puffer.
   Hinweis: Verwendung Anti-Human IgM Fluorochrom konjugierten Antikörper oder Anti-Human-IgG Fluorochrom konjugierten Antikörper bei einer Verdünnung von 1:5,000 (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) in Färbung Puffer.
2. Mix-Steuerelement Label Antikörper (monoklonalen Anti-HA Fluorochrom konjugiert) bei einer Verdünnung von 1:1,000 (Gesamtvolumen von 2 000 µL/Microarray) in der Färbung Puffer mit sekundären Antikörper, die zuvor in der Färbung Puffer verdünnt.
3. Mit dem Microarray für 30 min bei RT in der Dunkelheit auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min inkubieren.
4. Entfernen Sie die Mischung aus verdünnten Sekundar- und Label Antikörper durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.
5. 3 X mit standard-Puffer (Gesamtvolumen von 2.000 µL/Microarray) waschen. Jedes waschen ist für 1 min auf einem Orbitalschüttler bei 140 u/min. Entfernen Sie nach jedem Waschen die standard Puffer durch Absaugen mit einer Pipette aus der Ecke der Microarray-Kammer.

(5) Microarray Scannen

1. Tauchen Sie die Folie 2 X in frisch zubereiteten Dipp Puffer (1 mM Tris, pH 7,4) (Gesamtvolumen von 200 mL).
2. Trocknen der Microarray, ca. 1 min, durch Absaugen sehr sorgfältig von oben nach unten von der Folie ohne Berührung der Oberfläche der Folie.
3. Scannen Sie die Microarray gemäß den Anweisungen des Scanners. Legen Sie die Folie auf den Scanner mit der bedruckten Oberfläche nach oben.
4. Erstellen Sie ein neues Projekt und wählen Sie den Scanbereich. Scannerparameter als einstellen: Auflösung: 21 µm, Intensität für 700 und 800 nm Kanäle: 7.0, Scan-Qualität: Medium und Offset: 0,8.
5. Erwerben und die Scan-raw-Bild als ein 16-Bit-Graustufen TIFF-Dateiformat speichern.

(6) Microarray-Analyse unter Verwendung einer speziellen Software

1. Öffnen Sie die raw-Bild (TIFF-Bild). Öffnen Sie die Array-Raster-Datei.
2. Array-Raster, um das Bild mit der Computer-Maus oder Tastatur-Pfeiltasten ausrichten.
3. Wählt "quantifizieren" die spezifische Software, die eine Auslesen-Datei erstellt, die die Signalstärke für jeden Fleck, den Hintergrundwert und die entsprechenden Peptidsequenz enthält.
   Hinweis: Diese Ausgabe-Datei kann auch in ein Tabellenkalkulations-Programm für die weitere Analyse und grafische Darstellung importiert werden.

(7) Microarray-Lagerung

1. Speichern Sie die Microarray versiegelt im Dunkeln bei 4 ° C unter Sauerstoff freien Stickstoff oder Argon Gas.

Ergebnisse

Die erzielten Ergebnisse mit dem beschriebenen Protokoll sind in Abbildung 2 dargestellte und Abbildung 3. Keine Hintergrund-Wechselwirkungen festgestellt wurden, wenn die Microarray mit sekundären Anti-Human IgM (Daten nicht gezeigt) Pre-Färbung. Färbung mit einem Anti-Human IgM führte Konjugat in mehreren Bereichen über dem Hintergrund grün fluoreszieren Intensitäten, unter Angabe der Bindung dieser Pept...

Diskussion

Wir entwarfen ein Protokoll mit Hilfe einer High-Density-Peptid Microarray enthält die gesamte Zika Virus Proteinsequenz (Französisch Polynesischen Stamm). Die Microarray wurde von Druck 3.423 anderen überlappenden lineare Peptide hergestellt. Jedes Peptid war 15 Aminosäuren und durch nur einen Rückstand von seinem nächsten Nachbarn in der Reihenfolge (d.h. 14 Rückstände Überlappung) variiert. Obwohl kürzere Überschneidungen gedruckt werden können, ist Epitop Mapping präziser mit längeren Überschn...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
PEPperCHIP Custom Peptide Microarray	PEPperPRINT	PPC.001.001	Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1	PEPperPRINT	PPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)	PEPperPRINT	PPC.037.002
PepSLide Analyzer	PEPperPRINT	PSA.004.001	14-days free License for Windows
Rockland Blocking buffer	Rockland	MB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800	Rockland	609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680	Thermo Scientific	SA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging System	LI-COR
Orbital shaker device	IKA	MTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe Illustrator	Adobe
Deltagraph	Redrocks