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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Un protocollo per la selezione in vitro e caratterizzazione di aptameri di DNA specifico del gruppo acido ftalico estere-associazione è presentato. È inclusa anche l'applicazione dell'aptamero selezionato in un aptasensor elettrochimico.

Abstract

Acido ftalico esteri (PAEs) sonouno dei principali gruppi di inquinanti organici persistenti. La rilevazione di gruppo-specifica del PAEs altamente è voluta a causa la rapida crescita dei congeneri. Aptameri di DNA sono state applicate sempre più come elementi di riconoscimento su piattaforme di biosensore, ma selezionando aptameri verso obiettivi altamente idrofobo piccola molecola, come PAEs, sono segnalata raramente. Questo lavoro descrive un metodo basato su tallone progettato per selezionare aptameri di DNA specifico del gruppo di PAEs. Il gruppo amminico funzionalizzati ftalato di dibutile (DBP-NH2) come la destinazione di ancoraggio è stata sintetizzata e immobilizzata le perline di agarosio epossi-attivato, consentendo la visualizzazione del gruppo estere ftalico alla superficie della matrice immobilizzazione, e pertanto la selezione dei leganti specifici del gruppo. Abbiamo determinato le costanti di dissociazione dei candidati aptamero da reazione a catena quantitativa polimerizzazione accoppiato con separazione magnetica. La relativa affinità e selettività di aptameri per altri PAEs sono stati determinati mediante le analisi competitive, dove i candidati aptamero pre-sono stati limitati al DBP-NH2 allegata biglie magnetiche e rilasciato al supernatante sopra incubazione con il PAEs testata o altri potenziali sostanze interferenti. Prova competitiva è stata applicata perché esso fornito un confronto facile affinità tra PAEs che non aveva nessun gruppi funzionali per immobilizzazione superficiale. Infine, abbiamo dimostrato la realizzazione di un aptasensor elettrochimico e usato per rilevazione ultrasensibile e selettivo di 2-etilesilftalato. Questo protocollo fornisce intuizioni per la scoperta di aptamero di altre piccole molecole idrofobiche.

Introduzione

Insieme a rapido sviluppo economico, accelerazione di industrializzazione e costruzione urbana, l'inquinamento ambientale è più grave che mai. Inquinanti ambientali tipici includono ioni di metalli pesanti, tossine, antibiotici, pesticidi, endocrini e inquinanti organici persistenti (pop). Oltre a ioni metallici e le tossine, altri inquinanti sono piccole molecole che molto spesso consistono in una varietà di congeneri. Ad esempio, il pop più tossici includono i policlorobifenili (PCB), idrocarburi policiclici aromatici (IPA), eteri di difenile polibromurati (PBDE), policloro dibenzo-p-diossine (PCDD), difenili policlorodibenzofurani (PCDF) e ftalico esteri dell'acido (PAEs)1,2, che tutti sono costituiti da numerosi congeneri. Rilevamento di piccola molecola è stata eseguita principalmente da tecniche basate sulla spettrometria di massa/cromatografia a causa della loro diversità di applicazioni3,4,5,6. Per i rilevamenti in loco, metodi basati su anticorpi sono stati recentemente sviluppati7,8,9. Tuttavia, poiché questi metodi sono altamente specifici per un certo congenere, prove multiple devono essere eseguite. Che cosa è più grave è che i romanzo congeneri crescono così in fretta che loro gli anticorpi non possono essere generati nel tempo. Pertanto, lo sviluppo di biosensori di gruppo-specifici per monitorare i livelli totali di tutti i congeneri in un test può fornire una preziosa metrica per valutare lo stato di inquinamento ambientale.

Recentemente, l'acido nucleico aptameri sono stati ampiamente applicati come elementi di riconoscimento in varie piattaforme di biosensori grazie alla loro capacità di riconoscere un'ampia varietà di obiettivi, di ioni e piccole molecole di proteine e cellule10,11 ,12. Aptameri sono identificati attraverso un metodo in vitro chiamato evoluzione sistematica di ligandi di arricchimento esponenziale (SELEX)13,14. SELEX si inizia con la libreria di oligonucleotide sintetico casuale singolo filamento, che contiene circa 1014-1015 sequenze. La dimensione della biblioteca casuale garantisce la diversità delle strutture candidato RNA o DNA. Il processo SELEX tipico è costituito da più cicli di arricchimento fino a quando la libreria viene arricchita in sequenze con alta affinità e specificità per la destinazione. La piscina arricchita finale è quindi sequenziata, e le costanti di dissociazione (Kd) e la selettività contro potenziali sostanze interferenti sono determinati da diverse tecniche quali filtrano vincolanti, cromatografia di affinità, superficie risonanza plasmonica (SPR), ecc. 15

A causa della solubilità in acqua estremamente povera e la mancanza di gruppi funzionali per immobilizzazione superficiale, la selezione di aptamero di POPs è teoricamente difficile. Progressi significativi per SELEX hanno velocizzato la scoperta di aptameri. Tuttavia, la selezione di gruppo-specifici aptameri per POPs non è stato ancora segnalata. Finora, solo il PCB-associazione DNA aptameri con alta specificità per un certo congenere sono stati individuati16. PAEs sono utilizzati principalmente in materiali di cloruro di polivinile, cloruro di polivinile il passaggio da una plastica dura a una plastica elastica, agendo quindi come un plastificante. Alcuni PAEs sono stati identificati come interferenti endocrini, può causare gravi danni alla funzionalità epatica e renale, ridurre la motilità degli spermatozoi maschili e può provocare morfologia anormale dello sperma e cancro testicolare17. Composto - né aptameri PAE-associazione gruppo-specifici sono stati segnalati.

L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un protocollo rappresentativo per la selezione di aptameri di DNA specifico del gruppo a altamente idrofobi piccole molecole quali PAEs, un gruppo rappresentativo di POPs. Inoltre dimostriamo l'applicazione dell'aptamero selezionato per il rilevamento di inquinamento ambientale. Questo protocollo fornisce indicazioni e spunti per la scoperta di aptamero di altre piccole molecole idrofobiche.

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Protocollo

1. biblioteca e disegno dell'iniettore e sintesi

  1. Progettare la Biblioteca iniziale e primer.
    Biblioteca (piscina0): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-N40-CCTTTCTGTCCTTCCGTCAC-3'
    Forward primer (FP): 5'-TCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    Fosforilato reverse primer (PO4- RP): 5'-PO4- GTGACGGAAGGACAGAAAGG-3'
  2. Sintetizzare piscina0, FP e PO4- RP utilizzando standard phosphoramidite chimica18,19,20e purificare tutti i DNAs da standard ad alte prestazioni cromatografia liquida (HPLC)21.
  3. Ricostituire Pool0, FP e PO4- RP in grado privo di nucleasi di acqua a 100 µM, aliquota e conservarli a -20 o -80 ° C fino ad un anno.
    Nota: È fortemente consigliato per memorizzare piscina0, FP e PO4- RP in aliquote di 10-20 µ l per evitare possibili contaminazioni incrociate.

2. sintetizzare la destinazione di ancoraggio e sua immobilizzazione sulla perlina di agarosio epossi-attivato

  1. Sintetizzare il gruppo amminico funzionalizzato dibutilftalato (DBP-NH2) come la destinazione di ancoraggio.
    Nota: I dettagli sperimentali sulla sintesi e caratterizzazione di DBP-NH2 sono stati descritti in letteratura22.
  2. Preparare l'ancoraggio soluzioni stock di destinazione in un mezzo appropriato per la solubilità di destinazione. Per questo studio, preparare la soluzione di riserva di 100 mM DBP-NH2 in dimetilsolfossido (DMSO) e conservare la soluzione a 4 o a-20 ° C fino ad un anno.
  3. Immobilizzare il DBP-NH2 su agarosio epossi-attivato perline secondo un protocollo modificato dal produttore.
    1. Pesare la polvere liofilizzata 0,1 g di agarosio epossi-attivato perline e sospenderlo in acqua distillata. Lavare il mezzo per 1 h utilizzando 20 mL di acqua distillata aggiunto in aliquote diverse. Lavare il mezzo con 0,2 M Na2CO3 (pH 12).
      Nota: Il mezzo si gonfia immediatamente dopo l'aggiunta di acqua in esso.
    2. Sciogliere DBP-NH2 (46,7 mg, 0,15 mmol) nel tampone per l'accoppiamento di 500 µ l (0,2 M Na2CO3 tampone).
    3. Miscelare la soluzione di accoppiamento contenenti il legante con il mezzo. Utilizzare un agitatore a 5 giri per 48 h a temperatura ambiente.
    4. Ripetere il lavaggio del prodotto tre volte, in sequenza utilizzando 0.1 M tampone acetato (0.5 M NaCl, pH 4,5) e 0,2 M carbonato buffer (0.5 M NaCl, pH 12) in ogni ciclo di lavaggio. Lavare e sospendere il prodotto in acqua per rendere il volume finale di 500 µ l.
    5. Conservare il prodotto a 4 ° C prima dell'uso.
    6. Confermano il successo dell'immobilizzazione di destinazione mediante analisi elementare.

3. SELEX

  1. Preparare 500 mL di buffer di associazione PAE in acqua ultra-pura o acqua di grado nucleasi-free con 20 mM Tris· HCl, NaCl 100 mM, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1% polyoxyethy-lene monolaurato di sorbaitan (20) e agente di 0,03% non ionici superficie attiva (pH 7,9). Il buffer di filtrare attraverso un filtro di nitrocellulosa da 0,22 µm sterile e conservare a temperatura supera a 20 ° C per mesi.
    Nota: È fondamentale per mantenere uno stato di buona dispersione del PAEs nel buffer di associazione di PAE. Più tipi di tensioattivi sono necessari per aumentare la solubilità del PAEs in soluzione acquosa. Tuttavia, il numero dei tensioattivi dovrebbe essere tenuto al minimo per evitare la formazione di micelle di tensioattivo che sarebbe incapsulano molecole PAE. Non-ionico, superficie agente attivo è facile a precipitare a temperature inferiori a 20 ° C, e di conseguenza il buffer deve essere conservato a una temperatura superiore ai 20 ° C.
  2. Diluire 10 µ l di 100 µM piscina0(~1.0 nmol per 10 sequenze di15 14-10) a 490 µ l di tampone di associazione di PAE. Le aliquote di0 piscina (5 × 100 µ l) di calore nei tubi a parete sottile centrifuga nel set da bagno di acqua a 95 ° C per 10 min posto le provette in ghiaccio per 5 minuti e successivamente Incubare le provette per 5 min a temperatura ambiente (~ 25 ° C in questo lavoro).
  3. Al primo turno di selezione: incubazione della piscina0 e DBP−NH2−coated media.
    1. Lavare 200 µ l di DBP−NH2−coated terreno tre volte con 500 µ l di tampone di associazione di PAE. Mix DBP−NH2−coated medium con piscina0 e incubare la miscela a temperatura ambiente per 1 h sotto agitazione lieve.
    2. Separato il mezzo di −coated2DBP−NH legato con aptameri dal DNAs non associato dal tubo di ultrafiltrazione ultrafiltrazione usingan con un cut-off molecolare di 100 kDa. Lavare il mezzo tre volte con 500 µ l di buffer di associazione PAE e centrifugare a 9.168 × g per 10 min a 4 ° C.
  4. Al primo turno di selezione: aptamero eluizione da DBP−NH2−coated media.
    1. Aggiungere 50 µ l di tampone di associazione di PAE nel medio lavato e riscaldare la miscela a 90 ° C per 9 minuti sotto agitazione.
    2. Raccogliere il surnatante contenente il DNAs eluiti mediante ultrafiltrazione. Ripetere questo processo di eluizione tre volte per recuperare più associato DNAs.
  5. Al primo turno di selezione: PCR
    1. Piccola scala PCR
      1. Eseguire una piccola scala PCR23 (4 aliquote di × 20 µ l) usando ~ 15-30 cicli. Impostare una reazione di PCR24 come segue: 6,5 µ l di acqua RNAsi-libera, 1 µ l di primer 10 µM ciascuna (FP, PO4- RP, 0.01 nmol ogni), 1,5 µ l eluiti piscina dalla sezione 3.4 (o acqua RNAsi-libera come controllo negativo), e 10 µ l di premiscelato reazione miscela contenente dNTPs, caldo inizio della polimerasi e tampone di reazione di 2 × PCR (20 mM tris· HCl, 100 mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3).
      2. Eseguire PCR utilizzando un termociclatore con le seguenti impostazioni: 1 ciclo di 95 ° C, 1 min; 30 cicli di [95 ° C, 30 s; 56 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 ciclo di 72 ° C, min 2 e tenere premuto a 4 ° C. Quando lo strumento è in esecuzione che la 20th s i passaggi di estensione in 15, 20, 25 e 30 cicli, premere il tasto pause, aprire il coperchio dello strumento e prendere un tubo fuori, quindi premere il tasto di pausa per riprendere la PCR.
      3. Preparare 12% denaturato del gel di poliacrilammide elettroforesi (pagina)25,26. Mescolare 4,8 g di urea, 6 mL di acqua ultra-pura, 1 mL di acido borico/tris di 10 × / acido etilendiamminotetraacetico (TBE), 3 mL di 40% di acrilammide, 10 µ l di tetrametiletilendiammina (TEMED) e 100 µ l 10% ammonio persolfato (APS), in quell'ordine. Mescolare bene e aspettare per 1,5-2 h garantire che il gel si solidifica completamente.
      4. Analizzare i risultati dell'ottimizzazione del ciclo: 1 µ l di ciascun prodotto PCR si combinano con 5 µ l di tampone di caricamento del RNA (62,5% formammide, formaldeide 0,4 M, 1.25×3-(N-morpholino) propansulfonic tampone acido, 0,02% xilene cianolo FF, blu di bromofenolo 0.02%) e 4 µ l di Acqua RNAsi-libera; riscaldare la miscela a 95 ° C per 10 min e raffreddare rapidamente a 0 ° C sul ghiaccio; Incubare per 5 min a temperatura ambiente; carico in 5 pozzetti separati del 12% denaturato pagina; eseguire l'elettroforesi da un sistema di elettroforesi verticale in tampone TBE 1x a 170 V per 45 min.
      5. Dopo l'elettroforesi, macchia il gel con 3 µ l di 1 × gel di acido nucleico macchia in 30 mL di buffer TBE × 1 per 10 min e prendere un'immagine del gel.
    2. Grande scala PCR: selezionare il numero di cicli per produrre la più alta banda di intensità al marcatore di dimensioni corrette senza sottoprodotti indesiderati. Eseguire una PCR (aliquote di 20 × 100 µ l) che utilizzano le condizioni e il numero appropriato di cicli determinato nella sezione 3.5.1 su larga scala.
      Nota: L'importo finale della biblioteca di filamento singolo che può essere ottenuta è proporzionale al volume totale della PCR, non la concentrazione di modello. In genere, per ottenere 1 nmol di biblioteca, la piscina di singolo filamento ha bisogno di 2 mL PCR. PCR è molto sensibile e facilmente contaminati da esterno "DNAS". Dovrebbe intraprendere per ridurre la probabilità di contaminazione, quali i guanti, usando puntali sterilizzati, non sputare nei tubi e non aprire il tappo della provetta PCR prima della centrifugazione.
  6. Al primo turno di selezione: purificazione del prodotto PCR di precipitazione dell'etanolo.
    1. Combinare due tubi della miscela PCR in un tubo (da 200 µ l). Ripetere questa operazione per tutte le provette.
    2. Aggiungere 15 µ l di soluzione di sodio acetato (3M, pH 5.2), 4 µ l di soluzione di DNA/RNA precipitazioni vettore e 2,5 volte il volume di etanolo pre-raffreddata a-20 ° C in ogni provetta. Mescolare in modo uniforme.
      Nota: Elemento portante di precipitazione del DNA/RNA è ampiamente usato negli esperimenti di precipitazione dell'etanolo per migliorare significativamente la percentuale di recupero di DNA/RNA alle concentrazioni basse. Non interferisce con le applicazioni a valle come PCR e sequenziamento.
    3. Centrifugare la miscela a 20.627 × g per 20 min a 4 ° C e attentamente scartare il sopranatante e lasciare precipitato bianco.
    4. Aggiungere 400 µ l di pre-raffreddamento soluzione di etanolo a-20 ° C in ogni provetta per lavare la precipitazione il 70%. Centrifugare la miscela a 20.627 × g per 5 min a 4 ° C e attentamente scartare il sopranatante e lasciare precipitato bianco. Ripetere la fase di lavaggio due volte.
    5. Aprire il coperchio del tubo; pungere la membrana sigillante; Lasciate che etanolo volatilizzarsi a 40 ° C sul blocco di riscaldamento fino a quando il precipitato bianco diventa trasparente. Memorizzare il precipitato a-20 ° C.
      Nota: Il prodotto PCR purificato può essere conservato a-20 ° C.
  7. Al primo turno di selezione: generazione di DNA single-stranded (generazione di piscina arricchita1) eseguendo la reazione di esonucleasi λ per digerire lo strand inverso fosforilato.
    1. Reazione di esonucleasi λ su piccola scala
      1. Aggiungere 100 µ l di acqua RNAsi-libera in una provetta contenente il prodotto PCR purificato dalla sezione 3.6. Vortice del tubo per sciogliere completamente il precipitato nel tubo.
      2. Preparare cinque provette da centrifuga e aggiungere 5 µ l di soluzione di cui sopra, 11 µ l della RNAsi - acqua gratuita e 2 µ l di tampone di reazione 10 × (670 mM glicina-KOH, 25 mM MgCl2 , 0,1% (v/v) pH Triton X-100 9,4) in ogni provetta.
      3. Aggiungere 2 µ l di acqua o soluzione di esonucleasi λ diluito contenente 2 U, 5 U, U 8 e 10 esonucleasi λ di U in questi tubi, rispettivamente. Miscelare la soluzione ben pipettando delicatamente. Il tampone di reazione × 10 viene fornito insieme a λ exonucleasefrom il provider.
      4. Incubare le provette per 35 min a 37 ° C, per 15 min a 80 ° C e tenere a 4 ° C.
      5. Preparare il nativo di 12% pagina. Mescolare 6 mL di acqua ultra-pura, 1 mL di 10 × TBE, 3 mL di 40% di acrilammide, 10 µ l di TEMED e 100 µ l di 10% APS, in quell'ordine. Mescolare bene e attendere per 60-90 min affinché che il gel si solidifica completamente.
      6. Analizzare i risultati delle reazioni combinando 5 µ l di ogni reazione con 1 µ l di colorante e 4 µ l di acqua RNAsi-libera di caricamento e caricamento queste miscele in 5 pozzetti separati di 12% nativi pagina (150 V per 45 min).
        Nota: Una scaletta di DNA double-stranded bp 20 può essere caricato anche sul gel, ma potrebbe non essere necessario poiché le bande distinte del prodotto di PCR e la libreria incagliata singola generata mostrano sul gel.
        Nota: La reazione di esonucleasi λ ha un'eccellente selettività strutturale. Il prodotto PCR di double-stranded (il filamento anti-senso è etichettato con un gruppo fosfato all'estremità 5') può essere completamente digerito in una libreria di single-stranded in presenza di esonucleasi λ in una gamma piuttosto ampia concentrazione (Figura 4). La quantità minima di esonucleasi λ che completamente possono generare DNA single-stranded nella reazione di esonucleasi λ su piccola scala è utilizzata anche per la reazione di esonucleasi λ su larga scala. Una maggiore concentrazione di esonucleasi λ può anche essere utilizzata, poiché esonucleasi λ funziona bene in una gamma vasta concentrazione senza perdere la sua resa di selettività e prodotto di struttura. La reazione di esonucleasi λ è inibita da un'alta concentrazione di sale. La digestione incompleta del prodotto della PCR di solito implica che troppo sale esiste nel prodotto di PCR. La purificazione dei prodotti PCR di precipitazione dell'etanolo (sezione 3.6) è generalmente compatibile con questo passaggio, mentre il prodotto PCR purificato dalla precipitazione di isopropanolo molto spesso contiene troppo sale.
    2. Reazione di esonucleasi λ su larga scala: Scegli la quantità minima di esonucleasi λ che possono generare completamente single-stranded DNA per la reazione di esonucleasi λ su larga scala. La reazione viene scalata proporzionalmente secondo questa condizione. Ad esempio: se 2 U è la quantità minima di esonucleasi λ richiesto, miscelare 38 µ l di acqua RNAsi-libera, 10 µ l di tampone 10x, 50 µ l di DNA piscina1 e 2 µ l di 10 esonucleasi λ di U / µ l.
  8. Al primo turno di selezione: purificazione del singolo filamento piscina1 di precipitazione dell'etanolo.
    1. Seguire le istruzioni del punto 3.6.
    2. Determinare la concentrazione di purificato Pool1 di assorbimento UV a 260 nm.
    3. Ricostituire il 90% purificato Pool1 in un adeguato volume di tampone di associazione di PAE. Se non c'è abbastanza DNA ottenuto per la prossima tornata di selezione, ripetere le sezioni 3.5-3.8.2.
      Nota: Il volume di tampone di associazione PAE solitamente varia da 200 a 500 µ l in base alla quantità della biblioteca e la concentrazione finale desiderata della biblioteca nel prossimo turno di SELEX.
  9. Il secondo, terzo, quarto e quinto round di SELEX.
    1. Condurre il secondo, terzo, quarto e quinto round di SELEX successivamente seguendo lo stesso procedimento descritto sopra (sezione 3.2-3,8), tranne per il fatto che la libreria di ~ 300 pmol era input per aumentare il rigore di selezione.
    2. Per ridurre al minimo l'assorbimento non specifico di DNAs sul mezzo, incubare la piscina con il mezzo non modificato su un agitatore rotante per 30 min nel terzo e quarto turno della selezione prima dell'incubazione con il mezzo di −coated DBP−NH2.
      Nota: Il processo SELEX si è conclusa al quinto round a causa della grave crosslink tra DNAs ha rivelato dalla grande quantità di prodotto ad alto peso molecolare che non migrazione in gel.

4. high-Throughput sequenziamento

  1. Preparare la piscina4 dal punto 3.9.2 per la sequenziazione dall'amplificazione di PCR con primer compatibile.
    1. Progettare e sintetizzare un primer forward indicizzato con 6 nt all'estremità 5 ' per facilitare l'analisi di sequenza.
      Indicizzati forward primer (FP-sequenziamento): 5'-agtacgaTCCCACGCATTCTCCACATC-3'
    2. Impostare una reazione di 1.000 µLPCR come segue: 380 µ l di acqua RNAsi-libera, 50 µ l di ciascun primer 10 µM (FP-sequenziamento, PO4- RP, 0,5 nmol ogni), Premiscelato di 20 µ l di piscina eluita dal punto 3.9.2 e 500 µ l di miscela di reazione contenente dNTPs, avviamento a caldo della polimerasi e tampone di reazione PCR × 2. Aliquotare il composto in 10 provette per PCR. Utilizzare le stesse condizioni PCR come descritto nel punto 3.5.1.2.
  2. Purificare il prodotto di PCR per soddisfare i requisiti dell'impianto di sequenziamento. Ad esempio, utilizzare il kit di recupero pagina-gel DNA secondo le istruzioni del produttore.
  3. Inviare il prodotto PCR purificato (~ 2 µ g) ad un impianto di sequenziamento in condizioni di spedizione richiesto dalla struttura di sequenziamento. Ad esempio, spedire il prodotto PCR in una provetta da centrifuga con tappi completamente sigillati con impacchi di ghiaccio al centro di sequenziamento.
    Nota: Ha ricevuto i risultati ordinati per le sequenze in base al numero di copia di ogni sequenza di valutare l'arricchimento della piscina sequenziata. La sequenza superiore è stata denominata DBP-1 (5'-CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT-3'). Il seguente protocollo (sezione 5 e 6) sono stati misurati l'affinità e selettività. Sua applicazione in un biosensori elettrochimici successivamente è stata dimostrata nella sezione 7.

5. Kd determinazione di selezionato aptamero candidati utilizzando Magnetic Bead-Based PCR quantitativa (qPCR)

  1. Sintetizzare DBP-1-qPCR e primer utilizzando standard phosphoramidite chimica e purificarla da HPLC standard.
    Aptamero candidato (DBP-1-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATTCTTTCTGTCCTTCCGTCACATC CCACGCATTCTCCACATAGATAGTAAGTGCAATCT-3'
    Forward primer per qPCR (FP-qPCR): 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'
    Reverse primer per qPCR (RP-qPCR): 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3'
    Nota: Le regioni di primer della sequenza testata sono diverse da quelli della piscina0 utilizzati nella sezione 3. Lo scopo di cambiare le regioni di primer è di testare l'affinità della sequenza core sola, escluse le regioni di primer.
  2. Immobilizzare il DBP-NH2 su biglie magnetiche rivestite con acido carbossilico seguendo le istruzioni del produttore.
    1. Lavare le biglie magnetiche rivestite con acido carbossilico due volte con 25 mM 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (MES) (pH 5.0), utilizzando un volume uguale di biglie magnetiche (100 µ l) dispensato dal flaconcino, per 10 min con buona miscelazione (estremità sopra o simili).
    2. Immediatamente prima dell'uso, preparare 50 mg/mL di soluzione di cloridrato (EDC) carbodiimide 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) con freddo 25 mM MES (pH 5.0).
    3. Immediatamente prima dell'uso, preparare 50 mg/mL di soluzione di N-Idrossisuccinimide (NHS) con freddo 25 mM MES (pH 5.0).
    4. Mescolare 100 µ l di soluzione EDC e 100 µ l di soluzione di NHS con le perline lavate e incubare per 30 min a temperatura ambiente con rotazione lenta inclinazione.
    5. Mettere il tubo su un magnete per 4 min dopo l'incubazione, scartare il surnatante e lavare le perle due volte con 100 µ l di freddo 25 mM MES (pH 5.0).
    6. Incubare 6 µ l di soluzione di riserva di 100 mM DBP-NH2 e 25 mM MES (pH 5.0, 290 µ l) con le perline attivate in rotazione per almeno 30 min a temperatura ambiente o 2 ore a 4 ° C, con rotazione lenta inclinazione a 5 giri/min.
    7. Inserire il tubo sul magnete per 4 min dopo incubazione e scartare il surnatante. Lavare le perle rivestite 4 volte e risospendere perline con 200 µ l di tampone di associazione PAE e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
  3. Raccogliere la curva di titolazione per determinare Kd.
    1. Preparare una serie di soluzioni di DBP-1 (500 µ l) alle varie concentrazioni nel buffer di associazione PAE da 13 a 300 nM.
    2. Aggiungere 10 µ l di DBP-NH2-rivestito biglie magnetiche come descritto nella sezione 5.2.7 per ogni soluzione di DBP-1. Incubare per 1 h a temperatura ambiente sotto rotazione.
    3. Posizionare i tubi su un magnete per 4 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare le perle 4 volte utilizzando 200 µ l di tampone di associazione di PAE.
    4. Aggiungere 60 µ l di tampone di associazione di PAE in ogni provetta. Incubare le provette a 95 ° C per 15 min. raccogliere il supernatante contenente il DBP-1 eluiti di separazione magnetica. Ripetere questa procedura di eluizione per recuperare più associato DBP-1.
    5. Diluire la soluzione di elute 100 volte e prendere 3 µ l per qPCR in tempo reale. Impostare una reazione qPCR come segue: 3 µ l di acqua RNAsi-libera, 2 µ l di primer 10 µM ciascuna (FP, PO4- RP, 0.01 nmol ogni), 3 µ l di eluiti e diluito DBP-1 e premiscelata 10 µ l di miscela di reazione contenente dNTPs, polimerasi e tampone di reazione di x PCR 2.
    6. Determinare i numeri di DBP-1 in ciascun campione eseguendo qPCR utilizzando un termociclatore con le seguenti impostazioni: 1 ciclo di 95 ° C, 30 s; 30 cicli di [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 ciclo di 72 ° C, 30 s e mantenere a 4 ° C.
    7. Tracciare la curva di titolazione e determinare Kd di montaggio non lineare della curva assumendo un rapporto di 1:1 associazione27.

6. relativa affinità e specificità Test di analisi Competitive

  1. Aggiungere 10 µ l di DBP-NH2-rivestito biglie magnetiche a DBP-1 soluzione (500 µ l, 1 µM). Incubare per 1 h a temperatura ambiente sotto rotazione. Posizionare i tubi su un magnete per 4 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare le perle 4 volte utilizzando 200 µ l di tampone di associazione di PAE e risospendere esso in 10 µ l di tampone di associazione di PAE.
  2. Aggiungere 10 µ l di DBP-NH2-testato con associazione medio rivestito con DBP-1 a 110 µ l di ogni 10 µM campione (DBP-NH2, DBP, DEHP, Butil benzil phthalate(BBP), ioni di metalli pesanti, ecc.) Incubare a temperatura ambiente per 1 h. raccogliere il surnatante di separazione magnetica.
  3. Diluire il surnatante 100 volte e prendere 3 µ l per qPCR quantificazione. Impostare una reazione qPCR come segue: 3 µ l di acqua RNAsi-libera, 2 µ l di primer 10 µM ciascuna (FP, PO4- RP, 0.01 nmol ogni), 3 µ l di eluiti e diluito DBP-1 e premiscelata 10 µ l di miscela di reazione contenente dNTPs, polimerasi e tampone di reazione di x PCR 2.
  4. Determinare i numeri di DBP-1 in ciascun campione eseguendo qPCR utilizzando un termociclatore con le seguenti impostazioni: 1 ciclo di 95 ° C, 30 s; 30 cicli di [95 ° C, 30 s; 45 ° C, 30 s; 72 ° C, 30 s]; 1 ciclo di 72 ° C, 30 s e mantenere a 4 ° C.
  5. L'affinità relativa viene calcolato dividendo il numero di DBP-1 rilasciato da perline in presenza del campione per il numero di DBP-1 rilasciato dalle perle nel buffer di associazione PAE: relativa affinità = Ncampione/nbuffer.

7. fabbricazione e misure elettrochimiche di biosensori elettrochimici di DEHP

  1. Sintetizzare la sequenza di core chitosani (HS-DBP-1) e la sonda segnalazione (DBP-1-C-Fc) utilizzando standard phosphoramidite chimica e purificarla da HPLC standard.
    HS-DBP-1: 5' - HS-(CH2)6- CTTTCTGTCCTTCCGTCACATCCCACGCATTCTCCACAT -3 '
    DBP-1-C-Fc: 5 '- GATGTGACGGAAGGTTTTTTTT-(CH2)6Fc -3'
    Nota: Il design razionale delle sonde sensore fu descritto nel nostro precedente pbulications18,22.
  2. Ricostituire il HS-DBP-1 e DBP-1-C-Fc in acqua privo di nucleasi di grado a 100 µM, aliquota e conservarli a -20 o -80 ° C fino ad un anno.
  3. Polacco l'elettrodo d'oro con attenzione per una superficie a specchio con 1, 0,3 e 0,05 µm Al2O3 in polvere su un microcloth per 5 min e Sonicare esso in acqua ultrapura per 5 min rimuovere residui Al2O3. Quindi pulire l'elettrodo di lucidatura elettrochimica con 35 scansioni successive voltammetria ciclica (CV) da 0,4 a 1,2 V (vs Hg-Hg2SO4) in 0,5 M H2SO4 a 100 mV/s.
  4. Preparare una miscela di 0,5 µM HS-DBP-1 e 0,5 µM DBP-1-C-Fc in 100 µ l 10 mM di tampone fosfato contenente NaCl di 1m, pH 7,4 (PBS). Riscaldare la miscela nel tubo a parete sottile centrifuga il set da bagno di acqua a 95 ° C per 10 min e lentamente raffreddare la miscela a temperatura ambiente.
  5. Aggiungere 1 µ l di tris cloridrato di-(2-carboxyethyl)-fosfina (TCEP, 10 mM, soluzione di riserva) nell'impasto. Conservare a temperatura ambiente per 1 h.
  6. Immergere l'elettrodo pulito oro nella soluzione di cui sopra per 12 h, o durante la notte a temperatura ambiente.
  7. Sciacquare l'elettrodo con PBS e immergere l'elettrodo in 1 mM [S (CH2)2(OCH2CH2)6OCH3]2 (HS-EG6- OMe) in PBS per 1 h. Sciacquare l'elettrodo accuratamente con PAE buffer di associazione e immergere l'elettrodo nel buffer di associazione di PAE.
  8. Prendere un'analisi in background onda quadra voltammetria (SWV) nel buffer di associazione PAE privo di destinazione.
    1. Pulire tutte le attrezzature sperimentali: celle elettrolitiche, oro elettrodo di lavoro, controelettrodo di platino ed elettrodo di riferimento al calomelano saturo (SCE).
    2. Attivare il software installato; impostare i parametri sperimentali per misurazioni SWV.
      Nota: I seguenti parametri sperimentali sono stati utilizzati per gli esperimenti SWV: potenziale gamma: da -0,2 a 0,7 V; ampiezza di modulazione: 25 mV; larghezza di impulso: 5 ms; velocità di scansione: 50 mV/s; passo potenziale: 1 mV.
    3. Collegare l'oro lavorando elettrodo, controelettrodo di platino e SCE per un potenziostato e mettere questi tre elettrodi in una cella elettrolitica contenente tampone associazione PAE.
    4. Eseguire la misurazione SWV.
      Nota: Una volta avviata la misurazione SWV, una curva SWV sarà visualizzato sullo schermo del computer. La scansione viene ripetuta fino a quando le scansioni sono costante e ulteriori modifiche in forma o altezza del picco non sono osservati.
  9. Immergere l'elettrodo di lavoro nel buffer di associazione PAE che contiene una certa concentrazione di DEHP (ad es., 22) per 30 min a temperatura ambiente. Sciacquare l'elettrodo accuratamente utilizzando PAE associazione buffer e immergere l'elettrodo nel buffer di associazione PAE con il controelettrodo e SCE. Raccogliere la curva SWV sotto la stessa condizione come descritto nella sezione 7.8.
  10. Ripetere il passaggio 7.9, tranne che la concentrazione di DEHP (ad es. 100 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 µM) è stata aumentata in modo sequenziale. Tracciare la curva di titolazione.
  11. Test di specificità: Ripetere i passaggi da 7,3-7.9, tranne che il buffer di bind PAE contenente DEHP è sostituito dal buffer di associazione dei PAE contenenti la sostanza interferente potenziale alla concentrazione desiderata.

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Risultati

Abbiamo progettato e sintetizzato il gruppo amminico funzionalizzato dibutilftalato (DBP-NH2) come la destinazione di ancoraggio (Figura 1F). Abbiamo quindi effettuato la selezione aptamero del DNA di PAEs utilizzando DBP-NH2 come destinazione ancoraggio e seguendo il metodo di immobilizzazione-base classica destinazione (Figura 2). In ogni round, un pilota PCR è stata effettuata utilizzando la pagina denat...

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Discussione

Uno dei vantaggi eccezionale di aptameri è che vengono identificati tramite il metodo in vitro SELEX, mentre gli anticorpi sono generati tramite immunoreactions in vivo . Pertanto, è possono selezionare aptameri con specificità di destinazione desiderata in condizioni sperimentali ben progettate, considerando che gli anticorpi sono limitati a condizioni fisiologiche.

Per facilitare la separazione delle sequenze associati da sequenze gratuiti, diversi SELEX modificate recen...

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Divulgazioni

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrenti.

Riconoscimenti

Siamo grati per il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation (21675112), progetto di chiave del piano di scienza e tecnologia di Pechino Education Commission (KZ201710028027) e programma di Yanjing giovane studioso di Capital Normal University.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
UV-2550Shimadzu,Japanprotocol, section 3.8.2
DNA Engnine Thermal cycler,PTC0200BIO-RADsection 3.5.1.2 and 3.5.2
C1000 TouchBIO-RADsection 5.3.6 and 6.3
VMP3 multichannel potentiostatBio-Logic Science, Claix, Francesection 7.4,7.8 and 7.11
Epoxy-activated Sepharose 6BGE Healthcare (Piscataway, NJ, USA)10220020argarose beads, section 2.3 and 3.3
Dynabeads M-270 carboxylic acid magnetic beadsInvitrogen, USA420420magnetic beads,section 5.2. and 5.3
Premix Taq Hot Start VersionTakara,Dalian,ChinaR028Apolymerase, section 3.5.1.1
PARAFILM Sealing MembraneBemis, USAPM-996section 3.6.5
Lambda ExonucleaseInvitrogen, USAEN0561section3.7.1.2.The 10 × reaction buffer is provided along with λ exonuclease by the provider.
Dr. GenTLE
Precipitation Carrier		Takara,Dalian,China9094section 3.6.2 and 3.8.1
UNIQ-10 PAGE DNA recovery kitSangon Biotech (Shanghai)B511135section 4.2
SYBR Gold nucleic acid gel stainInvitrogen, USA1811838nucelic acid stain dye, section 3.5.1.5
SYBR Premix Ex Taq IITakara,Dalian,ChinaRR820Apolymerase mix contaning polymerase and dNTPs, section 5.3.5
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES)Sigma-AldrichCAS: 1132-61-2section 5.2.1
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC)Invitrogen, USACAS: 25952-53-8section 5.2.2
N-hydroxysuccinimide (NHS)Sigma-Aldrich6066-82-6section 5.2.3
mercaptohexanol (MCH)Sigma-AldrichCAS: 1633-78-9section 7.7
Gold electrodeShanghai ChenhuaCHI101section 7.4. - 7.11
tris(2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-AldrichCAS: 51805-45-9section 7.5
O-(2-Mercaptoethyl)-O'-methyl-hexa-(ethylene glycol)Sigma-AldrichCAS: 651042-82-9section 7.7
diethylhexyl phthalate (DEHP)National Institute of Metrology, ChinaCAS: 117-81-7section 7.11
Tween 20Sigma-AldrichCAS: 9005-64-5polyoxyethy-lene(20) sorbaitan monolaurate
Triton X-100Sigma-AldrichCAS: 9002-93-1non-ionic surface active agent
PBSSigma-AldrichP536810 mM phosphate buffer containing 1 M NaCl, pH 7.4

Riferimenti

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