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Resumen

Se presenta un protocolo para la selección en vitro y caracterización del ácido ftálico de grupo específico éster enlace DNA aptámeros. También se incluye la aplicación de los aptámeros seleccionados en un aptasensor electroquímico.

Resumen

Ácido ftálico ésteres (PAEs) sonuno de los principales grupos de contaminantes orgánicos persistentes. La detección específica de grupo de PAEs se desea altamente debido al crecimiento rápido de sus congéneres. ADN los aptámeros se han aplicado cada vez más como elementos de reconocimiento en las plataformas de biosensor, pero selección de aptámeros hacia objetivos altamente hidrofóbico molécula pequeña, como PAEs, se divulgan raramente. Este trabajo describe un método basado en el grano diseñado para seleccionar grupo específico DNA aptámeros a PAEs. El grupo amino funcionalizados ftalato de dibutilo (DBP-NH2) como el destino de anclaje fue sintetizado e inmovilizado en las perlas de agarosa epoxy-activado, que permite la visualización del grupo éster ftálico en la superficie de la matriz de inmovilización, y por lo tanto la selección de las carpetas de grupo específica. Determinamos las constantes de disociación de los candidatos de aptámeros por reacción en cadena de polimerización cuantitativa juntada con separación magnética. La relativa afinidad y selectividad de los aptámeros para otros PAEs se determinaron por el análisis competitivos, donde los candidatos de aptámeros fueron previamente delimitados al DBP-NH2 une bolas magnéticas y lanzado en el sobrenadante tras la incubación con las prueba PAEs u otras sustancias interferentes potenciales. El análisis competitivo se aplicó porque proporcionó una comparación fácil afinidad entre PAEs que sin grupos funcionales para la inmovilización de superficie. Finalmente, demostró la fabricación de un aptasensor electroquímica y había utilizado para la detección ultrasensible y selectiva de ftalato de bis(2-ethylhexyl). Este protocolo proporciona información detallada para el descubrimiento de los aptámeros de otras pequeñas moléculas hidrofóbicas.

Introducción

Junto con el rápido desarrollo económico, aceleración de la industrialización y la construcción urbana, la contaminación ambiental es más grave que nunca. Contaminantes ambientales típicos incluyen iones de metales pesados, toxinas, antibióticos, pesticidas, disruptores endocrinos y contaminantes orgánicos persistentes (COP). Además de los iones del metal y las toxinas, otros contaminantes son moléculas pequeñas que muy a menudo consisten en una variedad de congéneres. Por ejemplo, los contaminantes orgánicos persistentes más tóxicos son los bifenilos policlorados (PCBs), hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs), éteres de bifenilo polibromado (PBDE), policlorados dibenzo-p-dioxinas (PCDD), dibenzofuran policlorados (PCDF) y ftálico ésteres del ácido (PAEs)1,2, que consisten en muchos congéneres. Pequeña molécula de detección se ha realizado principalmente por las técnicas basadas en espectrometría de cromatografía/masa debido a su diversidad de aplicaciones3,4,5,6. Para la detección in situ, métodos basados en anticuerpos han sido recientemente desarrollados7,8,9. Sin embargo, puesto que estos métodos son altamente específicos para un determinado producto de la familia, deben realizarse múltiples pruebas. Lo más grave es que los congéneres novela crecen tan rápido que sus anticuerpos se pueden generar en el tiempo. Por lo tanto, el desarrollo de biosensores específicos de grupo para monitorear los niveles totales de todos sus congéneres en una prueba puede proporcionar una métrica valiosa para evaluar el estado de contaminación del medio ambiente.

Recientemente, el ácido nucleico aptámeros se ha aplicado extensamente como elementos de reconocimiento en diversas plataformas de biodetección debido a su capacidad de reconocer una gran variedad de objetivos, de los iones y moléculas pequeñas de proteínas y células de10,11 ,12. Los aptámeros son identificados a través de un método en vitro llamado evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX)13,14. SELEX comienza con la biblioteca de oligonucleótidos al azar hebra sintética, que contiene aproximadamente 1014-1015 secuencias. El tamaño de la biblioteca al azar asegura la diversidad de las estructuras de ARN o ADN candidato. El proceso SELEX típico consiste en múltiples rondas de enriquecimiento hasta que la biblioteca se ha enriquecido en las secuencias con alta afinidad y especificidad a la meta. La piscina enriquecida final entonces se ordena, y las constantes de disociación (Kd) y selectividad contra potencial sustancias interferentes son determinadas por diferentes técnicas como filtro vinculante, cromatografía de afinidad, superficie resonancia de Plasmon (SPR), etcetera. 15

