JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לגלות Zika וירוס מסוים אבחון פפטידים באמצעות microarray פפטיד בצפיפות גבוהה. פרוטוקול זה יכול להתאים readly למחלות זיהומיות מתעוררים אחרים.

Abstract

מיקרו-מערכים פפטיד בצפיפות גבוהה לאפשר הקרנה של יותר מ 6,000 פפטידים בשקופית מיקרוסקופ סטנדרט יחיד. בשיטה זו יכול להיות מיושם עבור גילוי תרופות, זיהוי מטרה טיפולית פיתוח של אבחון. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגלות ספציפי Zika וירוס (ZIKV) אבחון פפטידים באמצעות microarray פפטיד בצפיפות גבוהה של... מדגם בנסיוב אדם מאומת על זיהום ZIKV, נדגרה עם microarray פפטיד בצפיפות גבוהה המכילה חלבון ZIKV כולו מתורגם 3,423 ייחודי 15 חומצת אמינו ליניארי (aa) שאריות עם חפיפה 14-aa שאריות מודפס כפילויות. צביעת עם נוגדנים משניים שונים בתוך המערך אותו, גילינו פפטידים לכרוך אימונוגלובולינים ז (IgM), נוגדנים אימונוגלובולין G (IgG) נוכח סרום. פפטידים אלה נבחרו לניסויים אימות נוסף. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את האסטרטגיה המיושמת כדי לעצב, לעבד, לנתח microarray פפטיד בצפיפות גבוהה.

Introduction

Zika וירוס (ZIKV) האבחנה מבוססת על סימפטומים קליניים הוא מאתגר כי היא חולקת וקטורים תפוצה גאוגרפית, הסימפטומים עם קדחת דנגה, Chikungunya וירוס זיהום1. לאור הסיכון לתוצאות שליליות הריון בנשים נגוע ZIKV במהלך ההריון, חשוב להבחין בין 3 וירוסים. בדיקות האבחון המולקולרי הנוכחי אמנם ספציפיים, הם שימושיים רק דם או רוק בתקופה קצרה יחסית של דלקת חריפה2,3. מבחני סרולוגית חיוניים לצורך אבחון מחוץ תקופה ראשונית של זיהום4.

הפיתוח של ZIKV assay סרולוגית ספציפי הוא מאתגר משתי סיבות: ראשית, אנטיגנים Zika אשר מערכת החיסון האנושית מגיבה לא כיום ידועים; רצפים של חומצות אמיניות flaviviruses שנית, שנשמרת זירוז אשיג נוגדן. המטרה שלנו הייתה לגלות ייחודי ZIKV פפטידים מסוימים כדי לשמש אבחון. גישות שונות פותחו לספריות פפטיד המסך מכסה כל החלבונים כולל phage, חיידקי, ולהציג שמרים משטח5,6,7,8,9, 10. האסטרטגיה שלנו היה להשתמש microarray פפטיד בצפיפות גבוהה המתיר מהיר וזול תפוקה גבוהה סרולוגית הקרנות11,12 , לאחר מכן פפטידים מזוהה יכול לשמש כדי לשפר את זרם סרולוגית מבחני לגילוי של זיהום ZIKV.

פרוטוקול זה מאפשר גילוי Zika וירוס מסוים אבחון פפטידים באמצעות microarray של פפטיד בעל צפיפות גבוהה (איור 1). Microarray פפטיד בצפיפות גבוהה הופק באמצעות הטכנולוגיה להדפסת לייזר פפטיד. הרצף כולו ZIKV חלבון המורכב שאריות חומצה אמינית 3,423 בהתבסס על המתח פולינזיה הצרפתית (GenBank: KJ776791.2), הודפסה על משטח זכוכית רגילה בבלוקים של 15 שאריות ליניארי עם חפיפה בין שאריות חומצה אמינית 14 כפילויות עבור סך נקודות פפטיד 6,846. בנוסף כולו Zika חלבון רצף פפטידים, מנצל microarray שפעת hemagglutinin (HA) פפטידים עבור פקדים פנימיים.

