Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Vitro seçimi ve gruba özgü maddedir asit ester-bağlama DNA aptamers karakterizasyonu için bir protokol sunulmuştur. Bir elektrokimyasal aptasensor içinde seçilen aptamer uygulanması da dahil edilir.

Özet

Kalıcı organik kirleticiler ana grup maddedir asit esterleri (PAEs) bir. PAEs gruba özgü tespiti son derece congeners hızlı büyüyen nedeniyle isteniyorsa. DNA aptamers giderek Biyoalgılayıcı platformlarda tanıma öğeler olarak uygulamış olan ama PAEs gibi son derece hidrofobik küçük molekül hedefleri doğru seçme aptamers nadiren bildirilmektedir. Bu eser gruba özgü DNA aptamers PAEs için seçmek için tasarlanmış bir boncuk tabanlı yöntemi açıklar. Amino grubu functionalized Dibutil ftalat (DBP-NH2) çapa hedef sentezlenmiş ve epoksi-harekete geçirmek özel boncuk üzerinde immobilize immobilizasyon matris yüzeyde phthalic ester grubu görüntülenmesini sağlayan ve Bu nedenle gruba özel bağlayıcı seçimi. Ayrılma sabitler aptamer adayların nicel polimerizasyon zincirleme reaksiyon manyetik ayırma ile birleştiğinde tarafından belirlenir. Göreli benzeşim ve aptamers için diğer PAEs selectivity rekabetçi deneyleri tarafından belirlenmiştir, nerede aptamer adaylar için DBP-NH2 önceden birbirine bağlanmış manyetik boncuklar bağlı ve süpernatant ile kuluçka üzerine serbest test PAEs ya da diğer potansiyel sokan maddeler. Facile benzeşme karşılaştırma yüzey immobilizasyon için fonksiyonel grup vardı PAEs arasında sağlanan çünkü rekabet tahlil uygulandı. Son olarak, biz bir elektrokimyasal aptasensor imalatı gösterdi ve bis(2-ethylhexyl) ftalat vericiyi ve seçici tespiti için kullanılan. Bu iletişim kuralı anlayışlar hidrofobik diğer küçük moleküller aptamer keşfi için sağlar.

Giriş

Hızlı ekonomik kalkınma ile birlikte hızlanma sanayileşme ve kentsel inşaat, Çevre kirliliğinin her zamankinden daha şiddetli olduğunu. Tipik Çevresel kirleticiler heavy metal iyonları, toksinler, antibiyotik, tarım ilaçları, Endokrin Bozucular ve kalıcı organik kirleticiler (POPs) içerir. Metal iyonları ve toksinlerin yanı sıra, diğer kirleticilerin küçük moleküllerdir yani oldukça sık sık congeners çeşitli oluşur. Örneğin, en zehirli pop'ları içerir Poliklorlu Bifeniller (PCB), polisiklik aromatik hidrokarbonlar (PAH), polybrominated biphenyl eterler (PBDEs), Poliklorlu dibenzo-p-dioksin (PCDDs), Poliklorlu dibenzofuran (PCDFs) ve phthalic tüm oluşur birçok congeners asit esterleri (PAEs)1,2. Küçük molekül algılama esas olarak Kromatografi/Kütle spektrometresi tabanlı teknikleri nedeniyle onların çeşitlilik uygulamaları3,4,5,6tarafından yapıldı. Yerinde tespitlerde için antikor tabanlı yöntemleri gelişmiş7,8,9son zamanlarda. Bu yöntemler belirli bir türdeş için çok özel olduğu için ancak, birden çok test gerçekleştirilmelidir. Roman congeners kadar çabuk onların antikorlar zamanında oluşturulan uzuyor daha ciddi bir olmasıdır. Bu nedenle, tüm congeners bir testteki toplam düzeyde izlemek için gruba özgü biyosensörler gelişimi çevre kirliliği durumu değerlendirmek için çok değerli bir ölçüsünü sağlayabilir.

Son zamanlarda, nükleik asit aptamers yaygın tanıma öğeleri hedeflerden iyonları ve küçük moleküllerin proteinler ve hücre10,11 için çok çeşitli tanıma onların yeteneği nedeniyle çeşitli biosensing platformlar olarak uygulanmış olan ,12. Aptamers sistematik ligandlar evrimi üstel zenginleştirme (SELEX)13,14tarafından adlı bir vitro yöntemi aracılığıyla tanımlanır. SELEX yaklaşık 1014-1015 dizileri içeren rasgele sentetik tek iplikçik Oligonükleotid kitaplığı ile başlar. Rasgele Kütüphane boyutu RNA veya DNA aday yapıları çeşitlilik sağlar. Kütüphanede dizileri yüksek benzeşme ve hedef özgüllük ile zenginleştirilmiş kadar tipik SELEX işlemi zenginleştirme birden fazla mermi ile oluşur. Son zenginleştirilmiş havuzu sonra sıralı ve bağlama, benzeşim Kromatografi, yüzey ayrılma sabitleri (Kd) ve seçicilik sokan maddeler gibi farklı teknikleri tarafından belirlenir potansiyel karşı filtre Plasmon rezonans (SPR), vs. 15

Son derece kötü su çözünürlük ve Fonksiyonel grupların yüzey immobilizasyon için eksikliği nedeniyle aptamer çıkar teorik olarak zor seçimidir. SELEX için önemli gelişmeler aptamers keşfi kadar hız. Ancak, gruba özel aptamers seçim POP'lar için henüz bildirilmemiştir. Şimdiye kadar sadece PCB-bağlama DNA aptamers bir belirli türdeş için yüksek özgüllük ile tanımlanan16olmuştur. PAEs esas olarak Polivinil klorür malzemeleri, böylece bir Plastifiyan davranan bir elastik plastik sert plastikten Polivinil klorür değiştirme kullanılır. Bazı PAEs Endokrin Bozucular tespit edilmiştir, ciddi hasara neden olabilir karaciğer ve böbrek fonksiyonu, erkeğin sperm hareketliliği azaltmak ve anormal sperm morfolojisi ve testis kanseri17neden olabilir. Bileşik - kendisi ve gruba özgü PAE bağlama aptamers bildirilmiştir.

Bu eser gruba özgü DNA aptamers PAEs, pop'ları temsil eden bir grup gibi son derece hidrofobik küçük moleküllere seçmek için temsil edici bir protokol sağlar için hedeftir. Biz de çevre kirliliği algılama için seçilen aptamer uygulama göstermek. Bu iletişim kuralı, kılavuz ve anlayışlar hidrofobik diğer küçük moleküller aptamer keşfi için sağlar.

Protokol

1. Kütüphane ve astar tasarım ve sentez

  1. Tasarım ilk kütüphane ve astar.
    Kütüphane (havuzu0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    İleri astar (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Fosforile ters astar (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. Havuzu0, FP ve PO sentez4- RP standart phosphoramidite kimya18,19,20, kullanma ve tüm DNA'lar standart yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC)21tarafından arındırmak.
  3. Havuzu0, FP ve PO sulandırmak4- RP nükleaz ücretsiz sınıfta su 100 µM aliquot ve -20 saklamak ya da-80 ° C en fazla bir yıl için.
    Not: Bu havuzu0, FP ve PO depolamak için şiddetle önerilmektedir4- olası çapraz bulaşma kaçınmak için RP 10-20 µL aliquots içinde.

2. sentez çapa hedef ve onun tutuklaması üzerine özel boncuk Epoxy-harekete geçirmek

  1. Amino grubu functionalized Dibutil ftalat (DBP-NH2) çapa hedef olarak sentez.
    Not: Edebiyat22' sentez ve karakterizasyonu DBP-NH2 deneysel detayları tarif edilmiştir.
  2. Çapa hedef hisse senedi çözümlerinde hedef çözünürlük için uygun bir ortam hazırlamak. Dimetil sülfoksit (DMSO) 100 mM DBP-NH2 hisse senedi çözümde bu çalışma için hazırlamak ve çözüm 4'te depolamak veya -20 ° C ilâ bir yıl için.
  3. Epoksi-harekete geçirmek özel boncuk değiştirilmiş bir protokol üretici göre üzerine DBP-NH2 hareketsiz.
    1. Epoksi-harekete geçirmek özel boncuk 0.1 gr kurutulmuş dondurma tozu tartmak ve distile suda askıya alma. 1s için orta 20 mL distile su içinde birkaç aliquots eklendi kullanarak yıkayın. Orta 0.2 M Na2CO3 (pH 12) ile yıkayın.
      Not: Orta şişer hemen içine su ekledikten sonra.
    2. DBP-NH2 (46,7 mg, 0.15 mmol) 500 µL kaplin arabellekte (0.2 M Na2CO3 arabellek) geçiyoruz.
    3. Orta ile ligand içeren kaplin çözüm mix. Bir shaker 5 devir / dakikada 48 saat oda sıcaklığında kullanın.
    4. Üç kez, ardışık olarak 0.1 M asetat tampon (0.5 M NaCl, pH 4.5) kullanarak ürün yıkama tekrarlayın ve 0,2 M tampon (0.5 M NaCl, pH 12) her yıkama döngüsünde karbonat. Yıkama ve 500 µL son hacim yapmak için su üründe askıya alma.
    5. Ürünü kullanmadan önce 4 ° C'de depolayın.
    6. Hedef immobilizasyon başarısı ile elementel analiz onaylamak.

