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Resumo

É apresentado um protocolo para a seleção em vitro e caracterização de aptamers de DNA de ligação éster ácido ftálico de grupo específico. A aplicação do aptamer selecionado em um aptasensor eletroquímico também está incluída.

Resumo

Ácido ftálico ésteres (PAEs) é um dos principais grupos de poluentes orgânicos persistentes. A detecção de grupo específico de PAEs é altamente desejada devido ao rápido crescimento de congêneres. Aptamers de DNA foram cada vez mais aplicadas como elementos de reconhecimento em plataformas biosensor, mas selecionando aptamers em direção a alvos altamente hidrofóbicos pequena molécula, como PAEs, é raramente relatada. Este trabalho descreve um método baseado em talão projetado para selecionar aptamers de DNA específicas do grupo de PAEs. O grupo amino acrescida Dibutilftalato (DBP-NH2) como o alvo de âncora foi sintetizado e imobilizado sobre os grânulos de agarose epóxi-ativado, permitindo que a exibição do grupo éster anidridos ftálico na superfície da matriz de imobilização, e por conseguinte, a seleção dos fichários do grupo específico. Determinamos as constantes de dissociação dos candidatos aptamer pela reacção em cadeia quantitativa polimerização juntamente com separação magnética. O relativas afinidades e seletividade da aptamers a outros PAEs foram determinadas por ensaios competitivos, onde os candidatos aptamer foram previamente delimitados ao DBP-NH2 anexado grânulos magnéticos e lançado para o sobrenadante após incubação com os PAEs testados ou outras substâncias interferentes potenciais. O ensaio do competidor foi aplicado porque permitia uma comparação facile afinidade entre PAEs que não tinha nenhum grupos funcionais para a imobilização de superfície. Finalmente, demonstrou a fabricação de um aptasensor eletroquímico e usou para detecção ultra-sensível e seletiva de ftalato de bis(2-ethylhexyl). Este protocolo fornece insights para a descoberta de aptamer de outras pequenas moléculas hidrofóbicas.

Introdução

Juntamente com o rápido desenvolvimento econômico, a aceleração da industrialização e a construção urbana, poluição ambiental é mais grave do que nunca. Poluentes ambientais típicos incluem íons de metais pesados, toxinas, antibióticos, pesticidas, Disruptores endócrinos e poluentes orgânicos persistentes (POPs). Íons metálicos e toxinas, além de outros poluentes são pequenas moléculas que muito frequentemente consistem em uma variedade de congêneres. Por exemplo, os POPs mais tóxicos incluem bifenilos policlorados (PCBs), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAP), éteres de bifenil polibromados (PBDEs), polychlorinated dibenzo-p-dioxina (PCDD), Dibenzofurano policlorados (PCDF) e anidridos ftálico ésteres do ácido (PAEs)1,2, compostas de muitos congéneres. Principalmente a detecção de pequena molécula tem sido executada por técnicas baseadas em espectrometria de cromatografia de massa devido a sua diversidade de aplicações3,4,5,6. Para a detecção no local, métodos baseados em anticorpos foram recentemente desenvolvidos7,8,9. No entanto, uma vez que esses métodos são altamente específicos para um determinado congénere, vários testes devem ser executados. O mais grave é que o romance congêneres crescerem tão rápido que seus anticorpos não podem ser gerados em tempo. Portanto, o desenvolvimento de biossensores de grupo específicas para monitorar os níveis totais de todos os congêneres em um teste pode fornecer uma métrica inestimável para avaliação do estado de poluição ambiental.

Recentemente, aptamers de ácido nucleico foram aplicados extensamente como elementos de reconhecimento em várias plataformas biosensing devido à sua capacidade de reconhecer uma grande variedade de destinos, de íons e pequenas moléculas de proteínas e células10,11 ,12. Aptamers são identificados através de um método em vitro chamado evolução sistemática de ligantes pelo enriquecimento exponencial (SELEX)13,14. SELEX começa com biblioteca aleatória sintético único fio do oligonucleotide, que contém aproximadamente 10 sequências15 14-10. O tamanho da biblioteca aleatória assegura a diversidade das estruturas de candidato de RNA ou DNA. Processo SELEX típico consiste de várias rodadas de enriquecimento até a biblioteca é enriquecida em sequências com alta afinidade e especificidade para o alvo. A piscina enriquecida final então é sequenciada, e as constantes de dissociação (Kd) e seletividade contra potencial substâncias interferentes são determinadas por diferentes técnicas tais como filtram binding, cromatografia de afinidade, superfície Plasmon ressonância (SPR), etc. 15

Devido a solubilidade em água extremamente pobre e falta de grupos funcionais para a imobilização de superfície, a seleção de aptamer de POPs é teoricamente difícil. Avanços significativos para SELEX aceleraram a descoberta de aptamers. No entanto, a seleção do grupo específico aptamers de POPs não ainda foi relatada. Até agora, apenas PCB-ligação DNA aptamers com elevada especificidade para um determinado congénere foram identificados16. PAEs são usados principalmente em materiais de policloreto de vinila, mudando de cloreto de polivinila de um plástico duro para um plástico elástico, agindo assim como um plastificante. Alguns PAEs foram identificados como desreguladores endócrinos, pode causar graves danos ao fígado e rins, reduzir a motilidade do esperma masculina e pode resultar em morfologia do esperma anormal e câncer testicular17. O composto - nem aptamers de PAE-obrigatórias específicas do grupo têm sido relatados.

O objetivo deste trabalho é fornecer um protocolo representativo para a seleção de aptamers de DNA específicas do grupo de altamente hidrofóbicas moléculas pequenas tais como PAEs, um grupo representativo de POPs. Podemos também demonstrar a aplicação do aptamer selecionado para a deteção de poluição ambiental. Este protocolo fornece orientação e insights para a descoberta de aptamer de outras pequenas moléculas hidrofóbicas.

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Protocolo

1. biblioteca e Primer Design e síntese

  1. Projetar a biblioteca inicial e primers.
    Biblioteca (piscina0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    Encaminhar a cartilha (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Fosforiladas primeira demão reversa (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. Sintetizar a piscina0, FP e PO4- RP usando padrão phosphoramidite química18,19,20e purificar todos os DNAs por padrão cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)21.
  3. Reconstituir a piscina0, FP e PO4- RP na série livre de nuclease água a 100 µM, alíquota e armazená-los no -20 ou -80 ° C por até um ano.
    Nota: É fortemente aconselhável para armazenar piscina0, FP e PO4- RP em alíquotas de 10-20 µ l para evitar a possível contaminação cruzada.

2. sintetizar o alvo de âncora e sua imobilização no grânulo de Agarose epóxi-ativado

  1. Sintetiza o grupo amino acrescido Dibutilftalato (DBP-NH2) como o destino de âncora.
    Nota: Os detalhes experimentais sobre a síntese e caracterização de DBP-NH2 têm sido descritos na literatura22.
  2. Prepare a âncora soluções estoque de destino em um meio apropriado para a solubilidade de alvo. Para este estudo, preparar solução estoque de 100 mM DBP-NH2 em dimetilsulfóxido (DMSO) e armazenar a solução às 4 ou a-20 ° C por até um ano.
  3. Imobilize o DBP-NH2 em grânulos de agarose epóxi-ativado, de acordo com um protocolo modificado do fabricante.
    1. Pesar 0,1 g de pó de liofilizados de grânulos de agarose epóxi-ativado e suspendê-la em água destilada. Lave o médio por 1h usando 20 mL de água destilada adicionada em várias alíquotas. Lave o meio com 0,2 M Na2CO3 (pH 12).
      Nota: O meio incha imediatamente após a adição da água nele.
    2. Dissolva o DBP-NH2 (46,7 mg, 0,15 mmol) no buffer de acoplamento de 500 µ l (tampão de3 do2CO de nd de 0,2 M).
    3. Misture a solução de acoplamento contendo o ligante com o meio. Use um agitador a 5 rpm para 48 h à temperatura ambiente.
    4. Repetir a lavagem do produto três vezes, sequencialmente utilizando 0,1 M de tampão de acetato (NaCl 0,5 M, pH 4.5) e 0.2 M carbonato de tampão (NaCl 0,5 M, pH 12) em cada ciclo de lavagem. Lave e suspender o produto em água para fazer o volume final de 500 µ l.
    5. Armazene o produto em 4 ° C antes de usar.
    6. Confirme o sucesso de imobilização do alvo por análise elementar.

3. SELEX

  1. Preparar 500 mL de tampão de ligação PAE em água ultra pura ou água livre de nuclease grau com 20mm Tris· HCl, NaCl a 100 mM, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1% polyoxyethy-lene (20) monolaurato de sorbaitan e agente não-iônico superfície ativa de 0,03% (pH 7.9). O buffer do filtro através de um filtro de nitrocelulose de 0,22 µm estéril e armazená-lo a uma temperatura superior a 20 ° C durante meses.
    Nota: É fundamental para manter um status de boa dispersão de PAEs em tampão de ligação do PAE. Vários tipos de surfactantes são necessários para aumentar a solubilidade de PAEs em solução aquosa. No entanto, o número de agentes de superfície deve ser mantido a um mínimo para evitar a formação de micelas de surfactante que seria encapsular as moléculas do PAE. Não-iônica, agente ativo de superfície é fácil para precipitar a temperaturas inferiores a 20 ° C, e, portanto, o buffer deve ser armazenado a uma temperatura superior a 20 ° C.
  2. Dilua 10 µ l de 100 µM piscina0(~1.0 nmol por 10 sequências de15 14-10) em 490 µ l de tampão de ligação do PAE. As alíquotas de0 de piscina (5 × 100 µ l) de calor em tubos de parede fina centrífuga no conjunto de banho de água a 95 ° C por 10 min. do lugar os tubos em gelo por 5 min e posteriormente incubar os tubos por 5 min à temperatura ambiente (~ 25 ° C neste trabalho).
  3. A primeira rodada de seleção: incubação de piscina0 e meio de −coated de2DBP−NH.
    1. Lave a 200 µ l de meio de −coated de2DBP−NH três vezes com 500 µ l de tampão de ligação do PAE. Meio de −coated de2Mix DBP−NH com piscina0 e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 1 h, sob agitação suave.
    2. Separado o meio de −coated de2DBP−NH vinculada com aptamers dos DNAs não vinculados pelo tubo de ultrafiltração ultrafiltração usando com um corte molecular de 100 kDa. Lavar o meio três vezes com 500 µ l de tampão de ligação do PAE e centrifugar a 9.168 × g por 10 min a 4 ° C.
  4. A primeira rodada de seleção: aptamer eluição de meio de −coated de2DBP−NH.
    1. Adicione 50 µ l de tampão de ligação do PAE para o médio lavado e calor a mistura a 90 ° C para 9 min sob agitação.
    2. Recolha o sobrenadante contendo os DNAs eluted por ultrafiltração. Repita este processo de eluição três vezes para recuperar mais limite DNAs.
  5. A primeira rodada de seleção: PCR
    1. Pequena escala do PCR
      1. Realizar uma pequena escala PCR23 (4 × 20 alíquotas de µ l) usando ~ 15-30 ciclos. Configurar uma reação de PCR24 da seguinte maneira: 6,5 µ l de água livre de RNase, 1 µ l de primer de 10 µM cada (FP, PO4- RP, 0,01 nmol cada), 1,5 µ l eluída piscina na seção 3.4 (ou água livre de RNase como controle negativo) e 10 µ l de pré-misturado reação mistura contendo dNTPs, quentes começar a polimerase e tampão de reação de PCR de × 2 (20mm tris· HCl, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3).
      2. Executar o PCR usando um termociclador com as seguintes configurações: 1 ciclo de 95 ° C, 1 min; 30 ciclos de [95 ° C, 30 s; 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 ciclo de 72 ° C, 2 min e espera a 4 ° C. Quando o instrumento está executando que a 20th s as etapas de extensão em 15, 20, 25 e 30 ciclos, pressione a tecla pause, abra a tampa do instrumento e pegue um tubo para fora, então pressione a tecla pause novamente para retomar a PCR.
      3. Prepare-se 12% desnaturado do gel de polyacrylamide electroforese (página)25,26. Misturar 4,8 g de ureia, 6 mL de água ultra pura, 1 mL de ácido bórico/tris de 10 × / ácido etilenodiaminotetracético (TBE), 3 mL de 40% do acrilamido, 10 µ l de tempted (TEMED) e 100 µ l 10% persulfato de amónio (APS), nessa ordem. Mexa bem e espere por 1,5 a 2 h garantir que o gel completamente se solidifica.
      4. Analisar os resultados da otimização ciclo: combinar 1 µ l de cada produto PCR com 5 µ l de tampão de carregamento de RNA (62,5% formamida, formaldeído 0,4 M, 1.25×3-(N-morpholino) tampão de ácido propansulfonic, 0,02% xileno cianol FF, bromofenol 0,02%) e 4 µ l de Água livre de RNase; Aqueça a mistura a 95 ° C por 10 min e resfriá-lo rapidamente para 0 ° C no gelo; Incubar durante 5 min à temperatura ambiente; carga em 5 poços separados dos 12% desnaturado página; Execute eletroforese por um sistema de eletroforese vertical no amortecedor de TBE 1 × em 170 V por 45 min.
      5. Após a electroforese, mancha o gel com 3 µ l de gel de ácido nucleico 1 × mancha em 30 mL de 1 × amortecedor de TBE por 10 min e ter uma imagem do gel.
    2. Grande escala PCR: selecione o número apropriado de ciclos para produzir a maior banda de intensidade no marcador do tamanho correto sem subprodutos indesejados. Realize uma grande escala PCR (alíquotas de 20 × 100 µ l) utilizando as condições e o número apropriado de ciclos de determinado no ponto 3.5.1.
      Nota: A quantidade final de single-stranded biblioteca que pode ser obtida é proporcional ao volume total de PCR, não a concentração de modelo. Normalmente, para obter 1 nmol de biblioteca, single-stranded piscina precisa de 2ml PCR. O PCR é muito sensível e facilmente contaminadas pelo exteriores DNAs. Devem ser tomadas medidas para reduzir a possibilidade de contaminação, tais como luvas, usando dicas esterilizadas, não cuspir nos tubos e não abrir a tampa do tubo do PCR antes da centrifugação.
  6. A primeira rodada de seleção: purificação do produto do PCR por precipitação do álcool etílico.
    1. Combine dois tubos de mistura PCR em um tubo (200 µ l cada). Repita isto para todos os tubos.
    2. Adicione 15 µ l de solução de acetato (3 M, pH 5.2) de sódio, 4 µ l da solução de transportadora de precipitação de DNA/RNA e 2,5 vezes o volume de etanol pre-refrigeração a-20 ° C a cada tubo. Misturá-los uniformemente.
      Nota: Portador de precipitação de DNA/RNA é amplamente utilizado em experimentos de precipitação de etanol para melhorar significativamente a percentagem de recuperação do DNA/RNA em baixas concentrações. Que não interfira com aplicações a jusante, tais como a PCR e sequenciamento.
    3. Centrifugue a mistura no 20.627 × g por 20 min a 4 ° C e cuidadosamente descartar o sobrenadante e precipitado branco.
    4. Adicione 400 µ l de 70% de solução de etanol a-20 ° C o pré-resfriamento em cada tubo para lavar a precipitação. Centrifugue a mistura no 20.627 × g por 5 min a 4 ° C e cuidadosamente descartar o sobrenadante e precipitado branco. Repita a etapa de lavagem mais duas vezes.
    5. Abra a tampa do tubo; picar a membrana de vedação; Deixe o etanol volatilize a 40 ° C, no bloco de aquecimento até que o precipitado branco se torna transparente. Armazenar o precipitado a-20 ° C.
      Nota: O produto do PCR purificado pode ser armazenado a-20 ° C.
  7. A primeira rodada de seleção: single-stranded DNA geração (de piscina enriquecido1), realizando a reação do exonuclease λ para digerir a vertente inversa fosforilada.
    1. Reação de exonuclease λ de pequena escala
      1. Adicione 100 µ l de água livre de RNase para um tubo contendo o produto do PCR purificado da seção 3.6. O tubo para dissolver completamente o precipitado no tubo de vórtice.
      2. Prepare cinco tubos de centrífuga e adicionar 5 µ l da solução acima, 11 µ l de RNase - água livre e 2 µ l de tampão de reação 10 × (glicina-KOH 670 mM, 25 mM MgCl2 , 0,1% (v/v) pH Triton X-100 9.4) em cada tubo.
      3. Adicione 2 µ l de água ou λ diluídos do exonuclease solução contendo 2 U, 5 U, U de 8 e 10 exonuclease λ U para esses tubos, respectivamente. Misture a solução bem pipetando suavemente. O amortecedor da reação × 10 é fornecido juntamente com λ exonucleasefrom o provedor.
      4. Incubar os tubos por 35 min a 37 ° C, 15 min a 80 ° C e mantenha a 4 ° C.
      5. Prepare o 12% nativo página. Misture 6 mL de água ultra pura, 1 mL de 10 × TBE, 3 mL de 100 µ l de 10%, 40% do acrilamido e 10 µ l de TEMED APS, nessa ordem. Mexa bem e espere por 60-90 min garantir que o gel completamente se solidifica.
      6. Analise os resultados das reações combinando 5 µ l de cada reação com 1 µ l de carregamento de tintura e 4 µ l de água livre de RNase e carregar essas misturas em 5 poços separados de 12% nativo página (150 V por 45 min).
        Nota: Uma escada de DNA dupla-hélice bp 20 também pode ser carregados no gel, mas pode não ser necessário já que as bandas distintas do produto do PCR e a biblioteca encalhada única gerada mostram no gel.
        Nota: A reação do exonuclease λ tem uma excelente seletividade estrutural. O produto PCR de double-stranded (anti-sentido strand é rotulado com um grupo de fosfato na extremidade 5') pode ser completamente digerido em uma biblioteca de single-stranded na presença do exonuclease λ em uma gama bastante ampla de concentração (Figura 4). A quantidade mínima de exonuclease λ que completamente pode gerar ADN single-stranded na reação do exonuclease λ de pequena escala também é usada para a reação de exonuclease λ em grande escala. Uma maior concentração de exonuclease λ pode também ser utilizada, desde que exonuclease λ funciona bem em uma gama ampla de concentração sem perder sua estrutura seletividade e produto de rendimento. A reação do exonuclease λ é inibida pela alta concentração de sal. A digestão incompleta do produto do PCR geralmente implique a existência de muito sal no produto do PCR. A purificação de produtos PCR por precipitação do álcool etílico (seção 3.6) é geralmente compatível com este passo, enquanto o produto do PCR, purificado pela precipitação do isopropanol, muitas vezes contém muito sal.
    2. Reação de exonuclease λ em grande escala: Escolha a quantidade mínima de exonuclease λ que completamente pode gerar single-stranded DNAs para a reação de exonuclease λ em grande escala. A reação é dimensionada proporcionalmente de acordo com esta condição. Por exemplo: se 2 U é a quantidade mínima de exonuclease λ necessário, misture 38 µ l de água livre de Rnase, 10 µ l de tampão de 10x, 50 µ l de DNA piscina1 e 2 µ l de 10 do exonuclease λ U / µ l.
  8. a primeira rodada de seleção: purificação do single-stranded piscina1 pela precipitação do álcool etílico.
    1. Siga as instruções do passo 3.6.
    2. Determinar a concentração de purificado piscina1 pela absorção de UV a 260 nm.
    3. Reconstitua o 90% purificado piscina1 em um volume adequado de tampão de ligação do PAE. Se não houver suficiente DNA obtido para a próxima rodada de seleção, repita seções 3.5-3.8.2.
      Nota: O volume de tampão de ligação PAE normalmente varia de 200 a 500 µ l de acordo com a quantidade de biblioteca e a concentração final desejada da biblioteca na próxima rodada da SELEX.
  9. A segunda, terceira, quarta e quinta rodadas de SELEX.
    1. Realizar a segunda, terceira, quarta e quinta rodadas de SELEX posteriormente, seguindo o mesmo procedimento descrito acima (seção 3.2-3,8), exceto que a biblioteca de ~ 300 pmol era entrada para aumentar o rigor da seleção.
    2. Para minimizar a absorção inespecífica de DNAs no meio, incubar a piscina com médio não modificado em um agitador rotativo por 30 min na terceira e quarta rodada de seleção antes da incubação com o meio de −coated de2DBP−NH.
      Nota: O SELEX processo terminado no quinto round devido a grave crosslink entre DNAs revelada pela grande quantidade de produto de alto peso molecular que não migra no gel.

4. high-Throughput sequenciamento

  1. Prepare a piscina4 da seção 3.9.2 para sequenciamento por amplificação por PCR com primers compatíveis.
    1. Projetar e sintetizar um primer frente indexado com 6 nt na extremidade 5 ' para facilitar a análise de sequência.
      Indexados para a frente da primeira demão (FP-sequenciamento): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. Configurar uma reação de 1.000 µLPCR como segue: 380 µ l de água livre de RNase, 50 µ l de cada primer de 10 µM (FP-sequenciamento, PO4- RP, 0,5 nmol cada), 20 µ l de eluted piscina da seção 3.9.2 e 500 µ l do pré-misturado mistura reacional contendo dNTPs, começo hot polimerase e 2 × amortecedor da reação PCR. Alíquota a mistura em 10 tubos PCR. Use as mesmas condições PCR conforme descrito na seção 3.5.1.2.
  2. Purifica o produto do PCR para atender aos requisitos da instalação sequenciamento. Por exemplo, use o kit de recuperação do DNA página-gel de acordo com as instruções do fabricante.
  3. Envie o produto PCR purificado (~ 2 µ g) para uma instalação de sequenciamento sob as condições de transporte exigidas pela facilidade de sequenciamento. Por exemplo, envie o produto PCR num tubo de centrífuga com tampas completamente seladas com blocos de gelo para as instalações de sequenciamento.
    Nota: Recebeu os resultados que classificou as sequências de acordo com o número de cópia de cada sequência para avaliar o enriquecimento da piscina sequenciado. A sequência superior foi nomeada DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). Sua afinidade e seletividade foram medidos pelo seguinte protocolo (seção 5 e 6). Sua aplicação em uma bio-sensor eletroquímico demonstrou-se posteriormente na seção 7.

5. Kd determinação de selecionado Aptamer candidatos usando a Magnetic Bead-Based PCR quantitativo (qPCR)

  1. Sintetizar DBP-1-qPCR e primers usando padrão phosphoramidite química e purificá-la por padrão HPLC.
    Aptamer candidato (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    Encaminhar a cartilha para qPCR (FP-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    Reverter a cartilha para qPCR (RP-qPCR): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    Nota: As regiões de cartilha da sequência testada são diferentes de piscina0 usado na seção 3. O objetivo de mudar as regiões de cartilha é testar a afinidade da sequência principal sozinha, excluindo as regiões da primeira demão.
  2. Imobilize o DBP-NH2 em grânulos magnéticos revestido-ácido carboxílico, seguindo as instruções do fabricante.
    1. Lave os grânulos magnéticos revestido ácido carboxílico duas vezes com 25 mM 2-(N-Morpholinos) etanesulfónico ácido (MES) (pH 5.0), usando pipetado um volume igual de grânulos magnéticos (100 µ l) fora do frasco, por 10 min com boa mistura (extremidade-sobre-extremidade ou similar).
    2. Imediatamente antes do uso, prepare 50 mg/mL de solução de cloridrato (EDC) carbodiimida 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) com frio 25mm MES (pH 5.0).
    3. Imediatamente antes do uso, prepare 50 mg/mL de solução de N-Hidroxisuccinimida (NHS) com frio 25mm MES (pH 5.0).
    4. Misturar 100 µ l de solução EDC e 100 µ l de solução de NHS com os grânulos lavados e incube por 30 minutos em temperatura ambiente com inclinação lenta rotação.
    5. Colocar o tubo em um ímã para 4 min após a incubação, desprezar o sobrenadante e lavar grânulos duas vezes com 100 µ l de 25mm frio MES (pH 5.0).
    6. Incube a 6 µ l de solução-mãe de 100mm DBP-NH2 e 25 mM MES (pH 5,0, 290 µ l) com os grânulos registrados sob rotação pelo menos 30 min à temperatura ambiente ou 2 h a 4 ° C, com rotação lenta inclinação a 5 rpm.
    7. Colocar o tubo sobre o ímã para 4 min após a incubação e descartar o sobrenadante. Lave os grânulos revestidos 4 vezes e ressuspender grânulos com 200 µ l de tampão de ligação do PAE e loja a 4 ° C até o uso.
  3. Recolha a curva de titulação para determinar Kd.
    1. Preparar uma série de soluções de DBP-1 (500 µ l) em concentrações variadas em tampão de ligação de PAE de 13:00 a 300 nM.
    2. Adicionar 10 µ l de DBP-NH2-revestido grânulos magnéticos conforme descrito na seção 5.2.7 para cada solução de DBP-1. Encube por 1h à temperatura ambiente sob rotação.
    3. Coloque os tubos em um ímã para 4 min e retirar o sobrenadante. Lave os grânulos 4 vezes usando 200 µ l de tampão de ligação do PAE.
    4. Adicione 60 µ l de tampão de ligação do PAE para cada tubo. Incube os tubos a 95 ° C por 15 min. recolher o sobrenadante contendo o DBP-1 eluted por separação magnética. Repita este processo de eluição para recuperar mais limite DBP-1.
    5. Diluir a solução elute 100-fold e tomar 3 µ l para qPCR em tempo real. Configurar uma reação qPCR como segue: 3 µ l de água livre de RNase, 2 µ l de primer de 10 µM cada (FP, PO4- RP, 0,01 nmol cada), 3 µ l de eluída e diluído DBP-1 e 10 µ l de pré-misturado mistura reacional contendo dNTPs, polimerase e 2 amortecedor da reação x PCR.
    6. Determinar os números de DBP-1 em cada amostra executando qPCR usando um termociclador com as seguintes configurações: 1 ciclo de 95 ° C, 30 s; 30 ciclos de [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 ciclo de 72 ° C, 30 s e espera a 4 ° C.
    7. Traçar a curva de titulação e determinar Kd por meio de montagem não-linear da curva assumindo um rácio de 1:1 ligação27.

6. relativa afinidade e especificidade teste por ensaios competitivos

  1. Adicionar 10 µ l de DBP-NH2-revestido grânulos magnéticos para solução de DBP-1 (500 µ l, 1 µM). Encube por 1h à temperatura ambiente sob rotação. Coloque os tubos em um ímã para 4 min e retirar o sobrenadante. Lave os grânulos 4 vezes usando 200 µ l de tampão de ligação do PAE e Resuspenda-lo em 10 µ l de tampão de ligação do PAE.
  2. Adicionar 10 µ l de DBP-NH2-limite médio revestido com DBP-1 a 110 µ l de cada 10 µM testado amostra (DBP-NH2, DBP, DEHP, butil benzil phthalate(BBP), íons de metais pesados, etc.) Incube a temperatura ambiente durante 1 h. recolher o sobrenadante por separação magnética.
  3. Diluir o sobrenadante 100-fold e tomar 3 µ l para quantificação de qPCR. Configurar uma reação qPCR como segue: 3 µ l de água livre de RNase, 2 µ l de primer de 10 µM cada (FP, PO4- RP, 0,01 nmol cada), 3 µ l de eluída e diluído DBP-1 e 10 µ l de pré-misturado mistura reacional contendo dNTPs, polimerase e 2 amortecedor da reação x PCR.
  4. Determinar os números de DBP-1 em cada amostra executando qPCR usando um termociclador com as seguintes configurações: 1 ciclo de 95 ° C, 30 s; 30 ciclos de [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 ciclo de 72 ° C, 30 s e espera a 4 ° C.
  5. Calcular a afinidade relativa, dividindo o número de DBP-1 lançado de grânulos na presença da amostra pelo número de DBP-1 lançado de grânulos no buffer de vinculação de PAE: afinidade relativa =reserva/n daamostraN.

7. fabricação e medições eletroquímicas de DEHP biossensores eletroquímicos

  1. Sintetizar a sequência do núcleo thiolated (HS-DBP-1) e a sonda sinalização (DBP-1-C-Fc), usando padrão phosphoramidite química e purificá-la por padrão HPLC.
    HS-DBP-1: 5' - HS-(CH2)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3 '
    DBP-1-C-Fc: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc -3'
    Nota: O projeto racional das sondas sensor foi descrito em nosso anterior pbulications18,22.
  2. Reconstituir o HS-DBP-1 e DBP-1-C-Fc em água de grau nuclease-livre a 100 µM, alíquota e armazená-los no -20 ou -80 ° C por até um ano.
  3. Polir o eletrodo de ouro com cuidado para uma superfície espelho com 1, 0,3 e 0,05 µm pó de3 Al2O em um microcloth por 5 min e proceda à sonicação-em água ultrapura por 5 min remover residual Al2O3. Em seguida, limpe o eletrodo por polimento eletroquímico com 35 varreduras sucessivas voltametria cíclica (CV) de 0,4 para + 1,2 V (vs Hg-Hg2SO4) em 0,5 M H2SO4 a 100 mV/s.
  4. Prepare uma mistura de 0,5 µM HS-DBP-1 e 0,5 µM DBP-1-C-Fc em 100 µ l 10 mM fosfato de tampão contendo 1 M NaCl, pH 7,4 (PBS). Aqueça a mistura no tubo de centrífuga de parede fina no conjunto de banho de água a 95 ° C por 10 min e esfriar lentamente a mistura à temperatura ambiente.
  5. Adicione 1 µ l de cloridrato de-(2-carboxyethyl)-fosfina tris (TCEP, 10 mM, solução estoque) na mistura. Manter à temperatura ambiente durante 1 h.
  6. Mergulhe o eletrodo limpo ouro na solução acima para 12 h, ou uma noite em temperatura ambiente.
  7. Lave o eletrodo com PBS e mergulhe o eletrodo em 1 mM [S (CH2)2(OCH2CH2)6OCH3]2 (HS-EG6- OMe) em PBS por 1 h. enxaguar o eletrodo completamente usando o PAE tampão de ligação e mergulhe o eletrodo no buffer de vinculação do PAE.
  8. Leve uma verificação em segundo plano onda quadrada (SWV) de voltametria em tampão de ligação PAE alvo livre.
    1. Limpar todo o equipamento experimental: células electrolíticas, ouro elétrodo trabalhando, contador de platina e eletrodo de referência de calomelano saturado (SCE).
    2. Ativar o software instalado; Defina os parâmetros experimentais para medições de SWV.
      Nota: Os seguintes parâmetros experimentais foram utilizados para os experimentos SWV: alcance potencial: de-0.2 0,7 V; amplitude de modulação: 25 mV; largura de pulso: 5 ms; taxa de varredura: 50 mV/s; potencial de passo: 1 mV.
    3. Conectar o elétrodo, contador de platina e SCE a trabalhar para um potentiostat de ouro e colocar esses três eletrodos numa célula eletrolítica contendo tampão de ligação do PAE.
    4. Execute a medição SWV.
      Nota: Uma vez o SWV medição começa, uma curva SWV será exibido na tela do computador. A verificação é repetida até que os exames são constantes e nenhuma outra alteração na altura do pico ou forma é observadas.
  9. Mergulhe o eletrodo de trabalho no buffer de vinculação de PAE que contém uma certa concentração de DEHP (e.g., 22:00) por 30 min à temperatura ambiente. Enxaguar o eletrodo completamente usando o buffer de vinculação do PAE e mergulhe o eletrodo em tampão de ligação PAE com o elétrodo contrário e SCE. Conforme descrito na seção 7.8, recolha a curva SWV sob a mesma condição.
  10. Repita a etapa 7,9, exceto que a concentração de DEHP (por exemplo 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM) foi aumentada em sequência. Traça a curva de titulação.
  11. Testes de especificidade: Repita as etapas 7.3-7,9, exceto que o buffer de vincular PAE contendo DEHP é substituído pelo buffer de vinculação do PAE que contenha a substância interferente potencial na concentração desejada.

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Resultados

Projetamos e sintetizado o grupo amino acrescido Dibutilftalato (DBP-NH2) como o destino de âncora (Figura 1F). Em seguida, realizamos a seleção de aptamer do DNA de PAEs usando DBP-NH2 como o destino de âncora e seguindo o método baseado em imobilização clássica do alvo (Figura 2). Em cada rodada, um piloto PCR foi realizada usando a página desnaturada para otimizar o número de ciclo de PCR (

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Discussão

Um excelente benefício de aptamers é que são identificados por meio do método em vitro SELEX, enquanto os anticorpos são gerados através de immunoreactions na vivo . Portanto, aptamers pode ser selecionado com a especificidade do alvo desejado sob condições experimentais bem projetadas, Considerando que os anticorpos estão limitados às condições fisiológicas.

Para facilitar a separação de sequências de limite de sequências gratuito, vários SELEX modificados ...

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Divulgações

Os autores não declaram nenhum interesse financeiro concorrente.

Agradecimentos

Estamos gratos pelo apoio financeiro da Fundação Nacional de ciências naturais (21675112), projeto chave do plano de ciência e tecnologia da Comissão de educação de Beijing (KZ201710028027) e programa Yanjing jovem estudioso da Capital Normal University.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
UV-2550Shimadzu,Japanprotocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200BIO-RADsection 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 TouchBIO-RADsection 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostatBio-Logic Science, Claix, Francesection 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6BGE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)10220020argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beadsInvitrogen, USA420420magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start VersionTakara,Dalian,ChinaR028Apolymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing MembraneBemis, USAPM-996section 3.6.5
Lambda ExonucleaseInvitrogen, USAEN0561section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		Takara,Dalian,China9094section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kitSangon Biotech (Shanghai)B511135section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stainInvitrogen, USA1811838nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq IITakara,Dalian,ChinaRR820Apolymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichCAS: 1132-61-2section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)Invitrogen, USACAS: 25952-53-8section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich6066-82-6section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH)Sigma-AldrichCAS: 1633-78-9section 7.7
Gold electrodeShanghai ChenhuaCHI101section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-AldrichCAS: 51805-45-9section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol)Sigma-AldrichCAS: 651042-82-9section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP)National Institute of Metrology, ChinaCAS: 117-81-7section 7.11
Tween 20Sigma-AldrichCAS: 9005-64-5polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100Sigma-AldrichCAS: 9002-93-1non-ionic surface active agent
PBSSigma-AldrichP536810 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

Referências

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