Debido a la solubilidad de agua muy pobre y falta de grupos funcionales para la inmovilización de superficie, la selección de aptámeros de POPs es teóricamente difícil. Avances significativos para SELEX han acelerado el descubrimiento de los aptámeros. Sin embargo, la selección de aptámeros grupo-específica para POPs no todavía se ha divulgado. Hasta ahora, sólo PCB vinculante ADN aptámeros con alta especificidad para un determinado producto de la familia han sido identificados16. PAEs se utilizan principalmente en materiales de cloruro de polivinilo, cambio un plástico elástico, actuando así como un plastificante cloruro de polivinilo de un plástico duro. Algunos PAEs han sido identificadas como disruptores endocrinos, puede causar graves daños al hígado y función renal, reducir la motilidad de los espermatozoides masculinos y puede resultar en la morfología espermática anormal y cáncer testicular17. El compuesto - ni específico de grupo enlace PAE aptámeros se han divulgado.

El objetivo de este trabajo es proporcionar un protocolo representativo de selección de aptámeros de ADN específico de grupo altamente hidrofóbico moléculas pequeñas como PAEs, un grupo representativo de POPs. También demostramos la aplicación de los aptámeros seleccionados para la detección de contaminación ambiental. Este protocolo proporciona orientación y perspectivas para el descubrimiento de los aptámeros de otras pequeñas moléculas hidrofóbicas.

Protocolo

1. Biblioteca y Primer diseño y síntesis

  1. Diseño de la biblioteca inicial y cartillas.
    Biblioteca (piscina0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    Adelante la cartilla (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Fosforilados cartilla reversa (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. Sintetizar la piscina0, FP y PO4- RP usando estándar phosphoramidite química18,19,20y purificar el ADN estándar cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)21.
  3. Reconstituir la piscina0, FP y PO4- RP en grado libre de nucleasa de agua a 100 μm, alícuota y almacenar a -20 o -80 ° C hasta por un año.
    Nota: Se sugiere fuertemente para almacenar piscina0, FP y PO4- RP en alícuotas de 10-20 μl para evitar posibles contaminaciones cruzadas.

2. sintetizar el objetivo de anclaje y su inmovilización en grano de agarosa Epoxy-activado

  1. Sintetizar el grupo amino funcionalizado ftalato de dibutilo (DBP-NH2) como destino de anclaje.
    Nota: La información experimental sobre la síntesis y caracterización de DBP-NH2 se han descrito en la literatura22.
  2. Preparar el ancla soluciones stock objetivo en un medio apropiado para la solubilidad de destino. Para este estudio, solución stock de 100 mM DBP-NH2 en dimetil sulfóxido (DMSO) y almacenar la solución en 4 o a-20 ° C hasta por un año.
  3. Inmovilizar el DBP-NH2 en perlas de agarosa epoxy activado según un protocolo modificado del fabricante.
    1. Pesar 0,1 g liofilizado en polvo de perlas de agarosa epoxy-activado y suspender en agua destilada. Lavar el medio durante 1 hora usando 20 mL de agua destilada añadida en varias alícuotas. Lavar el medio con 0.2 M Na2CO3 (pH 12).
      Nota: El medio se hincha inmediatamente después de agregar el agua en él.
    2. DBP-NH2 (46,7 mg, 0,15 mmol) se disuelven en el 500 μl de tampón de acoplamiento (amortiguación de 0,2 M Na2CO3 ).
    3. Mezcle la solución de acoplamiento que contiene el ligando con el medio. Use un agitador a 5 rpm durante 48 h a temperatura ambiente.
    4. Repita el lavado el producto tres veces, secuencialmente utilizando tampón de acetato de 0,1 M (0.5 M NaCl, pH 4.5) y 0.2 M carbonato tampón (0,5 M NaCl, pH 12) en cada ciclo de lavado. Lavar y suspender el producto en agua para que el volumen final de 500 μl.
    5. Almacenar el producto a 4 ° C antes de usar.
    6. Confirman el éxito de la inmovilización de destino por análisis elemental.

3. SELEX

  1. Preparar 500 mL de tampón de enlace PAE en agua ultra-pura o agua libre de nucleasa grado con 20 mM Tris· Ácido clorhídrico, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1% polyoxyethy-lene monolaurato de sorbaitan (20) y agente tensoactivo no iónico de 0.03% (pH 7.9). El búfer del filtro a través de un filtro de nitrocelulosa estéril de 0,22 μm y almacenar a una temperatura superior a 20 ° C durante meses.
    Nota: Es crítico para mantener un estado de buena dispersión de PAEs en tampón de enlace PAE. Se necesitan varios tipos de tensioactivos para mejorar la solubilidad de los PAEs en solución acuosa. Sin embargo, el número de tensioactivos debe mantenerse al mínimo para evitar la formación de micelas de surfactante que se encapsulan moléculas PAE. No iónico, agente tensoactivo es fácil de precipitar a temperaturas inferiores a 20 ° C, y por lo tanto, el buffer debe ser almacenado a una temperatura superior a 20 ° C.
  2. Diluir 10 μl de 100 μm piscina0(~1.0 nmol 10 secuencias de15 14-10) en 490 μl de tampón de unión de PAE. Las alícuotas de0 de piscina (5 × 100 μL) de calor en los tubos de centrífuga de pared delgada en el set de baño de agua a 95 ° C durante 10 minutos lugar los tubos en hielo por 5 min y posteriormente incubar los tubos por 5 min a temperatura ambiente (~ 25 ° C en este trabajo).
  3. La primera ronda de selección: incubación de piscina0 y DBP−NH2−coated.
    1. Lavar 200 μL de medio de −coated de2DBP−NH tres veces con 500 μl de tampón de unión de PAE. DBP−NH mezcla2−coated con piscina0 e incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 1 hora bajo agitación suave.
    2. Separado el medio de −coated de2DBP−NH acatar con aptámeros de DNAs tubo de ultrafiltración usingan de ultrafiltración con un corte molecular del kDa 100. El medio de lavado tres veces con 500 μl de tampón de unión de PAE y centrífuga en 9.168 × g por 10 min a 4 ° C.
  4. La primera ronda de selección: elución de aptámeros de medio de −coated de2DBP−NH.
    1. Añadir 50 μl de tampón de enlace PAE a medio lavado y calor la mezcla a 90 ° C durante 9 minutos bajo agitación.
    2. Recoger el sobrenadante que contiene el DNAs eluídas por ultrafiltración. Repita este proceso de elución tres veces para recuperar más consolidados DNAs.
  5. La primera ronda de selección: PCR
    1. Pequeña escala PCR
      1. Realizar una pequeña escala PCR23 (4 × 20 μl partes alícuotas) utilizando ~ 15-30 ciclos. Establecer una reacción de PCR24 como sigue: 6,5 μl de agua libre de ARNasa, 1 μl de cebador de 10 μm (FP, PO4- RP, 0,01 nmol), 1,5 μl eluyó piscina de sección 3.4 (o agua libre de ARNasa como control negativo) y premezclado de 10 μl de mezcla de reacción que contiene dNTPs, hot start polimerasa y 2 × PCR reacción tampón (20 mM tris· Ácido clorhídrico, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3).
      2. Funcionamiento de PCR utilizando un termociclador con los siguientes ajustes: 1 ciclo de 95 ° C, 1 min; 30 ciclos de [95 ° C, 30 s, 56 ° C, 30 s, 72 ° C, 30 s]; 1 ciclo de 72 ° C, 2 minutos y mantener a 4 ° C. Cuando el instrumento está funcionando que el 20th s de los pasos de extensión en el 15, 20, 25 y 30 ciclos, pulse la tecla Pausa, abra la tapa del instrumento y tomar un tubo hacia fuera, luego pulse la tecla de pausa nuevamente para reasumir la PCR.
      3. Preparar 12% desnaturalizado poliacrilamida gel electroforesis (PAGE)25,26. Mezcla de 4.8 g de urea, 6 mL de agua ultra pura, 1 mL de ácido bórico/tris de 10 × / ácido etilendiaminotetraacético (TBE), 3 mL de acrilamida del 40%, 10 μl de tetramethylethylenediamine (TEMED) y 100 μl 10% persulfato de amonio (APS), en ese orden. Mezcle bien y espere a 1.5-2 h para que el gel se solidifica completamente.
      4. Analizar los resultados de la optimización del ciclo: 1 μl de cada producto PCR se combinan con 5 μl de tampón de carga de RNA (62,5% formamida, formaldehído de 0,4 M, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic ácido buffer, 0.02% xileno cyanol FF, azul de bromofenol 0,02%) y 4 μL de Agua libre de ARNasa; calienta la mezcla a 95 ° C por 10 min y enfriarlo rápidamente a 0 ° C en hielo; Incubar por 5 min a temperatura ambiente; carga en 5 pocillos separados del 12% desnaturalizado página; electroforesis a cargo de un sistema de electroforesis vertical en buffer TBE 1 x en 170 V durante 45 minutos.
      5. Después de la electroforesis, el gel con 3 μl de 1 × gel de ácido nucleico mancha en 30 mL de buffer TBE × 1 durante 10 minutos y tomar una imagen del gel la mancha.
    2. Gran escala PCR: Seleccione el número apropiado de ciclos para producir la banda de intensidad máxima en el marcador del tamaño correcto sin subproductos no deseados. Realizar a gran escala PCR (alícuotas de 20 × 100 μL) utilizando las condiciones y el número apropiado de ciclos determinado en la sección 3.5.1.
      Nota: El importe definitivo de la biblioteca de cadena simple que se puede obtener es proporcional al volumen total de la polimerización en cadena, no la concentración de la plantilla. Por lo general, para obtener 1 nmol de biblioteca, la piscina sola necesita 2 mL PCR. PCR es muy sensible y fácilmente contaminada por DNAs exterior. Deben tomarse medidas para reducir la posibilidad de contaminación, tales como guantes, utilizando puntas esterilizadas, no escupir en los tubos y no abrir la tapa del tubo PCR antes de centrifugar.
  6. La primera ronda de selección: purificación del producto de PCR por la precipitación del etanol.
    1. Combinar dos tubos de la mezcla PCR en un tubo (200 μL). Repita esto para todos los tubos.
    2. Añadir 15 μl de solución de sodio acetato (3 M, pH 5.2), 4 μL de solución de portador de precipitación de ADN/ARN y 2,5 veces el volumen de etanol previamente enfriado a-20 ° C en cada tubo. Mezclar uniformemente.
      Nota: Portador de la precipitación de ADN/ARN es ampliamente utilizado en los experimentos de precipitación del etanol para mejorar significativamente el porcentaje de recuperación de ADN/ARN a bajas concentraciones. No interferir con aplicaciones posteriores tales como PCR y secuenciación.
    3. Centrifugar la mezcla a 20.627 × g por 20 min a 4 ° C y cuidadosamente deseche el sobrenadante y dejar el precipitado blanco.
    4. Añadir 400 μL de prerefrigeración solución etanol a-20 ° C en cada tubo para lavar la precipitación el 70%. Centrifugar la mezcla a 20.627 × g por 5 min a 4 ° C y cuidadosamente deseche el sobrenadante y dejar el precipitado blanco. Repetir el lavado dos veces más.
    5. Abra la tapa del tubo; pinchar la membrana selladora; que etanol volatilizar a 40 ° C en el bloque de calefacción hasta que el precipitado blanco se vuelve transparente. Guarde el precipitado a-20 ° C.
      Nota: El producto PCR purificado puede conservarse a-20 ° C.
  7. La primera ronda de selección: generación de ADN monocatenario (generación de piscina enriquecido1) mediante la realización de la reacción de exonucleasa λ para digerir la cadena inversa fosforilada.
    1. Reacción en pequeña escala λ exonucleasa
      1. Añadir 100 μl de agua libre de ARNasa a un tubo que contiene el producto PCR purificado de la sección 3.6. El tubo para disolver completamente el precipitado en el tubo del vórtice.
      2. Preparar cinco tubos de centrífuga y añadir 5 μl de la solución anterior, 11 μl de ARNasa - agua libre y 2 μl de tampón de reacción de 10 × (glicina-KOH de 670 mM, 25 mM MgCl2 , 0,1% (v/v) pH Triton X-100 9.4) en cada tubo.
      3. Añadir 2 μl de agua o solución de exonucleasa λ diluido que contiene 2 U, 5 U 8 U y exonucleasa λ U 10 en estos tubos, respectivamente. Mezcle la solución bien mediante pipeteo suave. El buffer de reacción 10 x se proporciona junto con λ exonucleasefrom el proveedor.
      4. Incubar los tubos durante 35 min a 37 ° C, 15 minutos a 80 ° C y mantener a 4 ° C.
      5. Preparar el 12% natural página. Mezclar 6 mL de agua ultra pura, 1 mL de 10 x TBE, 3 mL de acrilamida del 40%, 10 μl de TEMED y 100 μl de 10% APS, en ese orden. Revolver bien y esperar 60-90 min para que el gel se solidifica completamente.
      6. Analizar los resultados de las reacciones mediante la combinación de 5 μl de cada reacción con 1 μl de carga colorante y 4 μL de agua libre de ARNasa y carga de estas mezclas en pocillos separados 5 12% nativos página (150 V durante 45 minutos).
        Nota: Una escalera de DNA de doble hebra bp 20 se puede también cargar en el gel, pero puede que no sea necesario ya que las distintas bandas de producto de PCR y la biblioteca trenzada única generada Mostrar en el gel.
        Nota: La reacción de exonucleasa λ tiene una excelente selectividad estructural. El producto PCR de doble cadena (la cadena anti-sentido se etiqueta con un grupo fosfato en el extremo 5') puede ser digerido completamente en una sola biblioteca en presencia de exonucleasa λ en una gama muy amplia de la concentración (figura 4). La cantidad mínima de exonucleasa λ que totalmente puede generar ADN en la reacción de exonucleasa λ de pequeña escala también se utiliza para la reacción de gran escala λ exonucleasa. Una mayor concentración de exonucleasa λ puede usarse también, desde exonucleasa λ trabaja bien en un intervalo de concentraciones amplio sin perder su rendimiento de selectividad y el producto de estructura. La reacción de exonucleasa λ es inhibida por una alta concentración de sal. La digestión incompleta del producto PCR implica generalmente que existe demasiada sal en el producto PCR. La purificación de los productos PCR por la precipitación del etanol (sección 3.6) es generalmente compatible con este paso, mientras que el producto PCR purificado por precipitación del isopropanol a menudo contiene demasiada sal.
    2. Reacción de exonucleasa de gran escala λ: Elija la cantidad mínima de exonucleasa λ que totalmente puede generar ADN monocatenario para la reacción de gran escala λ exonucleasa. La reacción se escala proporcionalmente según esta condición. Por ejemplo: si 2 U es la cantidad mínima de exonucleasa λ necesaria, mezclar 38 μl de agua libre de ARNasa, 10 μl de 10 x tampón, 50 μl de ADN piscina1 y 2 μl de exonucleasa λ de 10 U/μl.
  8. La primera ronda de selección: purificación de la piscina de sola1 por la precipitación del etanol.
    1. Siga las instrucciones del paso 3.6.
    2. Determinar la concentración de purifica piscina1 absorción UV a 260 nm.
    3. Reconstituir el 90% purificado piscina1 en un volumen adecuado de amortiguador de enlace PAE. Si no hay suficiente ADN obtenido para la próxima ronda de la selección, repetir secciones 3.5-3.8.2.
      Nota: El volumen de tampón de Unión PAE generalmente varía de 200 a 500 μl según la cantidad de la biblioteca y la concentración final deseada de biblioteca en la siguiente ronda de SELEX.
  9. La segunda, tercera, cuarta y quinta rondas de SELEX.
    1. Realizar a la segunda, tercera, cuarta y quinta rondas de SELEX posteriormente siguiendo el mismo procedimiento describen anteriormente (sección 3.2-3.8), excepto que la biblioteca de ~ 300 pmol fue entrada para aumentar el rigor de la selección.
    2. Para minimizar la absorción inespecífica de DNAs en el medio, Incube la piscina con medio sin modificar en un agitador rotatorio durante 30 minutos en la tercera y cuarta ronda de selección antes de la incubación con el medio de −coated de2DBP−NH.
      Nota: El SELEX proceso terminado en el quinto asalto debido a la reticulación grave entre DNAs revelado por la gran cantidad de productos de alto peso molecular que no migran en el gel.

4. secuenciación de alto rendimiento de

  1. Preparar piscina4 de la sección 3.9.2 para secuenciación por amplificación por PCR con primers compatibles.
    1. Diseñar y sintetizar un primer avance indexada con 6 nt en el extremo 5′ para facilitar el análisis de la secuencia.
      Indexadas cartilla hacia adelante (secuencia de la FP): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. Establecer una reacción de 1.000 µLPCR como sigue: 380 μl de agua libre de ARNasa, 50 μl de cada cebador de 10 μm (FP-secuenciación, PO4- RP, 0,5 nmol), 20 μl de piscina eluída de la sección 3.9.2 y 500 μl de mezcla de reacción que contiene dNTPs premezclan, comienzo caliente polimerasa y 2 × PCR buffer de reacción. Parte alícuota de la mezcla en 10 tubos PCR. Utilice las mismas condiciones de la PCR como se describe en la sección 3.5.1.2.
  2. Purificar el producto de la polimerización en cadena para cumplir con los requisitos de la secuencia de la instalación. Por ejemplo, utilice el kit de recuperación de la DNA del gel de la página según las instrucciones del fabricante.
  3. Envíe el producto PCR purificado (2 μg) a un centro de secuenciación en las condiciones de envío requerido por el fondo de la secuencia. Por ejemplo, enviar el producto PCR en un tubo de centrifugadora con tapas bien selladas con paquetes de hielo a un centro de secuenciación.
    Nota: Recibió los resultados que las secuencias según el número de copias de cada secuencia para evaluar el enriquecimiento de la piscina secuenciado. La secuencia superior fue nombrada DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). Se midieron su afinidad y selectividad por el siguiente protocolo (sección 5 y 6). Su aplicación en un bio-detección electroquímica fue demostrado posteriormente en la sección 7.

5. Kd determinación de seleccionado aptámeros candidatos mediante Magnetic Bead-Based PCR cuantitativa (qPCR)

  1. Sintetizar el DBP-1-qPCR y cartillas con estándar phosphoramidite química y purificar por HPLC estándar.
    Candidato de aptámeros (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    Adelante la cartilla para qPCR (FP-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    Revertir la cartilla para qPCR (RP-qPCR): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    Nota: Las regiones de la cartilla de la secuencia de prueba son diferentes de las de piscina0 utilizado en la sección 3. El propósito de cambiar las regiones de la cartilla es para poner a prueba la afinidad de la secuencia de base sola, excepto las regiones de la cartilla.
  2. Inmovilizar el DBP-NH2 en granos magnéticos recubiertos de ácido carboxílico, siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Lavar los granos magnéticos recubiertos de ácido carboxílico dos veces con 25 mM 2-(N-morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (MES) (pH 5.0), usando pipeta un volumen igual de bolas magnéticas (100 μL) de la ampolleta, por 10 min con buena mezcla (extremo a extremo o similar).
    2. Inmediatamente antes del uso, preparar 50 mg/mL de solución de clorhidrato (EDC) de carbodiimida 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) con frío 25 mM MES (pH 5.0).
    3. Inmediatamente antes del uso, preparar 50 mg/mL de solución de N-hydroxysuccinimide (NHS) con frío 25 mM MES (pH 5.0).
    4. Mezclar 100 μl de solución EDC y 100 μl de solución de NHS con los granos lavados e incubar durante 30 min a temperatura ambiente con inclinación lenta rotación.
    5. Poner el tubo en un imán para 4 minutos después de la incubación, deseche el sobrenadante y lavar granos dos veces con 100 μl de 25 mM frío MES (pH 5.0).
    6. Incubar 6 μl de solución stock de 100 mM DBP-NH2 y 25 mM (pH 5.0, 290 μL) del MES con las cuentas activadas bajo rotación de por lo menos 30 min a temperatura ambiente o 2 h a 4 ° C, con rotación de la inclinación lenta a 5 rpm.
    7. Poner el tubo en el imán para 4 minutos después de la incubación y descarte el sobrenadante. Lavar los granos recubiertos 4 veces y vuelva a suspender cuentas con 200 μL de tampón de unión de PAE y conservar a 4 ° C hasta su uso.
  3. Recoger la curva de titulación para determinar Kd.
    1. Preparar una serie de soluciones de pad-1 (500 μl) en diversas concentraciones en buffer de enlace PAE de 13:00 a 300 nM.
    2. Añadir 10 μl de DBP-NH2-recubierto de granos magnéticos tal como se describe en la sección 5.2.7 a cada solución de pad-1. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente bajo rotación.
    3. Colocar los tubos en un imán para 4 minutos y retirar el sobrenadante. Lavar los granos 4 veces con 200 μL de tampón de unión de PAE.
    4. Agregar 60 μL de tampón de enlace PAE en cada tubo. Incubar los tubos a 95 ° C durante 15 minutos recoge el sobrenadante que contiene el DBP-1 eluídas por separación magnética. Repita este proceso de elución para recuperar más consolidados DBP-1.
    5. Diluir la solución de elute 100-fold y tome 3 μL para qPCR en tiempo real. Establecer una reacción de qPCR como sigue: 3 μl de agua libre de ARNasa, 2 μl de cebador de 10 μm (PF, PO4- RP, 0,01 nmol), 3 μl de eluidos y diluido 1 DBP y premezclado de 10 μl de mezcla de reacción que contiene dNTPs, polimerasa y 2 buffer de reacción x PCR.
    6. Determinar el número de pad-1 en cada muestra ejecutando qPCR utilizando un termociclador con los siguientes ajustes: 1 ciclo de 95 ° C, 30 s; 30 ciclos de [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s, 72 ° C, 30 s]; 1 ciclo de 72 ° C, 30 s y mantener a 4 ° C.
    7. Trazar la curva de valoración y determinar Kd mediante ajuste no lineal de la curva de asumir una relación de Unión 1:127.

6. relativa afinidad y especificidad prueba por análisis competitivos

  1. Añadir 10 μl de DBP-NH2-recubierto de granos magnéticos a DBP-1 solución (500 μl, 1 μm). Incubar durante 1 h a temperatura ambiente bajo rotación. Colocar los tubos en un imán para 4 minutos y retirar el sobrenadante. Lavar los granos 4 veces con 200 μL de tampón de unión de PAE y resuspender en 10 μl de tampón de unión de PAE.
  2. Añadir 10 μl de DBP-NH2-limite medio cubierto con DBP-1 a 110 μl de cada 10 μm probado muestra (DBP-NH2, DBP, DEHP, butil bencilo phthalate(BBP), iones de metales pesados, etcetera.) Incubar a temperatura ambiente durante 1 h. recoger el sobrenadante por separación magnética.
  3. Diluir el sobrenadante 100-fold y tome 3 μL para la cuantificación de la qPCR. Establecer una reacción de qPCR como sigue: 3 μl de agua libre de ARNasa, 2 μl de cebador de 10 μm (PF, PO4- RP, 0,01 nmol), 3 μl de eluidos y diluido 1 DBP y premezclado de 10 μl de mezcla de reacción que contiene dNTPs, polimerasa y 2 buffer de reacción x PCR.
  4. Determinar el número de pad-1 en cada muestra ejecutando qPCR utilizando un termociclador con los siguientes ajustes: 1 ciclo de 95 ° C, 30 s; 30 ciclos de [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s, 72 ° C, 30 s]; 1 ciclo de 72 ° C, 30 s y mantener a 4 ° C.
  5. Calcular la afinidad relativa dividiendo el número de pad-1 liberados de las cuentas en presencia de la muestra por el número de pad-1 de los granos en el búfer de enlace PAE: afinidad relativa = Nmuestra/nbuffer.

7. fabricación y medidas electroquímicas de biosensores electroquímicos de DEHP

  1. Sintetizar la secuencia de base de thiolated (HS-Pad-1) y la sonda de señalización (DBP-1-C-Fc) usando química phosphoramidite estándar y purificar por HPLC estándar.
    HS-DBP-1: 5' - HS-(CH2)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3 '
    DBP-1-C-Fc: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc -3'
    Nota: El diseño racional de las sondas del sensor se describió en nuestra anterior pbulications18,22.
  2. Reconstituir el DBP-HS-1 y DBP-1-C-Fc en agua libre de nucleasa grado a 100 μm, alícuota y almacenar a -20 o -80 ° C hasta por un año.
  3. Pulir el electrodo de oro cuidadosamente a una superficie de espejo con 1 y 0.3 0.05 μm Al2O3 en polvo en un microcloth por 5 min y someter a ultrasonidos en agua ultrapura por 5 min eliminar residual Al2O3. Luego limpie el electrodo por el pulido electroquímico con 35 exploraciones sucesivas voltametría cíclica (CV) de 0.4 a +1.2 V (vs Hg Hg2SO4) 0.5 M H2SO4 en 100 mV/s.
  4. Preparar una mezcla de 0,5 μm HS-DBP-1 y 0.5 μm DBP-1-C-Fc en 100 μl 10 mM de tampón fosfato que contiene 1 M NaCl, pH 7,4 (PBS). Calienta la mezcla en el tubo de centrífuga de pared delgada en el set de baño de agua a 95 ° C durante 10 minutos y enfriar lentamente la mezcla a temperatura ambiente.
  5. Añadir 1 μl de clorhidrato de-(2-carboxyethyl)-fosfina tris (TCEP, 10 mM, solución) en la mezcla. Mantener a temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Sumerja el electrodo limpio de oro en la solución anterior por 12 h, o durante la noche a temperatura ambiente.
  7. Enjuague el electrodo con PBS y sumerja el electrodo en 1 mM [S (CH2)2(OCH2CH2)6OCH3]2 (por ejemplo, capítulo6- OMe) en PBS de 1 h. Enjuagar el electrodo con PAE tampón de Binding y sumerja el electrodo en el buffer de enlace PAE.
  8. Tener una exploración de voltamperometría (SWV) de onda cuadrada de fondo en buffer de enlace PAE libre destino.
    1. Limpie todo el equipo experimental: celdas electrolíticas, oro electrodo de trabajo y contraelectrodo de platino, electrodo de referencia de calomel saturado (SCE).
    2. Activar el software instalado; establecer los parámetros experimentales de las mediciones de SWV.
      Nota: Los siguientes parámetros experimentales se utilizaron para los experimentos SWV: potencial rango: de -0.2 a 0.7 V; amplitud de modulación: 25 mV; anchura de pulso: 5 ms; tasa de lectura: 50 mV/s; potencial de paso: 1 mV.
    3. Conecte el oro trabajando electrodo, contraelectrodo de platino y SCE a un potenciostato y poner estos tres electrodos en una celda electrolítica que contiene tampón de enlace PAE.
    4. Ejecutar medidas de SWV.
      Nota: Una vez el SWV medición comienza, una curva SWV será mostrada en la pantalla de la computadora. El análisis se repite hasta que las exploraciones son constantes y no más cambios en la forma o altura de pico se observan.
  9. Sumerja el electrodo de trabajo en el búfer de enlace PAE que contiene una cierta concentración de DEHP (p. ej., 22:00) durante 30 min a temperatura ambiente. Enjuague los electrodos con buffer de enlace PAE y sumerja el electrodo en el buffer de enlace PAE con el contraelectrodo y el SCE. Recoger la curva SWV bajo las mismas condiciones como se describe en la sección 7.8.
  10. Repita el paso 7.9, excepto que la concentración de DEHP (e.g. 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μm) fue aumentada secuencialmente. Trazar la curva de titulación.
  11. Pruebas de especificidad: Repita los pasos 7.3 7.9, excepto que el búfer de bind PAE que contienen DEHP se sustituye por el buffer de enlace PAE que contiene la sustancia interferente potencial en la concentración deseada.

Resultados

Hemos diseñado y había sintetizado el grupo amino funcionalizado ftalato de dibutilo (DBP-NH2) como destino de anclaje (Figura 1F). Luego realizamos la selección de aptámeros ADN de PAEs con DBP-NH2 como destino ancla y después el método basado en la inmovilización blanco clásico (figura 2). En cada ronda, un piloto PCR fue realizado usando la página desnaturalizada para optimizar el número de cicl...

Discusión

Un beneficio excepcional de aptámeros es que se identifican a través del método en vitro SELEX, mientras que los anticuerpos son generados por immunoreactions en vivo . Por lo tanto, los aptámeros seleccionables con especificidad deseado bajo condiciones experimentales bien diseñadas, mientras que los anticuerpos se limitan a las condiciones fisiológicas.

Para facilitar la separación de secuencias límite de secuencias libres, SELEX modificado varios se han divulgado r...

Divulgaciones

Los autores no declaran competencia interés financiero.

Agradecimientos

Estamos agradecidos por el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias naturales (21675112), proyecto clave del plan de ciencia y tecnología de la Comisión de Educación de Beijing (KZ201710028027) y Yanjing joven becario programa de Capital Normal University.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
UV-2550Shimadzu,Japanprotocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200BIO-RADsection 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 TouchBIO-RADsection 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostatBio-Logic Science, Claix, Francesection 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6BGE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)10220020argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beadsInvitrogen, USA420420magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start VersionTakara,Dalian,ChinaR028Apolymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing MembraneBemis, USAPM-996section 3.6.5
Lambda ExonucleaseInvitrogen, USAEN0561section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		Takara,Dalian,China9094section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kitSangon Biotech (Shanghai)B511135section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stainInvitrogen, USA1811838nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq IITakara,Dalian,ChinaRR820Apolymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichCAS: 1132-61-2section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)Invitrogen, USACAS: 25952-53-8section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich6066-82-6section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH)Sigma-AldrichCAS: 1633-78-9section 7.7
Gold electrodeShanghai ChenhuaCHI101section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-AldrichCAS: 51805-45-9section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol)Sigma-AldrichCAS: 651042-82-9section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP)National Institute of Metrology, ChinaCAS: 117-81-7section 7.11
Tween 20Sigma-AldrichCAS: 9005-64-5polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100Sigma-AldrichCAS: 9002-93-1non-ionic surface active agent
PBSSigma-AldrichP536810 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

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