3.: SELEX

  1. PAE bağlama arabellek ultra saf su veya sınıf nükleaz ücretsiz su 20 mM Tris· ile 500 mL hazırlamak HCl, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, % 1 polyoxyethy lene (20) sorbaitan monolaurate ve % 0.03 iyonik olmayan yüzey aktif ajan (pH 7,9). Arabellek steril 0,22 µm nitroselüloz filtre ile filtre ve aylardır 20 ° C den daha yüksek bir sıcaklıkta saklayın.
    Not: PAEs iyi dağılım durumunu PAE bağlama arabellekte korumak için önemlidir. Yüzey aktif maddeleri birden çok türde PAEs çözünürlük sulu çözüm geliştirmek için ihtiyaç vardır. Ancak, yüzey sayısını PAE molekülleri kapsülleyen yüzey aktif micelles oluşumunu önlemek için minimum düzeyde tutulmalıdır. Non-iyonik yüzey aktif Ajan 20 ° C düşük sıcaklıklarda çökelti kolaydır ve bu nedenle arabellek 20 ° C'nin daha yüksek bir sıcaklıkta depolanan
  2. 100 µM havuzu0(~1.0 nmol 1014-1015 serileri için) 10 µL PAE bağlama arabellek 490 µL içinde sulandırmak. 5 min için buz üzerine boruları su Banyo Seti 10 dk. yer için 95 ° C'de ince duvar santrifüj tüplerde içinde Havuzu0 aliquots (5 × 100 µL) ısı ve daha sonra (bu çalışmada ~ 25 ° C) oda sıcaklığında 5 min için tüpler kuluçkaya.
  3. Seçimi ilk tur: kuluçka DBP−NH2−coated orta ve havuzu0 .
    1. DBP−NH2−coated orta 200 µL 500 µL PAE bağlama arabellek ile üç kez yıkayın. Mix DBP−NH2−coated orta ile0 havuz ve karışımı oda sıcaklığında hafif sallayarak altında 1 h için kuluçkaya.
    2. Ayrı DBP−NH2−coated orta aptamers ile ilişkisiz DNA'lar Ultrafiltrasyon tipbir Ultrafiltrasyon tüp 100 kDa moleküler cut-off ile bağlı. Orta 9,168 × g 4 ° C'de 10 dakika için de 500 µL PAE bağlama arabellek ve santrifüj ile üç kez yıkamak
  4. Seçimi ilk tur: DBP−NH2−coated orta aptamer elüsyon.
    1. PAE bağlama arabellek 50 µL yıkanmış orta ve ısı altında sallayarak 9 dk 90 ° C'de karışımı ekleyin.
    2. Ultrafiltrasyon tarafından eluted DNA'lar içeren süpernatant toplamak. Bu elüsyon üç kez daha ilişkili DNA'lar kurtarmak için adımları tekrarlayın.
  5. Seçimi ilk tur: PCR
    1. Küçük ölçekli PCR
      1. ~ 15-30 kullanarak bir küçük ölçekli PCR23 (4 × 20 µL aliquots) gerçekleştirmek döngüleri. PCR reaksiyon24 aşağıdaki gibi ayarlayın: 6.5 µL RNase ücretsiz su, 1 µL 10 µM astar (FP, PO4- RP, 0.01 nmol), 1,5 µL eluted havuzu Bölüm 3.4 (veya negatif kontrol olarak su RNase free) ve 10 µL premix tepki karışımı içeren dNTPs, sıcak başlangıç polimeraz ve 2 × PCR reaksiyon arabellek (20 mM tris· HCl, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3).
      2. PCR termal cycler aşağıdaki ayarlarla kullanarak çalıştırın: 1 döngüsü 95 ° c, 1 dk; 30 döngüleri [95 ° C, 30 s; 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 72 ° C, 2 dk ve tutun 4 ° C'de 1 döngüsü Araç uzatma merdivenlerden 15, 20, 25, 20inci s ve 30 döngüleri, Duraklat tuşuna basın çalışırken enstrüman kapağını açın ve bir boruyu çıkarmak al, sonra tekrar PCR sürdürmek için Duraklat tuşuna basın.
      3. Denatüre % 12 polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa)25,26hazırlayın. 4.8 g üre, 6 mL ultra saf su, 1 mL 10 × tris/Borik asit karışımı/etilen diamin tetraacetic asit (TBE), 3 mL % 40 Akrilamid, tetramethylethylenediamine (TEMED) ve 100 µL % 10 amonyum persülfat (APS), 10 µL bu sırayla. Iyice karıştırınız ve jel tamamen katılaşır emin olmak 1.5-2 h için bekleyin.
      4. Döngü optimizasyon sonuçlarını analiz: 1 µL PCR ürünleri 5 µL RNA yükleme arabelleği (% 62.5 formamide, 0.4 M formaldehit, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic asit tampon, %0.02 Ksilen cyanol FF, %0.02 bromophenol mavi) ve 4 µL ile birleştirir Su RNase free; karışımı 10 dakika için 95 ° c ısı ve hızlı bir şekilde buz 0 ° c serin; oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya; %12 5 ayrı kuyu içine yük sayfa denatüre; Elektroforez 1 x TBE tampon vasıl 170 V 45 dakika için bir Dikey Elektroforez Sistemi tarafından çalıştırın.
      5. Elektroforez, jel 3 µL 1 × nükleik asit jel ile leke 10 min için 1 x TBE tampon 30 ml ve fotoðraf jel leke sonra.
    2. Büyük ölçekli PCR: doğru boyutu işaretçiyi istenmeyen yan ürünleri olmadan en yüksek yoğunluk band üretmek için döngüsü uygun sayısını seçin. Büyük ölçekli kullanmak koşulları ve döngüleri 3.5.1 bölümünde belirlenen uygun sayıda PCR (20 × 100 µL aliquots) gerçekleştirin.
      Not: Son elde edilebilir tek iplikçikli Kütüphane PCR, değil şablon konsantrasyon hacmi için orantılı miktarıdır. Tipik olarak, Kütüphane 1 nmol elde etmek için tek iplikçikli havuzu 2 mL PCR ihtiyacı var. PCR çok hassas ve kolayca dış DNA'lar tarafından kirlenmiş. Kirlenme, eldivenler, steril ipuçlarını kullanarak, tüplerde tükürme değil ve PCR tüp Santrifüjü önce kapağı değil açılış gibi şansını azaltmak için adımlar.
  6. Seçimi ilk tur: etanol yağış PCR ürünü saflaştırılması.
    1. PCR karışımı iki tüp bir tüp (200 her µL) birleştirir. Bu tüm tüpler için işlemi yineleyin.
    2. Sodyum asetat (3 M, pH 5.2) çözüm 15 µL, DNA/RNA yağış taşıyıcı çözüm 4 µL ve 2,5 kat önceden soğutulmuş etanol hacmi-20 ° C'de her tüpün içine ekleyin. Mix onları eşit.
      Not: DNA/RNA yağış taşıyıcı yaygın DNA/RNA kurtarma yüzdesi düşük konsantrasyonlarda belirgin şekilde artırmak için etanol yağış deneylerinde kullanılır. PCR ve sıralama gibi aşağı akım uygulamaları ile engel değildir.
    3. 20,627 × g 4 ° C'de 20 dk için karisimin santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant atın ve beyaz çökelti bırakın.
    4. %70 Yağış yıkamak için her tüpün önceden etanol çözüm-20 ° C'de soğutma 400 µL ekleyin. 4 ° C'de 5 min için 20,627 × g karisimin santrifüj kapasitesi ve dikkatle süpernatant atın ve beyaz çökelti bırakın. Yıkama iki kez daha tekrarlayın.
    5. Tüp kapağını açın; mühürleme membran dikmek; Beyaz çökelti saydam hale gelene kadar Isıtma blokta 40 ° C'de volatilize etanol izin. Mağaza-20 ° C'de çökelti
      Not:-20 ° C'de arıtılmış PCR ürünü saklanabilir
  7. Seçimi ilk tur: fosforile ters strand sindirmek için λ eksonükleaz tepki gerçekleştirerek tek iplikçikli DNA üretimi (zenginleştirilmiş havuz1nesil).
    1. Küçük ölçekli λ eksonükleaz tepki
      1. 3.6 bölümünden arıtılmış PCR ürünü içeren bir tüp 100 µL RNase free su ekleyin. Girdap çökelti tüp içinde tamamen erimesi için tüp.
      2. Beş santrifüj tüpleri hazırlayın ve yukarıdaki çözüm RNase - 11 µL 5 µL ücretsiz su ve 10 × tepki arabelleği (670 mM glisin-KOH, 25 mM MgCl2 , % 0,1 (v/v) Triton X-100 pH 9,4) 2 µL her tüpün içine ekleyin.
      3. Su veya seyreltilmiş λ eksonükleaz çözüm 2 U, 5 U, U 8 ve 10 U λ eksonükleaz aktivitesi bu tüpler içine sırasıyla içeren 2 µL ekleyin. Çözüm de hafifçe pipetting karıştırın. 10 × tepki arabellek sağlayıcı λ exonucleasefrom ile birlikte verilir.
      4. Tüpler 37 ° c, 80 ° C'de 15 dk 35 dk için kuluçkaya ve 4 ° C'de tutun
      5. % 12'si yerli sayfa hazırlamak. 6 mL ultra saf su, 10 × TBE, % 40 Akrilamid, TEMED 10 µL ve 100 µL % 10 3 mL 1 mL karışımı APS, o sırada. Iyice karıştırınız ve jel tamamen katılaşır emin olmak 60-90 dakika için bekleyin.
      6. Her reaksiyon 5 µL boya ve su RNase free 4 µL yükleme ve % 12'si yerli sayfa (150 V için 45 dk) 5 ayrı kuyu içine bu karışımları yükleme 1 µL ile birleştirerek tepkiler sonuçlarını çözümlemek.
        Not: 20 bp çift iplikçikli DNA merdivenle de jel üzerinde yüklenebilir ancak PCR ürünü ve oluşturulan tek telli kitaplığa farklı grupları üzerinde jel göstermek bu yana gerek kalmayabilir.
        Not: Mükemmel bir yapısal seçicilik λ eksonükleaz tepki vardır. (Anti-anlamlı iplik 5' uç bir fosfat grubu ile etiketlenir) çift iplikçikli PCR ürünü tamamen bir tek iplikçikli Kütüphane λ eksonükleaz oldukça geniş konsantrasyon aralığında (şekil 4) huzurunda sindirilir olun. Tamamen tek iplikçikli DNA küçük ölçekli λ eksonükleaz tepki olarak oluşturabilirsiniz λ eksonükleaz en az miktarda da büyük ölçekli λ eksonükleaz tepki için kullanılır. Onun yapısı seçicilik ve ürün verim kaybı olmadan λ eksonükleaz aktivitesi de geniş konsantrasyon aralığında çalışır beri λ eksonükleaz aktivitesi yüksek bir konsantrasyon da kullanılabilir. λ eksonükleaz tepki tuz yüksek bir konsantrasyon tarafından engellenir. PCR ürünü eksik hazım genellikle çok fazla Tuz PCR ürünü var anlamına gelir. Sık sık isopropanol yağış tarafından arıtılmış PCR ürünü çok fazla tuz içerirken, PCR ürünü etanol yağış (Bölüm 3.6) tarafından arıtma genellikle bu adım ile uyumludur.
    2. Büyük ölçekli λ eksonükleaz tepki: Tamamen tek iplikçikli DNA'lar için büyük ölçekli λ eksonükleaz tepki oluşturabilirsiniz λ eksonükleaz en az miktarını seçin. Reaksiyon bu durumuna göre orantılı olarak ölçeklendirilir. Örneğin: 2 U λ eksonükleaz gerekli minimum tutar ise, mix 38 µL Rnase ücretsiz su, 10 arabellek x 10 µL, 50 µL DNA havuzu1 ve 2 µL 10 U/µL λ eksonükleaz aktivitesi.
  8. Seçimi ilk tur: etanol yağış ile tek iplikçikli havuzu1 saflaştırılması.
    1. Adım 3.6 yönergeleri izleyin.
    2. Konsantrasyonu 260 UV emme tarafından havuz1 saf belirlemek nm.
    3. PAE bağlama arabellek uygun bir birimdeki % 90'ı saf havuz1 sulandırmak. Seçimi sonraki tur için elde yeterli DNA yoksa, bölümler 3.5-3.8.2 yineleyin.
      Not: PAE bağlama arabellek hacmi genellikle 200 den 500 µL Kütüphane ve Kütüphane SELEX sonraki turda istenen son konsantrasyonu miktarına göre değişir.
  9. İkinci, üçüncü, dördüncü ve beşinci tur SELEX.
    1. İkinci, üçüncü, dördüncü kuralları ve ~ 300 pmol kütüphane seçim sıkılık artırmak için giriş dışında olduğunu daha sonra aynı prosedürü izleyerek SELEX beşinci tur (Bölüm 3.2-3,8) açıklanan.
    2. DNA'lar nonspesifik emilimini ortamdaki en aza indirmek için 30 dk içinde üçüncü için döner bir shaker değiştirilmemiş ortamda havuzuyla kuluçkaya ve seçim öncesinde kuluçka DBP−NH2−coated orta ile Dördüncü turda.
      Not: SELEX işlemi nedeniyle ciddi crosslink jel göç değil yüksek molekül ağırlıklı ürün büyük miktarda tarafından ortaya DNA'lar arasında beşinci tur sona erdi.

4. yüksek üretilen iş sıralama

  1. Havuzu4 bölümünden 3.9.2 PCR güçlendirme uyumlu astar ile sıralama için hazırlayın.
    1. Tasarım ve 6 ile dizin oluşturulmuş bir ileri astar sentez nt 5'sonunda dizi analizi kolaylaştırmak için.
      Dizine ileri astar (FP-sıralama): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. 1.000 µLPCR tepki kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: 380 µL RNase ücretsiz su, 50 µL her 10 µM astar (FP-sıralama, PO4- RP, 0.5 nmol), 20 µL 3.9.2 bölümünden eluted havuzu ve 500 µL premix dNTPs içeren tepki karışımı, sıcak polimeraz başlatma ve 2 × PCR reaksiyon tampon. Aliquot 10 PCR tüpleri içine karışımı. Aynı PCR koşulları 3.5.1.2 bölümünde açıklandığı gibi kullanın.
  2. Sıralama tesisin gereksinimlerini karşılamak için PCR ürünü arındırmak. Örneğin, sayfa-jel DNA kurtarma seti üreticinin talimatlarına göre kullanın.
  3. Arıtılmış PCR ürünü (~ 2 µg) bir sıralama tesis sıralama aracı tarafından gerekli nakliye koşulları altında gönderin. Örneğin, PCR ürün kapakları iyice sıralama tesise buz paketleri ile mühürlenmiş bir santrifüj tüpü gemi.
    Not: dizileri sıralı havuzu zenginleştirme değerlendirmek için her sıra kopya sayısına göre sıralanır sonuçlar aldı. Üst sıra DBP-1 seçildi (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). Onun ilgi ve seçicilik aşağıdaki iletişim kuralları (Bölüm 5 ve 6) tarafından ölçüldü. Bir elektrokimyasal biyo algılama kendi uygulamasında daha sonra 7 bölümünde gösterilmiştir.

5. Kd belirlenmesi, seçili Aptamer Magnetic Bead-Based kantitatif PCR (qPCR) kullanarak adaylar

  1. DBP-1-qPCR ve standart phosphoramidite kimya kullanarak astar sentez ve tarafından standart HPLC arındırmak.
    Aptamer aday (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    İleri qPCR (FP-qPCR) için astar: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    Astar qPCR (RP-qPCR) için ters: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    Not: Test sıra astar bölgelerinde bu havuzu0 3 bölümde kullanılan farklı. Astar bölgeleri değiştirme amacı astar bölgeleri hariç yalnız çekirdek sırasının benzeşme test etmektir.
  2. Manyetik boncuklar karboksilik asit kaplı üreticinin yönergelerini takip üzerine DBP-NH2 hareketsiz.
    1. Karboksilik asit kaplı manyetik boncuklar 25 mM 2-(N-morpholino) ile iki kez yıkayın ethanesulfonic asit (MES) (pH 5,0), manyetik boncuklar (100 µL) eşit bir hacmi pipetted şişe dışında 10 iyi karıştırma ile dakikadır (bitti sıra veya benzeri) kullanarak.
    2. Kullanımdan hemen önce 50 mg/mL soğuk 25 mM MES (pH 5,0) ile 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hidroklorid (EDC) çözeltisi hazırlamak.
    3. Kullanımdan hemen önce 50 mg/mL soğuk 25 mM MES (pH 5,0) ile N-hydroxysuccinimide (NHS) çözeltisi hazırlamak.
    4. EDC çözeltinin 100 µL ve 100 µL NHS çözüm yıkanmış boncuk ile karıştırıp yavaş tilt rotasyon ile oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
    5. Kuluçka sonra 4 dk için bir mıknatıs tüp koymak, süpernatant atmak ve boncuk 100 µL soğuk 25 mm MES (pH 5,0) ile iki kez yıkayın.
    6. 100 mM DBP-NH2 hisse senedi çözüm ve dönüş için en az 30 dakika oda sıcaklığında veya 4 ° C'de 2 h 5 devirde yavaş tilt döndürme altında aktif boncuk ile 25 mM MES (pH 5,0, 290 µL) 6 µL kuluçkaya.
    7. Kuluçka sonra 4 dk için mıknatıs tüp koymak ve süpernatant atın. Kaplamalı boncuk 4 kez yıkama ve boncuk ile 200 µL PAE bağlama arabellek ve mağaza 4 ° c kadar kullanmak resuspend.
  3. Titrasyon eğrisi Kdbelirlemek için toplamak.
    1. PAE bağlayıcı arabelleğe 1 de 300 çeşitli konsantrasyonlarda DBP-1 Çözümleri (500 µL) bir dizi hazırlamak nM.
    2. 10 µL DBP-NH2eklemek-kaplı manyetik boncuklar bölümünde 5.2.7'den her DBP-1 çözüm için açıklandığı gibi. Döndürme altında oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
    3. Tüpler 4 dk için bir mıknatıs yerleştirin ve süpernatant kaldırın. 4 kez 200 µL PAE bağlama arabellek kullanarak boncuk yıkayın.
    4. PAE bağlama arabellek 60 µL her tüp için ekleyin. 15 dk. toplamak için 95 ° C'de tüpler içeren eluted DBP-1 tarafından manyetik ayırma süpernatant kuluçkaya. Daha fazla ilişkili DBP-1 kurtarmak için bu elüsyon işlemi yineleyin.
    5. Elute çözüm 100-fold sulandırmak ve gerçek zamanlı qPCR için 3 µL al. QPCR tepki kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: 3 µL RNase ücretsiz su, 2 µL 10 µM astar (FP, PO4- RP, 0.01 nmol), 3 µL, eluted ve DBP-1 seyreltilmiş ve 10 µL premix dNTPs, polimeraz ve 2 x PCR reaksiyon arabellek içeren tepki karışımı.
    6. Aşağıdaki ayarlarla bir termal cycler kullanarak qPCR çalıştırarak DBP-1 numaraları her örnek içinde belirlemek: 1 döngüsü 95 ° c, 30 s; 30 döngüleri [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 72 ° C, 30 s ve tutun 4 ° C'de 1 döngüsü
    7. Titrasyon eğrisi çizmek ve Kd bir 1:1 bağlama oranı27varsayarak eğrisi doğrusal olmayan uydurma tarafından belirlemek.

6. göreli benzeşme ve özgüllük Test tarafından rekabetçi deneyleri

  1. 10 µL DBP-NH2eklemek-kaplı DBP-1 çözüm (500 µL, 1 µM) için manyetik boncuklar. Döndürme altında oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Tüpler 4 dk için bir mıknatıs yerleştirin ve süpernatant kaldırın. 4 kez 200 µL PAE bağlama arabellek kullanarak boncuk yıkama ve PAE bağlama arabellek 10 µL içinde resuspend.
  2. DBP-NH210 µL Ekle-her 10 µM 110 µL için DBP-1 ile kaplı orta sınır test örnek (DBP-NH2, DBP, DEHP, butil Benzil phthalate(BBP), ağır metal iyonları, vs.) 1 h. süpernatant toplamak için oda sıcaklığında tarafından manyetik ayırma kuluçkaya.
  3. 100-fold süpernatant sulandırmak ve qPCR miktar için 3 µL al. QPCR tepki kadar aşağıdaki gibi ayarlayın: 3 µL RNase ücretsiz su, 2 µL 10 µM astar (FP, PO4- RP, 0.01 nmol), 3 µL, eluted ve DBP-1 seyreltilmiş ve 10 µL premix dNTPs, polimeraz ve 2 x PCR reaksiyon arabellek içeren tepki karışımı.
  4. Aşağıdaki ayarlarla bir termal cycler kullanarak qPCR çalıştırarak DBP-1 numaraları her örnek içinde belirlemek: 1 döngüsü 95 ° c, 30 s; 30 döngüleri [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 72 ° C, 30 s ve tutun 4 ° C'de 1 döngüsü
  5. Göreli benzeşme DBP-1 DBP-1 boncuk PAE bağlama arabellek üzerinden çıkış sayısıyla örnek huzurunda boncuk üzerinden çıkış sayısı bölerek hesaplamak: göreli benzeşme Nörnek/Narabellek=.

7. imalat ve DEHP elektrokimyasal biyosensörler elektrokimyasal ölçümleri

  1. Thiolated core serisi (HS-DBP-1) ve standart phosphoramidite kimya kullanarak sinyal prob (DBP-1-C-Fc) sentez ve tarafından standart HPLC arındırmak.
    HS-DBP-1: 5' - HS-(CH2)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3 '
    DBP-1-C-Fc: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc -3'
    Not: Sensör probları rasyonel tasarım bizim önceki pbulications18,22tanımlanmıştır.
  2. HS-DBP-1 ve DBP-1-C-Fc nükleaz ücretsiz sınıf su, 100 µM, aliquot, yeniden oluşturma ve -20 saklamak ya da-80 ° C en fazla bir yıl için.
  3. Dikkatli bir microcloth 5 min için bir ayna gibi yüzeye 1, 0,3 ve 0,05 µm Al2O3 toz için altın elektrot Lehçe ve bu ultrasaf su artık Al2O3kaldırmak 5 min için solüsyon içeren temizleyicide. Sonra elektrot tarafından elektrokimyasal parlatma 35 1,2 V 0,4 ardışık çevrimsel voltammetry (CV) taramaları ile temiz (vs Hg-Hg2SO4) 0, 5 M H2SO4 100 mV/s.
  4. 0.5 µM HS-DBP-1 ve 0,5 µM karışımı hazırlamak DBP-1-C-Fc 100 µL 10 mM fosfat tampon 1 M NaCl, pH 7,4 (PBS) içeren. Karışım su Banyo Seti 10 min için 95 ° C'de ince duvar santrifüj tüpü içinde ısı ve oda sıcaklığında karışıma yavaş yavaş serin.
  5. Tris-(2-carboxyethyl)-fosfamin hidroklorür (TCEP, 10 mM, hisse senedi çözüm) 1 µL içine karışımı ekleyin. 1s için oda sıcaklığında tutmak.
  6. 12 h için yukarıdaki çözüm temiz Altın elektrot maddeler yerleştirmeye çalışmayın ya oda sıcaklığında bir gecede.
  7. Elektrot PBS ile durulayın ve 1 mM [S (CH2)2(OCH2CH2)6OCH3]2 elektrot bırakın (HS-örneğin6- OMe) PBS için 1 h. içinde iyice PAE kullanarak elektrot durulama Bağlama arabellek ve PAE bağlama arabellek elektrot batırmayın.
  8. Bir arka planda kare dalga voltammetry (SWV) tarama PAE bağlama arabellek hedef ücretsiz alın.
    1. Deneysel ekipmanları temiz: elektrolitik hücre, altın çalışma elektrot, Platin sayaç elektrot ve doymuş kalomel referans elektrot (SCE).
    2. Yüklü yazılım etkinleştirmek; SWV ölçümler için deneysel parametrelerini ayarlamak.
      Not: Aşağıdaki deneysel parametreleri SWV deneyler için kullanıldı: potansiyel aralığı: dan-0.2 için 0.7 V; Genlik modülasyonu: 25 mV; darbe genişliği: 5 ms; tarama hızı: 50 mV/s; Adım potansiyeli: 1 mV.
    3. Bir potansiyostat için çalışma elektrot, Platin sayaç elektrot ve SCE altın bağlayın ve bu üç elektrotlar PAE bağlama arabellek içeren bir elektrolitik hücre koydu.
    4. SWV ölçüm çalıştırın.
      Not: Bir kez SWV ölçüm başlatılır, SWV eğri-ecek var olmak göstermek üstünde belgili tanımlık bilgisayar perde. Tarama tarar sabittir ve başka bir değişikliğe pik yüksekliği veya şekil gözlenen kadar yinelenir.
  9. DEHP belirli bir konsantrasyon içeren PAE bağlama arabellek çalışma elektrot bırakın (Örneğin, 10 pM) oda sıcaklığında 30 dakika. İyice PAE bağlama arabellek kullanarak elektrot durulama ve PAE bağlama arabellek SCE ve sayaç elektrot elektrot bırakın. Aynı koşul altında SWV eğrisi 7,8 bölümünde açıklandığı gibi toplamak.
  10. Bunun dışında 7.9, adımı yineleyin DEHP konsantrasyonu (örneğin 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM) ardışık olarak yükseltilmiştir. Titrasyon eğrisi çizmek.
  11. Özgüllük testleri: Adımları 7,3-7,9, DEHP içeren PAE bağlama Arabellek istenen konsantrasyon, potansiyel sokan madde içeren PAE bağlama arabellek değiştirilir dışında yineleyin.

Sonuçlar

Tasarlanmış ve amino grubu functionalized Dibutil ftalat (DBP-NH2) çapa hedef (şekil 1F) sentezlenmiş. Sonra DBP-NH2 çapa hedef olarak ve ardından klasik hedef immobilizasyon tabanlı yöntemi (Resim 2) kullanarak PAEs DNA aptamer seçimi gerçekleştirilir. Her turda bir pilot PCR PCR (şekil 3) döngüsü sayısı en iyi duruma getirmek için denatüre sayfası kullanı...

Tartışmalar

Antikorlar vivo içinde immunoreactions ile oluşturulan iken SELEX, vitro yöntemle tanımlanır aptamers bir üstün faydası nedir. Bu nedenle, antikorlar için fizyolojik koşullar sınırlı ise aptamers iyi tasarlanmış deneysel koşullarda istenen hedef özgüllük ile seçilebilir.

İlişkili sıralar ayrılığı ücretsiz dizilerinden kolaylaştırmak için çeşitli değiştirilmiş SELEX son zamanlarda bildirilmiştir, hangi Kapiler Elektroforez...

Açıklamalar

Yazarlar rakip mali ilgi bildirin.

Teşekkürler

Maddi destek Ulusal Doğa Bilimleri vakıf (21675112), anahtar proje Pekin Eğitim Komisyonu (KZ201710028027) ve Yanjing genç bilim adamı Program, sermaye Normal Üniversitesi bilim ve teknoloji planının minnettarız.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
UV-2550Shimadzu,Japanprotocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200BIO-RADsection 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 TouchBIO-RADsection 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostatBio-Logic Science, Claix, Francesection 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6BGE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)10220020argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beadsInvitrogen, USA420420magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start VersionTakara,Dalian,ChinaR028Apolymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing MembraneBemis, USAPM-996section 3.6.5
Lambda ExonucleaseInvitrogen, USAEN0561section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		Takara,Dalian,China9094section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kitSangon Biotech (Shanghai)B511135section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stainInvitrogen, USA1811838nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq IITakara,Dalian,ChinaRR820Apolymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichCAS: 1132-61-2section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)Invitrogen, USACAS: 25952-53-8section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich6066-82-6section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH)Sigma-AldrichCAS: 1633-78-9section 7.7
Gold electrodeShanghai ChenhuaCHI101section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-AldrichCAS: 51805-45-9section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol)Sigma-AldrichCAS: 651042-82-9section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP)National Institute of Metrology, ChinaCAS: 117-81-7section 7.11
Tween 20Sigma-AldrichCAS: 9005-64-5polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100Sigma-AldrichCAS: 9002-93-1non-ionic surface active agent
PBSSigma-AldrichP536810 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

Referanslar

  1. Vorkamp, K., Riget, F. F. A review of new and current-use contaminants in the Arctic environment: Evidence of long-range transport and indications of bioaccumulation. Chemosphere. 111, 379-395 (2014).
  2. Net, S., Sempere, R., Delmont, A., Paluselli, A., Ouddane, B. Occurrence, fate, behavior and ecotoxicological state of phthalates in different environmental matrices. Environ Sci Technol. 49 (7), 4019-4035 (2015).
  3. Xie, Q. L., Liu, S. H., Fan, Y. Y., Sun, J. Z., Zhang, X. K. Determination of phthalate esters in edible oils by use of QuEChERS coupled with ionic-liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction before high-performance liquid chromatography. Anal BioanalChem. 406 (18), 4563-4569 (2014).
  4. Ierapetritis, I., Lioupis, A., Lampi, E. Determination of phthalates into vegetable oils by isotopic dilution gas chromatography mass spectrometry. Food Anal Methods. 7 (7), 1451-1457 (2014).
  5. Sun, J. Z., He, H., Liu, S. H. Determination of phthalic acid esters in Chinese white spirit using dispersive liquid-liquid microextraction coupled with sweeping beta-cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography. J Sep Sci. 37 (13), 1679-1686 (2014).
  6. Yilmaz, P. K., Ertas, A., Kolak, U. Simultaneous determination of seven phthalic acid esters in beverages using ultrasound and vortex-assisted dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography. J Sep Sci. 37 (16), 2111-2117 (2014).
  7. Sun, R., Zhuang, H. An ultrasensitive gold nanoparticles improved real-time immuno-PCR assay for detecting diethyl phthalate in foodstuff samples. Anal Biochem. 480, 49-57 (2015).
  8. Sun, R. Y., Zhuang, H. S. A sensitive heterogeneous biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of di-(2-ethylhexyl)phthalate (DEHP) in beverages using a specific polyclonal antibody. Anal Methods. 6 (24), 9807-9815 (2014).
  9. Zhou, L., Lei, Y., Zhang, D., Ahmed, S., Chen, S. An ultra-sensitive monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosobent assay for dibutyl phthalate in human urinary. Sci Total Environ. 541, 570-578 (2016).
  10. Shen, J., Li, Y., Gu, H., Xia, F., Zuo, X. Recent development of sandwich assay based on the nanobiotechnologies for proteins, nucleic Acids, small Molecules, and ions. Chem Rev. 114 (15), 7631-7677 (2014).
  11. Yin, X. -. B. Functional nucleic acids for electrochemical and electrochemiluminescent sensing applications. TrAC, Trends Anal Chem. 33, 81-94 (2012).
  12. Nguyen, V. -. T., Kwon, Y. S., Gu, M. B. Aptamer-based environmental biosensors for small molecule contaminants. Curr Opin Biotechnol. 45, 15-23 (2017).
  13. Groher, F., Suess, B. In vitro selection of antibiotic-binding aptamers. Methods. 106, 42-50 (2016).
  14. Yang, K. -. A., Pei, R., Stojanovic, M. N. In vitro selection and amplification protocols for isolation of aptameric sensors for small molecules. Methods. 106, 58-65 (2016).
  15. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal. Chim. Acta. 686 (1-2), 9-18 (2011).
  16. Mehta, J., et al. Selection and characterization of PCB-binding DNA aptamers. Anal Chem. 84 (3), 1669-1676 (2012).
  17. Matsumoto, M., Hirata-Koizumi, M., Ema, M. Potential adverse effects of phthalic acid esters on human health: A review of recent studies on reproduction. Regul Toxicol Pharm. 50 (1), 37-49 (2008).
  18. Goodchild, J. Conjugates of oligonucleotides and modified oligonucleotides: a review of their synthesis and properties. Bioconjug Chem. 1 (3), 165-187 (1990).
  19. Brown, D. M. A brief history of oligonucleotide synthesis. Protocols for Oligonucleotides and Analogs: Synthesis and Properties. , 1-17 (1993).
  20. Reese, C. B. Oligo-and poly-nucleotides: 50 years of chemical synthesis. Org Biomol Chem. 3 (21), 3851-3868 (2005).
  21. Sproat, B., Colonna, F., Mullah, B., et al. An efficient method for the isolation and purification of oligoribonucleotides. Nucleos Nucleot Nucl. 14 (1-2), 255-273 (1995).
  22. Han, Y., et al. Selection of group-specific phthalic acid esters binding DNA aptamers via rationally designed target immobilization and applications for ultrasensitive and highly selective detection of phthalic acid esters. Anal Chem. 89 (10), 5270-5277 (2017).
  23. Bartlett, J. M. S., Stirling, D. A short history of the polymerase chain reaction. PCR protocols. , 3-6 (2003).
  24. Saiki, R. K., Scharf, S., Faloona, F., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 230, 1350-1354 (1985).
  25. Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. , A. 3B 1-A. 3B 5 (2001).
  26. Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). JoVE. (32), e1485 (2009).
  27. Jing, M., Bowser, M. T. Methods for measuring aptamer-protein equilibria: a review. Anal Chim Acta. 686 (1), 9-18 (2011).
  28. Sharma, T. K., Bruno, J. G., Dhiman, A. ABCs of DNA aptamer and related assay development. Biotechnol Adv. 35 (2), 275-301 (2017).
  29. Liu, R., et al. Signaling-probe displacement electrochemical aptamer-based sensor (SD-EAB) for detection of nanomolar kanamycin A. Electrochim Acta. 182, 516-523 (2015).
  30. Mendonsa, S. D., Bowser, M. T. In vitro evolution of functional DNA using capillary electrophoresis. J Am Chem Soc. 126, 20-21 (2004).
  31. Lou, X. H., et al. Micromagnetic selection of aptamers in microfluidic channels. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 2989-2994 (2009).
  32. Cho, M., et al. Quantitative selection of DNA aptamers through microfluidic selection and high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15373-15378 (2010).
  33. Cho, M., et al. Quantitative selection and parallel characterization of aptamers. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (46), 18460-18465 (2013).
  34. Song, K. -. M., et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. Anal Biochem. 415 (2), 175-181 (2011).
  35. Yang, Z., Ding, X., Guo, Q., et al. Second generation of signaling-probe displacement electrochemical aptasensor for detection of picomolar ampicillin and sulfadimethoxine. Sens Actuators B. 253 (2017), 1129-1136 (2017).
  36. Lou, X., Zhao, T., Liu, R., Ma, J., Xiao, Y. Self-assembled DNA monolayer buffered dynamic ranges of mercuric electrochemical sensor. Anal Chem. 85 (15), 7574-7580 (2013).
  37. Zhao, T., et al. Nanoprobe-enhanced, split aptamer-based electrochemical sandwich assay for ultrasensitive detection of small molecules. Anal Chem. 87 (15), 7712-7719 (2015).
  38. Lou, X., He, L. A. Surface passivation using oligo(ethylene glycol) in ATRP-assisted DNA detection. Sens Actuators,B. 129 (1), 225-230 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kimyasay 133Aptamerse immaddedir asit esterlerigruba zghidrofobik k k molek llernicel polimerizasyon zincirleme reaksiyonelektrokimyasal aptasensorkal c organik kirleticiler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır