JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол для отбора в пробирке и характеризация конкретных групп фталевой кислоты Эстер связывания ДНК аптамеры представлен. Применение выбранного aptamer в электрохимических aptasensor также входит в стоимость номера.

Аннотация

Фталекислотные эфиры (Паэс) areone основных групп стойких органических загрязнителей. Конкретных групп обнаружения Паес весьма желательно из-за быстрого роста конгенеров. ДНК аптамеры чаще применялись как признание элементов на биосенсор платформах, но выбор аптамеры целей высокой гидрофобностью малые молекулы, такие как Паес, редко сообщается. Эта работа описывает метод, основанный на шарик, предназначенные для выбора конкретной группе аптамеры ДНК для Паес. Амино-группы функционализированных Дибутилфталат (DBP-NH2) как цель якорь был синтезирован и иммобилизованных на эпоксидной активированный агарозы бусы, позволяя отображения группы фталиевый Эстер на поверхности иммобилизации матрицы, и Поэтому выбор конкретной группе связующих. Константы диссоциации aptamer кандидатов определяется количественным полимеризации цепной реакции в сочетании с магнитной сепарации. Относительный близость и избирательности аптамеры для других Паес были определены конкурентоспособные анализов, где aptamer кандидатов были предварительно ограниченной в DBP-NH2 придают магнитные бусы и выпущен в надосадке после инкубации с протестированных Паес или других потенциальных помех веществ. Конкурентоспособных assay был применен потому, что она предоставила снисходительный сродство сравнения среди Паес, которые не функциональными группами для иммобилизации поверхности. Наконец мы продемонстрировали изготовление электрохимическая aptasensor и использовал его сверхчувствительная и селективного выявления бис(2-этилгексил) фталат. Этот протокол обеспечивает понимание aptamer открытие других гидрофобные малых молекул.

Введение

Наряду с быстрого экономического развития ускорение индустриализации и городского строительства, загрязнения окружающей среды является более суровым, чем когда-либо. Типичными загрязнителями окружающей среды включают в себя ионов тяжелых металлов, токсинов, антибиотиков, пестицидов, эндокринные расстройства и стойких органических загрязнителей (СОЗ). Помимо ионов металлов и токсинов, других загрязнителей являются малые молекулы, что довольно часто состоят из различных родственных соединений. Например, наиболее токсичных СОЗ включают полихлорированных дифенилов (ПХД), полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), полибромированные дифенил эфиров (ПБДЭ), полихлорированных дибензо p диоксинов (ПХДД), полихлорированных дибензофуран (ПХДФ) и фталиевый кислоты эфиры (Паэс)1,2, которые состоят из многих соединений. Малые молекулы обнаружения главным образом выполнялись хроматография/масс спектрометрии-методы на основе из-за их разнообразие приложений3,4,5,6. Для занятия обнаружений методы, основанные на антитела были недавно развитых7,8,9. Однако так как эти методы являются весьма специфическими для определенных конгенеров, необходимо выполнить несколько тестов. Более серьезным является что роман конгенеров растут так быстро, что их антител не могут быть созданы во времени. Таким образом разработка биосенсоров конкретных групп для контроля общего уровня всех соединений в одном тесте может предоставить бесценную метрики для оценки состояния загрязнения окружающей среды.

Недавно нуклеиновые кислоты аптамеры широко применяется как признание элементов в различных платформах biosensing из-за их возможности признавая широкий спектр задач, от ионов и малых молекул белков и клетки10,11 ,12. Аптамеры определяются через в vitro методом систематической эволюции лигандов, экспоненциальное обогащения (SELEX)13,14. SELEX начинается с случайных синтетических однорядная олигонуклеотида библиотеку, которая содержит приблизительно 1014-1015 последовательности. Размер случайного библиотеки обеспечивает разнообразие структур кандидат РНК и ДНК. Типичный процесс SELEX состоит из нескольких раундов обогащения до тех пор, пока библиотека обогащается в последовательности с высоким сродством и специфичностью к целевому объекту. Затем применяется окончательный обогащенного бассейн, и константы диссоциации (dK) и избирательности против потенциал, мешая веществ определяются различные методы фильтрации привязки, аффинной хроматографии, поверхности плазмон резонанс (СРП), и т.д. 15