Zika לאמת חיובי דגימת נסיוב שהושג ממרכז Wadsworth (אולבני, ניו יורק), היה משמש לזיהוי ספציפי אימונוגלובולינים ז (IgM), פפטידים תגובתי אימונוגלובולין G (IgG). לאחר המקננת עם הדגימה בן לילה, microarray מוכתם של נוגדן fluorochrome משני מצומדת (האנטי-האדם IgM או אנטי-אנושית IgG), והוא ניתח על סורק microarray. כימות של עוצמות ספוט, ביאור פפטיד בוצעה עם תוכנה ספציפיים המסופקים על ידי אותה חברה שייצרה את microarray.

Protocol

נתונים אלה הם חלק מחקריות המחקר שנערך בניו יורק אוניברסיטת מכללת לרפואת שיניים ואושרו על-ידי ועדת הבדיקה המוסדי של ניו יורק מהפקולטה לרפואה באוניברסיטה, IRB # H10-01894. דוגמאות קליניות השתמשו במחקר זה היו מזוהה מבטל את דגימות המשמשות בעבר לצורך אבחון ועם רשות מן Wadsworth מרכז של ניו יורק מחלקת המדינה של בריאות, אולבני, ניו יורק.

1. התקנת ZIKV בצפיפות גבוהה פפטיד Microarray השקופית במגש הדגירה מסוים

  1. לטפל השקופית זכוכית בקצוות באמצעות אבקה ללא כפפות. הממדים שקופיות זכוכית הם 75.4 מ מ על ידי 25.0 מ"מ ו- 1 מ מ עבה. מקם את השקופית במגש הדגירה עם משטח microarray פונה כלפי מעלה.
  2. מניחים בצד מבריק של החותם פונה כלפי מטה אל השטח המודפסים microarray. כדי להבטיח עמדה טובה, חופפים את חורי הברגים של החותם, הבסיס.
  3. מניחים את החלק העליון של המגש על גבי החותם ליצירת תא microarray.
  4. אבטח את השקופית במגש על ידי הידוק באותה מידה את מכשיר העינויים אחד אחרי השני על ידי יד תבנית לסירוגין החל השמאלית העליונה ואחריו הימנית התחתונה. הנח את מכסה המגש הדגירה.

2. רקע אינטראקציה זיהוי: מכתים את Microarray עם נוגדנים משניים

הערה: השתמש פיפטה להפקיד את הפתרונות (מאגרי סטנדרטי, חסימה, נוגדנים משניים מדולל) בפינה של החדר microarray.

  1. דגירה של microarray עם מאגר רגיל (1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS), 0.05% Tween 20, pH 7.4, מסונן עם מסנן 0.45 מיקרומטר) (נפח כולל של 2,000 µL/microarray) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  2. להסיר את המאגר סטנדרטי על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray. למלא מחזיקי השקופית ריק עם מגלשות ריק כדי למנוע פריצה של השקופית microarray.
  3. לחסום את microarray עם המאגר חסימה (נפח כולל של 2,000 µL/microarray) עבור 60 דקות ב RT-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  4. להסיר את המאגר חסימה על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  5. דגירה של microarray עם נוגדנים משניים, fluorochrome IgM נגד מצומדת, מדולל 1:5000 (נפח כולל של 2,000 µL/microarray) ההכתמה מאגר (10% חסימת מאגר במאגר הרגיל) במשך 30 דקות ב- RT בחושך על תפקודי לב / 140 סל ד.
  6. להסיר את הנוגדן משני על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  7. לשטוף את microarray 3 x, 1 דקה לכל לשטוף עם מאגר סטנדרטי (נפח כולל של 2,000 µL microarray ב RT-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד. לשטוף אחרי זה, להסיר את המאגר סטנדרטי על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  8. לטבול את השקופית 2 x לתוך מאגר וטבלו המוכנים באופן טרי (1 מ"מ טריס, pH 7.4), (סה כ נפח של 200 מ ל).
  9. יבש את microarray בקפידה, עבור-1 דקות, על ידי כ רפה בעברית עודפי הנוזלים היטב בין החלק העליון לחלק התחתון של השקופית מבלי לגעת במשטח שקופיות. לנתח את השקופית קורא סורק microarray.

3. חשיפת Microarray לארח סרום

התראה: לבצע שלב זה בתנאי בטיחות מעבדה, אבטחה ברמה 2 (BSL-2) בגלל הטבע זיהומיות אפשריות של דגימות סרום. לעבוד במסגרת Class II בטיחות ביולוגית cabinet (BSC).

  1. הפוך ללא פעיל דגימת נסיוב ב 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, צנטריפוגה-16,000 rcf למשך 5 דקות ב 4 ° C13.
    הערה: השתמש פיפטה להפקיד את הפתרונות (מכתים, מאגר סטנדרטי, סרום מדולל) בפינה של החדר microarray.
  2. לדלל דגימת נסיוב במאגר מכתימים החל לדילול (נפח כולל של 2,000 μL/microarray) 1:1,000. לשמור את זה ב 4 ° C עד השימוש.
  3. תקופת דגירה של microarray עם המאגר מכתימים (נפח כולל של 2,000 μL/microarray) של 15 דקות ב RT-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  4. להסיר את המאגר מכתימים על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  5. דגירה של microarray עם הדגימה מדולל סרום לילה ב 4 ° C-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  6. הסר את דגימת נסיוב מדולל על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  7. לשטוף את microarray 3 x, 1 דקה לכל לשטוף עם מאגר סטנדרטי (נפח כולל של 2,000 μL microarray ב RT-תפקודי לב / נשימה-140 סל ד. לשטוף אחרי זה, להסיר את המאגר סטנדרטי על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.

4. מכתים עם נוגדנים משניים, בקר תווית נוגדנים

הערה: השתמש פיפטה להפקיד את הפתרונות (מאגרי סטנדרטי, משני מדולל ו תווית נוגדנים) בפינה של החדר microarray.

  1. לדלל הנוגדן משני במאגר מוכתמים.
    הערה: השתמש האנטי-האדם IgM fluorochrome מצומדת נוגדן או האנטי-האדם IgG fluorochrome מצומדת נוגדן-לדילול 1:5,000 (נפח כולל של 2,000 µL/microarray) במאגר מוכתמים.
  2. מיקס פקד תווית נוגדנים (monoclonal אנטי-חה fluorochrome מצומדת) לדילול 1:1,000 (הנפח הכולל של µL 2 000/microarray) בצביעת מאגר עם נוגדנים משניים בעבר מעורבבת עם צביעת מאגר.
  3. דגירה עם microarray למשך 30 דקות ב- RT בחושך על תפקודי לב / נשימה-140 סל ד.
  4. הסר את התמהיל של משני מדולל, תווית נוגדנים על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.
  5. רחץ 3 x עם מאגר סטנדרטי (נפח כולל של 2,000 µL/microarray). כל כביסה היא 1 דקות ב- תפקודי לב / נשימה-140 סל ד. לשטוף אחרי זה, להסיר את המאגר סטנדרטי על ידי כ רפה בעברית עם פיפטה בפינת החדר microarray.

5. Microarray סריקה

  1. לטבול את השקופית 2 x לתוך מאגר וטבלו המוכנים באופן טרי (1 מ מ טריס, pH 7.4) (סה כ נפח של 200 מ ל).
  2. יבש את microarray בקפידה, בסביבות 1 דקות, על ידי כ רפה בעברית היטב מהחלק העליון לחלק התחתון של השקופית מבלי לגעת במשטח שקופיות.
  3. סרוק את microarray ועקוב אחר ההוראות של הסורק. מקם את השקופית לתוך הסורק עם השטח המודפס פונה כלפי מעלה.
  4. יצירת פרוייקט חדש, בחר את אזור הסריקה. הגדרת הסורק פרמטרים כמו: רזולוציה: 21 מיקרומטר, העוצמה עבור 700 ל-800 ננומטר ערוצי: 7.0, איכות סריקה: בינוני וההיסט: 0.8.
  5. לרכוש ולשמור תמונת raw סריקה כקובץ תבנית קובץ TIFF 16 סיביות בגווני אפור.

6. Microarray ניתוח באמצעות תוכנה מסוימת

  1. פתחו את התמונה raw (תמונה TIFF). פתח את הקובץ במערך רשת.
  2. ליישר את הרשת מערך לתמונה סריקה עם מקשי החצים העכבר או לוח המקשים של המחשב.
  3. בחר "הבחירה לכמת" התוכנה ספציפיים, אשר יוצר קובץ readout המכיל את עוצמת האות עבור כל נקודה, הערך רקע, ואודות הרצף פפטיד המתאימים.
    הערה: קובץ פלט זה ניתן גם לייבא לתוך תוכנית גיליון אלקטרוני עבור ניתוח נוסף, יצירת גרפים.

7. Microarray אחסון

  1. אחסן את microarray אטום בחושך ב 4 ° C תחת גז חנקן או ארגון ללא חמצן.

תוצאות

התוצאות המתקבלות באמצעות פרוטוקול המתואר מוצגים באיור 2 , איור 3. אין אינטראקציות רקע נרשמו כאשר מראש מכתימה את microarray עם אנטי-האדם משני IgM (נתונים לא מוצג). צביעת עם אנטי-אדם IgM המספר המשלים הביא במספר תחומים מעל רקע בעוצמות קרינה פל?...

Discussion

תיכננו פרוטוקול ניצול של microarray בצפיפות גבוהה פפטיד המכיל Zika וירוס חלבון הרצף כולו (זן צרפתי פולינזי). Microarray היה מתוצרת הדפסה 3,423 שונים חופפים ליניארי פפטידים. כל פפטיד 15 חומצות אמינו, מגוונים שאריות אחד בלבד של שכנתה הקרובה ברצף (קרי, שאריות 14 חפיפה). למרות שניתן להדפיס חופף קצר יותר, מי?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

התמיכה הנוכחית מסופק על ידי גרנט תוספת ניהול SBIR (מחקר חדשנות עסקית קטנה) מ NIDCRR44 DE024456. גרנט NIDCR HIV זה התפתחה מתוך NIDCR הענק U01 DE017855 לפיתוח של אבחון בשלב של טיפול מאשרות ל- HIV. אנו להכיר בהכרת תודה שערותיו ארוכות ואפורות Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) עבור סוג תמיכה וסיוע טכני שלה. אנו מודים גם מרכז רפואי אוניברסיטת ניו-יורק Langone LI-קור אודיסיאה הדמיה למערכת.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PEPperCHIP Custom Peptide MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)PEPperPRINTPPC.037.002
PepSLide AnalyzerPEPperPRINTPSA.004.00114-days free License for Windows
Rockland Blocking bufferRocklandMB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800Rockland609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging SystemLI-COR
Orbital shaker deviceIKAMTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe IllustratorAdobe
DeltagraphRedrocks

References

  1. Kelser, E. A. Meet dengue's cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
  2. Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
  3. Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
  4. Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
  5. Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
  6. Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
  7. Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
  8. t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
  9. Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
  10. Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
  11. Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
  12. Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
  13. Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
  14. Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
  15. Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
  16. Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
  17. Stafford, P., et al. Physical Characterization of the "Immunosignaturing Effect". Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
  18. Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
  19. Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

130MicroarrayZikaIgM

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved