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要約

このプロトコルでは高密度ペプチド マイクロ アレイを用いたジカ ウイルス特定診断ペプチドを発見する手法について述べる。このプロトコルは、他の新興感染症に立ち向かえない適合できます。

要約

高密度ペプチド マイクロ アレイは、単一の標準顕微鏡スライドの 6000 以上のペプチドのスクリーニングを許可します。このメソッドは薬剤の発見、治療標的の同定、開発を適用ことができます診断の。ここでは、高密度ペプチド マイクロ アレイを用いた特定ジカ ウイルス (ZIKV) 診断ペプチドを発見するためのプロトコルを提案する.ZIKV 感染は 14 aa 残重複 3,423 ユニークな 15 直線のアミノ酸 (aa) 残基に変換全体 ZIKV タンパク質を含む高密度ペプチド マイクロ アレイと孵化させるを検証ひと血清サンプルで重複して印刷されます。同じアレイ内で異なる二次抗体で染色、免疫グロブリン M (igm 抗体)、免疫グロブリン G (IgG) 抗体が血清中に存在するペプチドを検出しました。これらのペプチドは、さらに検証実験のために選ばれました。このプロトコルではデザイン、処理、および高密度ペプチド マイクロ アレイの分析に続いて戦略について述べる。

概要

デング熱とチクングニア ウイルス感染1ベクトル、地理的分布と症状で共有ために臨床症状に基づくジカ ウイルス (ZIKV) の診断が困難します。妊娠中に ZIKV に感染している女性の妊娠における有害転帰のリスクを考えると、3 つのウイルスを区別することが重要です。現在の分子診断テストが特定、のみ便利です血液や唾液で急性感染症2,3の比較的短い期間の間に。血清学的アッセイは、感染4のこの最初の期間の外の診断に不可欠です。

ZIKV 特定の血清学的アッセイの開発が困難になる 2 つの理由: 最初に、人間の免疫システムの応答にジカ抗原は現在知られていない;そして第二に、保存された発現アミノ酸抗体の交差反応を誘導します。私たちの目的は、診断で使用するユニークな ZIKV 特定ペプチドを発見するだった。カバーのバクテリオファージ、細菌などを含む全体の蛋白質画面ペプチド ライブラリに異なるアプローチが開発され、酵母表層ディスプレイ5,6,7,8,9、 10。当社の戦略により、迅速かつ安価な高スループットの血清学的上映11,12高密度ペプチド マイクロ アレイを使用して血清学的現在を改善するために識別されたペプチドを使用ことができますその後ZIKV 感染症の検出のための試金。

このプロトコルは、高密度ペプチド マイクロ アレイ (図 1) を用いたジカ ウイルス特定診断ペプチドの探索を有効。 にします。高密度ペプチド マイクロ アレイは、ペプチドのレーザー印刷技術を使用して製作されました。3,423 アミノ酸残基から成る全体 ZIKV 蛋白質順序はフランスのポリネシアのひずみに基づいて (GenBank: KJ776791.2)、14 アミノ酸残基の重複の重複で 15 線形残基のブロックの標準的なガラス スライドをプリントした、6,846 ペプチド スポットの合計。全体ジカ タンパク質配列ペプチドに加えて、マイクロ アレイを利用インフルエンザ血球凝集素内部統制 (HA) ペプチド。

ジカ検証正ワズワース中心 (アルバニー、ニューヨーク) から得られた血清サンプルは特定の免疫グロブリン M (IgM) および免疫グロブリン G (IgG) 反応性ペプチドを識別するために使用されました。サンプルで一晩インキュベート後、マイクロ アレイだった二次螢光色素共役抗体 (抗ひと igm 抗体または抗ひと IgG) で染色し、マイクロ アレイ スキャナー解析。マイクロ アレイを製造する同じ会社によって提供される特定のソフトウェア スポット強度とペプチド アノテーションの定量化を行った。

プロトコル

これらのデータ、ニューヨーク大学歯学部で進行中の研究調査の一部であり、ニューヨーク大学医学部、IRB の制度検討委員会によって承認された # H10 01894。本研究で使用される臨床サンプルは、従来の診断とアクセス許可から、ワズワース センターのニューヨーク州保健省、アルバニー、ニューヨーク デ識別のサンプルです。

1. 特定のインキュベーション トレイで ZIKV 高密度ペプチド マイクロ アレイ スライドをインストール

  1. パウダー フリーの手袋を使用して端をスライド ガラスを処理します。ガラス スライドの寸法は、75.4 mm 25.0 mm、厚の 1 mm です。マイクロ アレイ面とインキュベーション トレイにスライドを配置します。
  2. マイクロ アレイの印刷面に下向きのシールの光沢のある面を置きます。良い位置を確保するため、シールとベース プレートのネジ穴が重なります。
  3. マイクロ アレイの商工会議所を作成には、シールの上にトレイの上の部分を配置します。
  4. 締め付けによって均等に蝶ネジ 1 つの別の後続いて右下左上から交互に手でトレイにスライドを固定します。インキュベーション トレイのふたを配置します。

2. 背景の相互作用検出: 染色二次抗体のマイクロ アレイ

注: は、マイクロ アレイの部屋の隅にソリューション (標準およびブロック バッファー、希釈した二次抗体) を入金するのにピペットを使用します。

  1. 標準的なバッファー (1 x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、0.05% Tween 20、pH 7.4 では、0.45 μ m フィルターでフィルタ リング) とマイクロ アレイを孵化させなさい (合計 2,000 μ L/マイクロ アレイのボリューム) 140 rpm で軌道シェーカーで室温 (RT) で 15 分。
  2. 標準的なバッファーを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。マイクロ アレイ スライドの破損を防ぐために空白のスライドを持つ空のスライド ホルダーを入力します。
  3. 140 rpm で軌道シェーカーで RT で 60 分のブロック バッファー (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) をマイクロ アレイをブロックします。
  4. ブロックのバッファーを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
  5. 二次抗体、抗ひと IgM 螢光色素共役とマイクロ アレイを孵化させなさい、染色で希釈 1: 5,000 (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) が 140 で軌道シェーカーで暗闇の中で常温 30 分 (標準的なバッファー内のバッファーをブロック 10%) をバッファーrpm。
  6. 二次抗体を削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
  7. 3 マイクロ アレイを洗う x、標準的なバッファー (マイクロ アレイ μ L 2,000/140 rpm で軌道シェーカーで RT の総体積洗浄あたり 1 分。各洗浄後マイクロ アレイ室の隅からピペットで吸引によって標準的なバッファーを削除します。
  8. スライド 2 を浸す作りたて浸漬バッファー (1 mM トリス、pH 7.4) x, (200 mL の合計容積)。
  9. スライドの表面に触れることがなくスライドの下部に上部から非常に慎重に余分な水分を吸引して、約 1 分の慎重に、マイクロ アレイを乾燥します。マイクロ アレイ スキャナー リーダーのスライドを分析します。

3. 血清をホストするマイクロ アレイの露出

注意: は、バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 血清検体の潜在的な感染性のための研究所安全性条件の下でこの手順を実行します。クラス II 生物学的安全キャビネット (BSC) 内で動作します。

  1. 30 分 56 ° C で血清サンプルと 16,000 rcf134 ° C で 5 分間遠心分離を不活性化します。
    注: は、マイクロ アレイの部屋の隅にソリューション (染色、標準的なバッファーと希釈血清) を入金するのにピペットを使用します。
  2. 縮尺 (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) の希釈から始まる染色バッファーの血清サンプルを希釈します。使用するまで 4 ° C でそれを維持します。
  3. 染色バッファー (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) とマイクロ アレイ 140 rpm で軌道シェーカーで RT で 15 分間インキュベートします。
  4. 染色バッファーを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
  5. 140 rpm で軌道シェーカー 4 ° C で一晩希釈血清サンプルのマイクロ アレイを孵化させなさい。
  6. 希釈血清サンプルを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
  7. 3 マイクロ アレイを洗う x、標準的なバッファー (マイクロ アレイ μ L 2,000/140 rpm で軌道シェーカーで RT の総体積洗浄あたり 1 分。各洗浄後マイクロ アレイ室の隅からピペットで吸引によって標準的なバッファーを削除します。

4. 二次抗体とラベル付きコントロール抗体染色

注: は、マイクロ アレイの部屋の隅にソリューション (標準的なバッファー、希薄化後の二次とラベル抗体) を入金するのにピペットを使用します。

  1. 染色バッファーで二次抗体を希釈します。
    注: 使用抗ひと IgM 螢光色素共役抗体または抗ひと IgG 螢光色素共役抗体染色バッファーで 1:5,000 (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) の希釈。
  2. ミックス コントロール ラベル抗体 (モノクローナル抗-共役系螢光色素を HA) の縮尺 (2 000 μ L/マイクロ アレイの全容積) 以前染色バッファーで希釈した二次抗体染色バッファーで希釈。
  3. マイクロ アレイを用いた 140 rpm で軌道シェーカーで暗闇の中で常温 30 分で孵化させなさい。
  4. 希釈した二次とラベル抗体のミックスを削除するには、マイクロ アレイの部屋の隅からピペットで吸引します。
  5. 標準バッファー (2,000 μ L/マイクロ アレイの容量) の 3 倍を洗います。各洗浄は 140 rpm で軌道シェーカーで 1 分です。各洗浄後マイクロ アレイ室の隅からピペットで吸引によって標準的なバッファーを削除します。

5. マイクロ アレイのスキャン

  1. スライド 2 を浸す作りたて浸漬バッファー (1 mM トリス、pH 7.4) (200 mL の合計容積) に x。
  2. 慎重に、マイクロ アレイをドライ スライドの表面に触れることがなくスライドの下部に上部から非常に慎重に吸引で約 1 分。
  3. スキャナーの指示に従ってマイクロ アレイをスキャンします。印刷面をスキャナーの上にスライドを配置します。
  4. 新しいプロジェクトを作成し、スキャンする領域を選択します。スキャナーとしてのパラメーターを設定: 解像度: 21 μ m、700 と 800 nm チャンネルの強度: 7.0、スキャン品質: 媒体およびオフセット: 0.8。
  5. 取得し、16 ビット グレースケール TIFF ファイル形式としてスキャンの raw 画像を保存します。

6 特定のソフトウェアを使用してマイクロ アレイ解析

  1. Raw 画像 (TIFF イメージ) を開きます。アレイ グリッド ファイルを開きます。
  2. コンピューターのマウスまたはキーボードの矢印キーでスキャン画像を配列グリッドに合わせます。
  3. 各スポットの信号の強さ、背景値、および対応するペプチド配列を含む読み出しファイルを作成する特定のソフトウェアで「定量化選択」を選択します。
    注意: この出力ファイルは、追加の分析とグラフ作成のスプレッドシート ・ プログラムにインポートもできます。

7. マイクロ アレイ ストレージ

  1. 酸素遊離窒素またはアルゴン ガス下の 4 ° C で暗闇の中で密封されたマイクロ アレイを格納します。

結果

説明されたプロトコルを使用して得られた結果は、図 2に示すと図 3。事前二次抗ひと IgM (データは示されていない) とマイクロ アレイを汚した場合、背景の相互作用はみられなかった。抗ひと igm 抗体染色結果背景緑色蛍光強度、ホスト血清サンプル (図 2) では IgM とこれらのペプチドの...

ディスカッション

ジカ ウイルス蛋白質シーケンス (フランス ポリネシアひずみ) の全体を含む高密度ペプチド マイクロ アレイを利用したプロトコルを考案しました。マイクロ アレイは、印刷 3,423 異なる重複線形ペプチドによって製造されました。各ペプチド 15 アミノ酸とシーケンス (すなわち、14 残重複) 最も近い隣人から 1 つだけ残基によって変化します。短い重複を印刷することができます、エ?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

現在のサポートは、NIDCRR44 DE024456 から SBIR (中小企業技術革新研究) 管理サプリメント補助金によって提供されます。NIDCR から進化した NIDCR HIV 助成金は、HIV の検証ポイント ・ オブ ・ ケア診断の開発の u01 で DE017855 を付与します。我々 は感謝して彼女のテクニカル サポートと親切なサポートのためシルク Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) を認めます。我々 はまた、李 COR オデッセイ イメージング システムの NYU Langone 医療センターを感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
PEPperCHIP Custom Peptide MicroarrayPEPperPRINTPPC.001.001Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence
PEPperCHIP incubation tray 3/1PEPperPRINTPPC.004.001
PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling)PEPperPRINTPPC.037.002
PepSLide AnalyzerPEPperPRINTPSA.004.00114-days free License for Windows
Rockland Blocking bufferRocklandMB-070
anti-human IgM (mu chain) DyLight 800Rockland609-145-007
anti-human IgG Fc DyLight 680Thermo ScientificSA5-10138
LI-COR Odyssey Imaging SystemLI-COR
Orbital shaker deviceIKAMTS 2/4 digital microtiter shaker
Adobe IllustratorAdobe
DeltagraphRedrocks

参考文献

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