Из-за крайне плохой растворимостью в воде и отсутствие функциональными группами для иммобилизации поверхности теоретически трудно aptamer отбора СОЗ. Значительных успехов для SELEX ускорили открытие аптамеры. Однако выбор конкретной группе аптамеры СОЗ пока не сообщалось. Пока только аптамеры PCB-связывания ДНК с высокой точностью для некоторых конгенеров были определены16. Паес используются главным образом в поливинилхлоридных материалов, изменяя Поливиниловый хлорид из жесткого пластика для эластичного пластика, таким образом в качестве пластификатора. Некоторые Паес были определены как эндокринные расстройства, могут нанести серьезный ущерб печень и почки, снижения подвижности мужской спермы и может привести к морфологии аномальной спермы и яичка рака17. Соединение - ни аптамеры PAE-привязки конкретной группе не поступало.

Цель этой работы заключается в том, предоставить представитель протокола для выбора конкретной группе аптамеры ДНК для высокой гидрофобностью малых молекул, таких как Паес, представитель группы СОЗ. Мы также продемонстрировать применение выбранного aptamer для обнаружения загрязнения окружающей среды. Этот протокол обеспечивает руководство и понимание для обнаружения aptamer других гидрофобные малых молекул.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Библиотека и конструкции праймера и синтез

  1. Дизайн первоначальной библиотеки и грунтовки.
    Библиотека (0бассейн): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    Вперед грунтовка (ПС): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Фосфорилированных обратный грунтовка (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. Синтезировать0бассейн, FP и PO4- RP, используя стандартные фосфорамидит химия18,19,20и очистить все ННО, стандартных высокопроизводительных жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)21.
  3. Воссоздания0бассейн, FP и PO4- RP в классе нуклеиназы бесплатная вода в 100 мкм, аликвота и хранить их в -20-80 ° c на срок до одного года.
    Примечание: Настоятельно рекомендуется хранить бассейн0, FP и PO4- RP в 10-20 мкл аликвоты, чтобы избежать возможного перекрестного загрязнения.

2. синтезировать целевого объекта привязки и его иммобилизации на эпоксидной активированный агарозы шарик

  1. Синтезировать аминогруппы функционализированных Дибутилфталат (DBP-NH2) как цель привязки.
    Примечание: Экспериментальный детали на синтез и характеристика DBP-NH2 были описаны в литературе22.
  2. Подготовьте якорь целевых акций решения в среде, подходящие для целевого растворимость. Для этого исследования, подготовить 100 мм DBP-NH2 Стоковый раствор в диметилсульфоксида (ДМСО) и хранить решение в 4-20 ° c на срок до одного года.
  3. Иммобилизации DBP-NH2 на эпоксидной активированный агарозы бусины согласно измененный Протокол от производителя.
    1. Весят, 0,1 г, Порошок лиофилизированный эпоксидно активированный агарозы бисера и приостановить его в дистиллированной воде. Вымойте среднего за 1 ч с помощью 20 мл дистиллированной воды, добавить в нескольких аликвоты. Мыть в среду с 0,2 М Na2CO3 (рН 12).
      Примечание: Средние набухает сразу после добавления воды в нее.
    2. DBP-NH2 (46.7 мг, 0,15 ммоль) Растворите в 500 мкл муфта буферу (0,2 М Na2CO3 ).
    3. Смешайте сцепления раствора, содержащего лиганда с носителя. Используйте шейкер на 5 об/мин за 48 ч при комнатной температуре.
    4. Повторите мойки продукта три раза, последовательно с использованием буфера ацетата 0,1 М (0.5 М NaCl, pH 4.5) и 0,2 М карбонат буфера (0.5 М NaCl, рН 12) в каждой стирки. Вымойте и приостановить продукт в воде, чтобы сделать окончательный объем 500 мкл.
    5. Храните продукт на 4 ° C перед использованием.
    6. Подтверждение успешной целевой иммобилизации, элементного анализа.

3. SELEX

  1. Подготовка 500 мл буфера привязки PAE в ультра-чистой воде или нуклеиназы свободный класс с 20 мм Tris· HCl, 100 мм NaCl, 2 мм MgCl2, 5 мм KCl, CaCl 1 мм2, 1% polyoxyethy-lene (20) sorbaitan monolaurate и 0,03% неионные поверхности активного агента (рН 7,9). Фильтр буфер через фильтр нитроцеллюлоза 0,22 мкм стерильным и храните его при температуре выше 20 ° C для месяцев.
    Примечание: Очень важно поддерживать хорошее рассеивание статус Паес PAE привязки буфера. Несколько типов поверхностно-активных веществ необходимы для повышения растворимости Паес в водном растворе. Однако количество ПАВ следует к минимуму, чтобы избежать образования мицелл ПАВ, инкапсулирующие PAE молекул. Не ионные, веществом легко осадок при температурах ниже 20 ° C, и поэтому буфер следует хранить при температуре выше 20 ° C.
  2. Развести 10 µL 100 мкм бассейн0(~1.0 нмоль 10 последовательностей15 14-10) в 490 мкл буфера привязки PAE. Тепла аликвоты0 бассейн (5 × 100 мкл) в тонкостенных пробирок в наборе ванна воды на 95 ° C в течение 10 минут место трубы на льду на 5 мин и впоследствии инкубировать трубы для 5 мин при комнатной температуре (~ 25 ° C в этой работе).
  3. Первый раунд отбора: инкубации пула0 и DBP−NH2−coated среднего.
    1. Вымойте 200 мкл DBP−NH2−coated среды три раза с 500 мкл буфера привязки PAE. Смесь DBP−NH2−coated среде с бассейном0 и инкубировать смеси при комнатной температуре в течение 1 ч при мягкий встряхивания.
    2. Отдельные DBP−NH2−coated среднего связаны с аптамеры из несвязанных ННО ультрафильтрации обыкновенного ультрафильтрации трубка с молекулярной отсечения 100 кДа. Вымойте среднего три раза с 500 мкл буфера привязки PAE и центрифуги на 9,168 g × 10 мин при 4 ° C.
  4. Первый раунд отбора: элюции aptamer из DBP−NH2−coated среды.
    1. 50 мкл буфера привязки PAE промывают среднего и тепла смеси на 90 ° C для 9 мин под встряхивания.
    2. Соберите супернатанта, содержащий eluted ННО, ультрафильтрации. Повторите этот процесс элюции три раза для восстановления более связанном ННО.
  5. Первый раунд отбора: ПЦР
    1. Малых масштабах PCR
      1. Выполнение небольших масштабах ПЦР23 (4 × 20 мкл аликвоты) с помощью ~ 15-30 циклов. Настройка реакции PCR24 следующим образом: 6,5 мкл РНКазы свободной воды, 1 мкл 10 мкм праймера (FP, PO4- RP, 0.01 нмоль), 1.5 мкл этого eluted бассейн из раздела 3.4 (или РНКазы свободной воды как отрицательный контроль) и 10 мкл смешиванием содержащие смесь реакции дНТФ, горячий старт полимеразы и буфер реакции PCR 2 × (20 мм tris· HCl, 100 мм хлористого калия, 3 мм MgCl2, рН 8.3).
      2. Запуск ПЦР с помощью тепловой циклователь со следующими параметрами: 1 цикл 95 ° c, 1 мин; 30 циклов [95 ° C, 30 s; 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 цикл 72 ° C, 2 мин и удерживайте при 4 ° C. Когда инструмент работает что 20 sй расширение шаги на 15, 20, 25 и 30 циклов, нажмите клавишу Пауза, откройте крышку инструмента и принять одну трубку из, затем нажмите клавишу Пауза, вновь возобновить ПЦР.
      3. Подготовка 12% денатурированного геля полиакриламида электрофореза (страница)25,26. Смешайте 4,8 г мочевины, 6 мл ультра-чистой воды, 1 мл 10 × трис/борной кислоты/этилена диамин tetraacetic кислоты (КЭ), 3 мл 40% акриламида, 10 мкл tetramethylethylenediamine (TEMED) и 100 мкл 10% Аммония пероксодисульфат (APS), в этом порядке. Хорошо перемешать и подождать за 1,5-2 ч, чтобы убедиться, что гель полностью твердеет.
      4. Анализ результатов оптимизации цикла: объединить 1 мкл каждого продукта ПЦР с 5 мкл буфера РНК загрузки (0,4 М формальдегид, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic кислотой буфера, 0,02% ксилола cyanol FF, 0,02% бромфеноловый синий, 62,5% формамида) и 4 мкл РНКазы свободной воды; Нагрейте смесь на 95 ° C в течение 10 минут и быстро охладить его до 0 ° C на льду; инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре; нагрузка в 5 отдельных скважин 12% денатурированного страницы; Запустите электрофорез системой вертикального электрофореза в буфере TBE 1 × 170 V по 45 мин.
      5. После электрофореза, пятно гель с 3 мкл 1 × нуклеиновой кислоты геля краситель в 30 мл 1 × кэ буфера для 10 мин и принимать изображение геля.
    2. Большой масштаб ПЦР: выберите соответствующее количество циклов производить высокой интенсивности band в правильный размер маркера без нежелательных побочных продуктов. Выполнение крупномасштабных ПЦР (20 × 100 мкл аликвоты), используя условия и соответствующее количество циклов, определяется в разделе 3.5.1.
      Примечание: Окончательная сумма одноцепочечной библиотеки, которые могут быть получены пропорциональна общий объем PCR, не концентрация шаблона. Как правило чтобы получить 1 нмоль библиотеки, одноцепочечной пул должен 2 мл ПЦР. ПЦР является очень чувствительны и легко загрязненных вне УНУ. Следует принять меры для уменьшения вероятности заражения, как носить перчатки, использование стерилизованные советы, не плевать в трубах и не открывая крышку ПЦР-пробирку перед центрифугированием.
  6. Первый раунд отбора: Очистка продукта PCR высыпанием этанола.
    1. Объедините две трубы смеси ПЦР в одну трубу (по 200 мкл). Повторите это для всех трубок.
    2. Добавьте 15 мкл раствора натрия ацетата (3 M, рН 5.2), 4 мкл раствора ДНК/РНК осадков перевозчика и в 2,5 раза объем предварительно охлажденным этанола при-20 ° C в каждую пробирку. Смешайте их равномерно.
      Примечание: ДНК/РНК осадков перевозчик широко используется в этанол осадков экспериментов значительно улучшить процент восстановления ДНК/РНК при низких концентрациях. Он не вмешивается в нисходящие приложения, например ПЦР и последовательности.
    3. Центрифуга смеси на 20,627 g × 20 мин при температуре 4 ° C и тщательно удалить супернатант и покинуть Белый преципитат.
    4. 400 мкл 70% предварительного охлаждения этанола раствор при температуре-20 ° C в каждую пробирку мыть осадков. Центрифуга смеси на 20,627 g × 5 минут при температуре 4 ° C и тщательно удалить супернатант и покинуть Белый преципитат. Повторите шаг мыть еще два раза.
    5. Открыть крышку трубки; укол уплотнения мембраны; Пусть этанола испарения при 40 ° C на Отопление блока до тех пор, пока Белый преципитат становится прозрачным. Магазин осадок при-20 ° C.
      Примечание: Очищенный продукт PCR может храниться при температуре-20 ° C.
  7. Первый раунд отбора: одноцепочечной ДНК (обогащенный бассейн1) поколения, выполняя λ при exonuclease реакция на дайджест фосфорилированных обратный strand.
    1. Малого масштаба λ при exonuclease реакция
      1. Добавьте 100 мкл РНКазы свободной воды одна трубка, содержащая очищенный продукт PCR раздел 3.6. Вихрь трубка полностью растворить осадок в трубе.
      2. Подготовить пять пробирок и добавьте 5 мкл раствора выше, 11 мкл РНКазы - свободной воды и 2 мкл 10 × реакции буфера (670 мм глицин Кох, 25 мм MgCl2 , 0,1% (v/v) Тритон X-100 рН 9.4) в каждую пробирку.
      3. 2 мкл воды или разбавленных λ при exonuclease раствор, содержащий 2 U, 5 U, 8 U и 10 U λ при exonuclease в этих труб, соответственно. Mix решение хорошо, мягко закупорить. 10 × реакции буфер предоставляется вместе с λ exonucleasefrom поставщика.
      4. Инкубировать трубы для 35 минут при 37 ° C, 15 мин при температуре 80 ° C и провести на 4 ° C.
      5. Подготовка 12% родной страницы. Смешать 6 мл ультра-чистой воды, 1 мл 10 × КЭ, 3 мл 40% акриламида, 10 мкл TEMED и 100 мкл 10% APS, в этом порядке. Хорошо перемешать и подождать 60-90 мин, чтобы убедиться, что гель полностью твердеет.
      6. Анализировать результаты реакций, объединяя 5 мкл каждой реакции с 1 мкл загрузки красителя и 4 мкл РНКазы свободной воды, и загрузки этих смесей в 5 отдельных скважин 12% родной страница (150 V за 45 мин).
        Примечание: 20 bp двуцепочечной ДНК лестницы также могут быть загружены на геле, но она не может быть необходимым, поскольку отдельных полос продукта PCR и созданный единый мель библиотека Показать на геле.
        Примечание: Λ при exonuclease реакции имеет отличные структурные избирательности. Double-stranded продукт PCR (стренги анти чувство помечается фосфатной группы в конце 5') может полностью переваривается в библиотеку одноцепочечной присутствии λ при exonuclease в концентрации довольно широкий диапазон (рис. 4). Минимальная сумма при exonuclease λ, которые вполне могут генерировать одноцепочечной ДНК в небольших масштабах λ при exonuclease реакции также используется для больших масштабах λ при exonuclease реакции. Более высокую концентрацию λ при exonuclease может также использоваться, поскольку λ при exonuclease хорошо работает в диапазоне большой концентрации без потери его структура избирательности и продукта выход. Реакция при exonuclease λ тормозится высокой концентрации соли. Неполное переваривание продукта PCR обычно подразумевает, что существует слишком много соли в продукт PCR. Очистки продуктов ПЦР высыпанием этанола (раздел 3.6) обычно совместим с этим шагом, в то время как продукт PCR, очищенный высыпанием изопропанол довольно часто содержит слишком много соли.
    2. Больших масштабах λ при exonuclease реакции: Выберите минимальное количество при exonuclease λ, которые вполне могут генерировать одноцепочечной ДНК для больших масштабах λ при exonuclease реакции. Реакция масштабируется пропорционально согласно этому условию. Например: если 2 U является минимальная сумма λ при exonuclease требуется, смешать 38 мкл РНКазы свободной воды, 10 мкл 10 x буфер, 50 мкл ДНК бассейн1 и 2 мкл 10 при exonuclease λ U/мкл.
  8. Первый раунд отбора: очистки одноцепочечной бассейн1 высыпанием этанола.
    1. Следуйте инструкциям шаг 3,6.
    2. Определить концентрацию очищенный бассейн1 УФ поглощения на 260 Нм.
    3. Воссоздать бассейн 90% очищенного1 в соответствующий объем буфера привязки PAE. Если есть не хватает ДНК, полученной для следующего раунда отбора, повторите разделы 3.5-3.8.2.
      Примечание: Объем буфера PAE привязки обычно варьируется от 200 до 500 мкл в зависимости от количества библиотеки и желаемой конечной концентрации библиотеки в следующем раунде SELEX.
  9. Второй, третьей, четвертой и пятой раундов SELEX.
    1. Проведение второй, третий, четвертый, и пятый раунды SELEX впоследствии следуя той же процедуре, описанной выше (раздел 3.2-3.8), за исключением того, что библиотека ~ 300 пмоль был вход для увеличения жесткости выбор.
    2. Для сведения к минимуму неспецифических поглощение ННО на носителе, инкубировать бассейн с неизмененной среднего на роторный шейкер для 30 мин в третьем и Четвёртый раунд отбора до инкубации с среднего −coated2DBP−NH.
      Примечание: Процесс SELEX, закончившийся в ходе пятого раунда из-за серьезных crosslink между ННО, свидетельствует большое количество высокой молекулярной массы продукта, который не мигрируют в гель.

4. высокопроизводительного секвенирования

  1. Подготовьте бассейн4 раздел 3.9.2 для виртуализации, амплификации PCR с совместимыми грунтовки.
    1. Дизайн и синтезировать индексированных вперед грунт с 6 nt в конце 5′ для облегчения анализа последовательностей.
      Индексированные вперед грунтовка (FP-последовательности): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. Настройка реакции 1000 µLPCR следующим образом: 380 мкл РНКазы свободной воды, 50 мкл каждого праймера 10 мкм (FP-последовательности, PO4- RP, 0.5 нмоль), 20 мкл eluted бассейн раздел 3.9.2 и 500 мкл реакционной смеси, содержащие дНТФ смешиванием, горячий старт полимеразы и буфер реакции PCR 2 ×. Алиготе смесь в 10 ПЦР трубы. Используйте те же условия PCR, как описано в подразделе 3.5.1.2.
  2. Очищайте продукт PCR для удовлетворения требований объекта последовательности. Например используйте набор для восстановления страницы гель ДНК согласно инструкциям производителя.
  3. Отправьте очищенный продукт PCR (~ 2 мкг) для объекта последовательности в морских условиях, требуемые фондом последовательности. Например корабль продукт PCR в пластиковых пробирок с шапки, тщательно запечатанный с льдом для объекта последовательности.
    Примечание: Получил результаты, которые занял последовательности согласно копии количество каждой последовательности для оценки обогащения виртуализированного бассейн. Топ последовательности был назван DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). Ее близость и избирательности были измерены следующие протоколом (раздел 5 и 6). Его применение в электрохимических био зондирования впоследствии была продемонстрирована в разделе 7.

5. Kd определение выбранного Aptamer кандидатов с использованием Magnetic Bead-Based количественного PCR (ПЦР)

  1. Синтезировать DBP-1-ПЦР и грунтовки с помощью стандартных фосфорамидит химии и очистить его от стандартных ВЭЖХ.
    Кандидат Aptamer (DBP-1-ПЦР): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    Вперед грунтовка для ПЦР (FP-ПЦР): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    Обратный грунтовка для ПЦР (RP-ПЦР): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    Примечание: Регионы грунтовка протестированных последовательности отличаются от пула0 используется в разделе 3. Цель изменения грунтовка регионов является для тестирования сходство основной последовательности самостоятельно, за исключением регионов грунтовка.
  2. Иммобилизации DBP-NH2 на карбоновые кислоты покрытием магнитные бусы следуя инструкциям производителя.
    1. Вымойте карбоновые кислоты покрытием магнитные бусы дважды с 25 мм 2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислоты (МОН) (рН 5,0), используя накапаны равным объемом магнитной бусины (100 мкл) из флакона, 10 мин с хорошим смешивания (конец над конец или аналогичные).
    2. Непосредственно перед применением Подготовьте 50 мг/мл 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды гидрохлорид (EDC) раствора с холодной 25 мм MES (рН 5,0).
    3. Непосредственно перед применением Подготовьте 50 мг/мл раствора N-оксисукцинимидного (NHS) с холодной 25 мм MES (рН 5,0).
    4. Смешать 100 мкл раствора EDC и 100 мкл раствора NHS промывают бисером и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре с вращением медленный наклон.
    5. Положите трубку на магнит на 4 мин после инкубации, отбросить супернатанта и мыть бусины дважды с 100 мкл холодной 25 мм MES (рН 5,0).
    6. Инкубируйте 6 µL 100 мм DBP-NH2 Стоковый раствор и 25 мм MES (рН 5,0, 290 мкл) с активированной бисером под вращение по крайней мере 30 минут при комнатной температуре или 2 ч при температуре 4 ° C, с медленным наклона вращения 5 об/мин.
    7. Положите трубку на магните для 4 мин после инкубации и удалить супернатант. Вымойте покрытием Бусины 4 раза и Ресуспензируйте бусины с 200 мкл буфера привязки PAE и хранить при 4 ° C до использования.
  3. Собирайте кривой титрования для определения Kd.
    1. Подготовить ряд решений DBP-1 (500 мкл) в различных концентрациях в буфере PAE привязки от 1 м до 300 Нм.
    2. 10 мкл DBP-NH2-покрытием магнитные шарики, как описано в разделе 5.2.7 для каждого решения DBP-1. Инкубируйте 1 час при комнатной температуре под вращения.
    3. Место труб на магнит на 4 мин и удалить супернатант. Вымойте Бусины 4 раза с помощью 200 мкл буфера привязки PAE.
    4. Добавьте 60 мкл буфера PAE привязки к каждой трубе. Инкубируйте трубы на 95 ° C в течение 15 минут собрать супернатанта, содержащий eluted DBP-1, магнитной сепарации. Повторите этот процесс элюции восстановить более связанном DBP-1.
    5. Разбавить раствор elute 100 раз и принимать 3 мкл для ПЦР в реальном времени. Настройка реакции ПЦР следующим: 3 мкл РНКазы свободной воды, 2 мкл 10 мкм праймера (FP, PO4- RP, 0.01 нмоль), 3 мкл этого eluted и разбавляют DBP-1, и 10 мкл смешиванием реакционной смеси, содержащие дНТФ, полимеразы и 2 x PCR реакции буфера.
    6. Определить количество DBP-1 в каждой пробе, запустив ПЦР с помощью тепловой циклователь со следующими параметрами: 1 цикл 95 ° c, 30 s; 30 циклов [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 цикл 72 ° C, 30 s и удерживайте при 4 ° C.
    7. Участок кривой титрования и определить Kd путем нелинейного монтажа кривой, предполагая соотношение 1:1 привязки27.

6. относительная близость и специфичность тест на конкурентные анализы

  1. 10 мкл DBP-NH2-покрытием магнитные шарики в DBP-1 решение (500 мкл, 1 мкм). Инкубируйте 1 час при комнатной температуре под вращения. Место труб на магнит на 4 мин и удалить супернатант. Вымойте Бусины 4 раза с помощью 200 мкл буфера привязки PAE и Ресуспензируйте в 10 мкл буфера привязки PAE.
  2. 10 мкл DBP-NH2-покрытием средних обязан с DBP-1 110 мкл каждого 10 мкм испытания образца (DBP-NH2, DBP, DEHP, бутил бензил phthalate(BBP), ионов тяжелых металлов, и т.д.) Инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. сбор супернатанта, магнитной сепарации.
  3. Разбавить супернатант 100 раз и принимать 3 мкл для количественной ПЦР. Настройка реакции ПЦР следующим: 3 мкл РНКазы свободной воды, 2 мкл 10 мкм праймера (FP, PO4- RP, 0.01 нмоль), 3 мкл этого eluted и разбавляют DBP-1, и 10 мкл смешиванием реакционной смеси, содержащие дНТФ, полимеразы и 2 x PCR реакции буфера.
  4. Определить количество DBP-1 в каждой пробе, запустив ПЦР с помощью тепловой циклователь со следующими параметрами: 1 цикл 95 ° c, 30 s; 30 циклов [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 цикл 72 ° C, 30 s и удерживайте при 4 ° C.
  5. Вычислить относительную близость путем деления числа выпущенное количество DBP-1 освобожден из бисера в буфере привязки PAE из бисера при наличии образца DBP-1: относительная сродство = N буфер/nобразцабуфера.

7. Изготовление и электрохимические измерения электрохимических биодатчиков ДЭГФ

  1. Синтезировать последовательности основных thiolated (HS-DBP-1) и сигнальный зонд (DBP-1-C-Fc) с помощью стандартных фосфорамидит химии и очистить его от стандартных ВЭЖХ.
    HS-DBP-1: 5' - HS -6(2CH) - CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3 '
    DBP-1-C-ФК: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT - (2CH)6ФК -3'
    Примечание: Рациональный дизайн датчиков зондов был описан в наших предыдущих18,pbulications22.
  2. HS-DBP-1 и DBP-1-C-ФК в воде нуклеиназы свободный класс на 100 мкм, аликвота и хранить их в -20-80 ° c на срок до одного года.
  3. Польский золотой электрода тщательно к зеркальной поверхности с 1, 0,3 и 0,05 мкм Al2O3 порошка на microcloth 5 минут и sonicate его в ультрачистая вода для 5 минут, чтобы удалить остаточные Al2O3. Затем очистить электрод, электрохимическая полировка с 35 последовательных циклической вольтамперометрии (CV) сканирует от 0,4 до 1,2 V (против Hg-Hg2т4) в 0,5 М H24 так на 100 м/сек.
  4. Приготовить смесь из 0,5 мкм HS-DBP-1 и 0,5 мкм DBP-1-C-ФК в 100 мкл 10 мм фосфатного буфера, содержащий 1 M NaCl, рН 7,4 (PBS). Нагрейте смесь в тонкостенных пластиковых пробирок в наборе ванна воды на 95 ° C в течение 10 мин и медленно охлаждать смесь до комнатной температуры.
  5. 1 мкл tris-(2-carboxyethyl)-фосфин гидрохлорид (TCEP, 10 мм, раствор), в смесь. Храните при комнатной температуре в течение 1 ч.
  6. Погружать чистого золота электрод в приведенные выше решения для 12 h, или на ночь при комнатной температуре.
  7. Промойте электрод с PBS и погружают электрод в 1 мм [S (2CH)2(OCH2CH2)6OCH3]2 (HS-EG6- OMe) в PBS на 1 ч. промойте электрод, тщательно с использованием PAE Привязка буфера и погружают электрод в PAE привязки буфера.
  8. В цели свободного буфера привязки PAE примите фонового сканирования квадратные волны вольтамперометрии (SWV).
    1. Очистить все экспериментальное оборудование: электролизеров, золото рабочих электродом, Платиновый счетчика электрода и насыщенных каломель электрод сравнения (SCE).
    2. Активировать установленного программного обеспечения; Установите экспериментальные параметры для SWV измерений.
      Примечание: Для SWV экспериментов использовались следующие экспериментальные параметры: потенциальный диапазон: от – 0,2 до 0,7 V; амплитуда модуляции: 25 мВ; импульса: 5 мс; Частота сканирования: 50 МВ/s; шаг потенциал: 1 МВ.
    3. Подключите золото стремится потенцио электрода, Платиновый счетчика электрода и SCE и положить эти три электроды в электролитическая ячейка, содержащая PAE привязки буфера.
    4. Запустите SWV измерения.
      Примечание: После начала измерения SWV, SWV кривой будет отображаться на экране компьютера. Сканирование повторяется до тех пор, пока наблюдаются дальнейшие изменения в высоте пик или форму и проверяет, являются постоянным.
  9. Погружать рабочих электродом в PAE привязки буфер, содержащий определенной концентрации DEHP (например, 10 вечера) за 30 мин при комнатной температуре. Промойте электрод, тщательно с использованием буфера привязки PAE и погружают электрод в PAE привязки буфер с счетчик электрода и SCE. Соберите SWV кривой при том же условии, как описано в разделе 7,8.
  10. Повторите шаг 7.9, за исключением, что концентрация DEHP (например 100 ПМ, 1 Нм, 10 Нм, 100 Нм, 1 мкм) последовательно была увеличена. Участок кривой титрования.
  11. Специфичности тестов: Повторите шаги 7.3-7,9, за исключением того, что PAE привязать буфер, содержащий DEHP заменяется PAE привязки буфер, содержащий потенциальные помехи вещество в нужной концентрации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы разработан и синтезированных аминогруппы функционализированных Дибутилфталат (DBP-NH2) как цели привязки (Рисунок 1F). Затем мы провели ДНК aptamer выбор Паес, используя DBP-NH2 как объект привязки и после классической целевого метода на основе имм...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Одним из выдающихся преимуществ аптамеры является, что они идентифицируются посредством метода в vitro SELEX, в то время как антитела создаются через immunoreactions в естественных условиях . Таким образом аптамеры могут быть выбраны с желаемой цели специфичности в хорошо продуманных эк?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конкурирующие финансового интереса.

Благодарности

Мы признательны за финансовую поддержку от национального фонда естественных наук (21675112), проект ключ плана науки и технологии Пекина образования Комиссии (KZ201710028027) и Яньцзин молодой ученый программа Capital Normal University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
UV-2550Shimadzu,Japanprotocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200BIO-RADsection 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 TouchBIO-RADsection 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostatBio-Logic Science, Claix, Francesection 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6BGE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)10220020argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beadsInvitrogen, USA420420magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start VersionTakara,Dalian,ChinaR028Apolymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing MembraneBemis, USAPM-996section 3.6.5
Lambda ExonucleaseInvitrogen, USAEN0561section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		Takara,Dalian,China9094section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kitSangon Biotech (Shanghai)B511135section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stainInvitrogen, USA1811838nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq IITakara,Dalian,ChinaRR820Apolymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichCAS: 1132-61-2section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)Invitrogen, USACAS: 25952-53-8section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich6066-82-6section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH)Sigma-AldrichCAS: 1633-78-9section 7.7
Gold electrodeShanghai ChenhuaCHI101section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-AldrichCAS: 51805-45-9section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol)Sigma-AldrichCAS: 651042-82-9section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP)National Institute of Metrology, ChinaCAS: 117-81-7section 7.11
Tween 20Sigma-AldrichCAS: 9005-64-5polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100Sigma-AldrichCAS: 9002-93-1non-ionic surface active agent
PBSSigma-AldrichP536810 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

Ссылки

  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485(2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

133Aptameraptasensor

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены