Evaluación del esperma de pescado utilizando Software y equipos de refrigeración

Resumen

El presente Protocolo describe un procedimiento de evaluación del esperma de pescado utilizando el análisis de los espermatozoides asistido por ordenador y equipos de refrigeración. El software ofrece una rápida, precisa y análisis cuantitativo de la calidad del esperma de pescado basada en motilidad de espermatozoides, que puede ser una herramienta útil en la acuicultura para mejorar el éxito de la reproducción.

Resumen

Para la evaluación de la calidad de gametos, hay técnicas innovadoras, rápidas y cuantitativas que pueden proporcionar datos útiles para la acuicultura. Sistemas computarizados para el análisis de la esperma se desarrollaron para medir varios parámetros y uno de los más comúnmente medido es la movilidad de los espermatozoides.

Inicialmente, esta tecnología fue diseñada para especies de mamíferos, aunque también puede ser utilizado para el análisis de esperma de peces. Peces tienen características específicas que pueden afectar el esperma evaluación como un momento de poca motilidad después de la activación y, en algunos casos, adaptación a temperaturas más. Por lo tanto, es necesario modificar los componentes tanto de software como de hardware para hacer análisis de motilidad más eficientes para el análisis de esperma de peces. Mamíferos de los espermatozoides, la placa de calefacción se utiliza para mantener temperaturas óptimas de los espermatozoides. Sin embargo, para algunas especies de peces, es ventajoso utilizar una temperatura más baja para prolongar la duración de la movilidad, ya que los espermatozoides permanecen activos por menos de 2 min. Por lo tanto, dispositivos de enfriamiento están necesarios refrigerar las muestras a temperatura constante durante el tiempo de análisis, incluyendo en el microscopio óptico. Este protocolo describe el análisis de la motilidad del esperma de pescado utilizando el software para el análisis de la esperma y refrigeración nuevos dispositivos para optimizar los resultados.

Introducción

La eficacia de la reproducción depende de la calidad de ambos gametos (óvulos y espermatozoides)^1,2. Este es el principal factor que contribuye a la fertilización exitosa, permitiendo el desarrollo de crías viables^3,4. La conveniente evaluación de la calidad de gametos es la mejor herramienta para definir el potencial de fertilidad de una muestra.

Mezclando la esperma de varios machos es una práctica común en la producción de muchas especies comerciales⁴. Sin embargo, la variabilidad de esperma entre los hombres puede conducir a la competencia de esperma y, en consecuencia, no todos los varones están contribuyendo igualmente a la piscina de gene⁵. En este sentido, la correcta evaluación de características de eyaculado/espermatozoides individuales, tales como movilidad, es fundamental obtener información discriminatoria con respecto a la fertilidad masculina individual posibles. Observación directa de la motilidad espermática puede producir datos imprecisos y subjetivos ya que requiere tiempo y experiencia, que conduce a una falta de coherencia e incompatibilidad de resultados^6,7. Sin embargo, hay muchas técnicas innovadoras, rápidas y cuantitativas que pueden proporcionar una calidad de esperma confiable análisis^2,4.

Análisis de los espermatozoides asistido por ordenador fue desarrollado para ofrecer datos precisos sobre esperma calidad⁸. Esta tecnología incluye el desarrollo de software asociado con un microscopio de contraste de fase que permite la evaluación de la motilidad espermática. Sin embargo, un factor limitante del parámetro de movilidad es la velocidad de fotogramas de la cámara. Los espermatozoides trayectorias se basan en espermatozoides cabeza posición centroide en fotogramas consecutivos de grabaciones de vídeo, que se correlaciona con el movimiento flagelar patrones^{3,9,10, 11}. los principales parámetros cinéticos medidos son la velocidad de línea recta (VSL), velocidad curvilínea (VCL) y velocidad promedio ruta (VAP). VSL es la distancia entre el inicio y el punto final de los espermatozoides divididos por tiempo. VCL es la velocidad real a lo largo de la trayectoria exacta tomada por los espermatozoides. VAP es la velocidad a lo largo de una trayectoria suavizada derivada de trayectoria. Estos parámetros permiten obtener información cinética adicional, incluyendo linealidad (LIN), rectitud (STR), bamboleo (WOB) y mediciones de golpeo como amplitud del movimiento lateral de la cabeza (ALH) y frecuencia de ritmo-Cruz (BCF)^4,10.

El sistema de análisis de esperma se utilizó originalmente para especies de mamíferos, y uno de los requisitos para el sistema debe funcionar a la temperatura del cuerpo del donante (unos 37 ° C). Este software también podría ser utilizado para especies de peces; Aunque, es necesario hacer algunas adaptaciones para reducir el error de los resultados de análisis de esperma. En algunas especies de peces como los salmónidos y anguila^8,12, la fertilización se produce a baja temperatura (alrededor de 4 ° C)^2,4. Así, equipos de refrigeración deben ser desarrollado para evitar las condiciones de trabajo incómodas. Además, fish de espermatozoides son fijos en el líquido seminal y requieren un choque osmótico para activar la motilidad. Para especies de agua dulce, el medio activador debe tener osmolalidad hipotónica, mientras que para especies marinas, el medio debe ser hipertónico. Sin embargo, para algunas especies, como los salmónidos, la concentración del ion también podría ser importante^3,4,9. Después de la activación, esperma de pez se caracteriza por una rápida disminución de motilidad (menos de 2 min)^13,14 y alta velocidad, siendo vital para determinar la velocidad de fotogramas óptima para obtener datos confiables¹⁵.

Los objetivos de este estudio están diseñar y aplicar sistemas de refrigeración para las muestras de esperma de peces. Además, este protocolo define cómo determinar las tarifas de marco óptimo para el establecimiento de los protocolos dependiendo de la especie. El uso de este protocolo abre nuevas puertas en el contexto de la evaluación seminal de peces, utilizando la anguila europea como modelo.

Protocolo

Procedimientos relacionados con temas de animales han sido aprobados (2015/VSC/guisante/00064) por la Dirección General de producción agrícola y ganadera en la Universitat Politècnica de València.

1. recoger esperma de anguilas europeas maduras en cautiverio

Nota: Uso anguila europea los machos mantenidos en tanques con agua de mar y un sistema de recirculación a temperatura constante (20 ° C). Tratar con hormonas por inyección intraperitoneal semanal (gonadotropina coriónica humana (hCG); 1,5 UI / g de peso de pescado). Aclimatarse gradualmente a partir de 3 días en agua dulce peces seguido del reemplazo con agua de mar (1/3 del agua total en el tanque) cada 2 días hasta llegar a una salinidad de 37,0 g/mL.

1. Anestesiar la anguila 24 h después de la inyección de hormonas para obtener muestras de mejor calidad de esperma.
   1. Preparar previamente la anestesia: Añadir 300 mg de benzocaína a 100 mL de etanol al 70%. Mezclar bien y guardar a 4 ° C.
   2. Diluir la benzocaína en una cubeta flexible con 5 L de agua del sistema para obtener una concentración final de 60 mg/L y mezclar correctamente.
   3. Transferencia de los peces al cubo con agua del sistema y benzocaína. Espere unos minutos hasta que el pescado calma abajo.
2. Limpiar el área genital con agua y secar con papel absorbente para evitar la contaminación de las muestras de esperma por las heces, orina o agua de mar.
3. Aplique presión suave en la zona abdominal y recoger las muestras de esperma en tubos de plástico de 15 mL con la bomba de vacío. Volumen de esperma hasta 6-7 mL, dependiendo el hombre.
4. Mantener muestras de esperma a 4 ° C durante al menos 1 h hasta que se realizan el análisis de la motilidad.

2. refrigerar y diluir las muestras de esperma

1. Preparar previamente la solución diluyente.
   Nota: Las muestras de esperma deben ser diluidas en la solución diluyente específica para cada especie.
   1. Prepare el soporte no activador para las muestras de esperma de anguila (medio de P1). Añadir 0,42 g de bicarbonato de sodio, 1,828 g de cloruro de sodio, 0,127 g de cloruro de magnesio, 0,56 g de cloruro de potasio y 0,037 g de cloruro de calcio a 250 mL de agua destilada. Mezclar bien para disolver. Almacenar a 4 ° C.
2. Establecer el bloque refrigerador a 4 ° C para mantener las muestras a una temperatura constante. Espere hasta que la temperatura se estabilice.
3. Diluir las muestras de semen con el diluyente específico de la solución para cada especie.
   Nota: La relación de dilución es especie específica y debe ser definida para estandarizar el protocolo. En primer lugar, estimar la concentración espermática basada en la concentración obtenida en el análisis previo de la motilidad, utilizando el software, como se explica en los pasos 3 y 4. Con este análisis, también es posible seleccionar las mejores muestras de esperma, basadas en el porcentaje de motilidad. Después de esto, el investigador puede comenzar a recopilar datos para el experimento con las mejores muestras de la concentración correcta.
   1. Diluir las muestras de esperma de la anguila en el medio de P1 con una proporción de 1:50. Para preparar 500 μl de semen diluido de Anguila, añada 50 μl de la muestra de semen fresco y 450 μl de P1. Mezclar bien.

3. evaluar los parámetros de motilidad de espermatozoides

1. Configuración del módulo de movilidad del Software
   1. Establecer la etapa de refrigerador a 4 ° C y esperar hasta que se estabilice.
   2. Abra el software y seleccione Módulo motilidad. Crear nombre de usuario y contraseña si es necesario.
   3. Seleccione propiedades y elija los parámetros deseados antes de iniciar el análisis de esperma.
      1. Haga clic en especies | Pescado.
      2. Seleccionar los Cuadros por segundo y el Número de imágenes, según las mejores condiciones técnicas para cada especie. Configurar ambas opciones en 120 imágenes por segundo.
      3. Elegir el contraste negativo. Es obligatorio para la reconstrucción exacta de los espermatozoides trayectorias¹⁶.
      4. Seleccione la correspondiente Cámara de recuento y escala de la cámara. Calibrar la cámara para la lente de aumento utilizado en el experimento. Establezca SpermTrack10 como cámara de recuento y la escala X 10.
         Nota: en general, una profundidad de 10 μm en la cámara de recuento y una lente de 10 X son las condiciones recomendadas ya que proporcionan la mejor focalización de los espermatozoides y capturar el mayor número de células. Sin embargo, se recomienda hacer un estudio previo de las condiciones óptimas para el análisis de la motilidad de cada especie.
      5. Ajustar el Área de la partícula y la Conectividad para cada especie. Establecer el área de la partícula mínimo en conectividad a 7 μm y μm² 2.
         Nota: Para los peces, el valor mínimo de rangos de área de partículas entre 2-5 μm y la conectividad depende de la velocidad de los espermatozoides y la velocidad de fotogramas.
      6. Guardar la configuración.
   4. Seleccione capturar.
2. Analizar el esperma de la anguila europea con Software
   1. Preparar la solución de activador (agua de mar artificial) mediante la adición de 0,946 g de sal comercial a 25 mL de agua destilada con 2% BSA.
   2. Tomar 500 mL de solución de activador (agua de mar artificial) y en el bloque frío.
      Nota: en general, esperma de pez es activada por un evento de choque osmótico, aunque para algunas especies la concentración del ion también podría ser importante. Para especies de agua dulce, el medio activador debe tener osmolalidad hipotónica, mientras que para especies marinas, el medio debe ser hipertónico.
   3. Coloque la cámara cuenta en la etapa de enfriamiento y espere hasta que se estabilice la temperatura a 4 ° C.
   4. Mezcle el activador y activar espermatozoides y empezar el grabación entre 5-10 s después de la activación de vídeo motilidad esperma diluida.
      1. Tomar 4 μL de solución de activador y lugar en la cámara de conteo.
      2. Homogeneizar suavemente el esperma diluido agitando la microcentrífuga 3 veces para evitar daños en las células de espermatozoides.
      3. Tomar 0,5 μl de semen diluido, mezclar con el activador y poner la tapa de la cámara de conteo rápido.
         Nota: Este paso no debe tomar más de 5 s para iniciar el análisis tan pronto como sea posible.
      4. En las células de espermatozoides y encontrar la mejor zona visual, que se define por un número bajo de espermatozoides (150-200 células) para evitar la intercepción entre las células (suplementario Figura 1A). Seleccionar Captura de Video para obtener las pistas de espermatozoides, que están separadas según la velocidad.
      5. Seleccione capturar para obtener campos de 3 a 7, que son el intervalo óptimo para obtener una menor variabilidad en los resultados y proceder como antes. Grabar videos de hasta 120 activación posterior de s con el fin de evitar la condensación en la tapa de la cámara de conteo.
      6. Seleccione salir para tener una visión general de todos los campos.

4. obtener los datos de motilidad

1. Seleccionar campos de | Parcial | Guardar y elegir un nombre de archivo. Haga clic en Guardar.
   Nota: La hoja de cálculo proporciona valores medios de datos, gráficos e imágenes de pistas de espermatozoides.
2. Seleccione datos generales | Nombre de archivo | Guardar.
   Nota: Los datos proporcionan valores cinéticos para espermatozoides individuales de todos los campos.

Resultados

Análisis del efecto de tiempo en la motilidad del esperma

En el caso de la anguila europea, el porcentaje de espermatozoides estáticos aumentó de 15 s a 120 s después de la activación (de 24,4% a 40,7%) y el porcentaje de espermatozoides móviles de progresivas disminución (de 36,9% a 20,9%) (Figura 1A y 1B). Basada en la velocidad, las células espermatozoide...

Discusión

El software de análisis de esperma utilizado en este protocolo ha sido utilizado por investigadores en todo el mundo para diferentes especies, incluyendo peces. Sin embargo, los peces tienen algunas características específicas que pueden afectar la evaluación de espermatozoides. Espermatozoides de peces mostraron alta velocidad en el momento de la activación que declina rápidamente y conduce a un corto plazo de la movilidad después de la activación. Además, la temperatura de la reproducción depende de la especi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Chorionic Gonadotropin	Argent Chemical Laboratories	hCG	Hormone
Benzocaine	Merck	E1501 Sigma	Anesthesia
sodium bicarbonate	Merck	S5761 Sigma	P1 medium
sodium chloride	Merck	1.06406 EMD Millipore	P1 medium
magnesium chloride	Merck	1374248 USP	P1 medium
potassium chloride	Merck	P3911-500G	P1 medium
calcium chloride	Merck	C7902-500G	P1 medium
commercial salt	Aqua Medic	Meersalz	Activator solution
BSA	Merck	05470 Sigma	Activator solution
Falcon tubes 15 ml	Merck	T1943-1000EA
Falcon tubes support	Merck	R5651-5EA
Eppendorfs	Merck	T9661-1000EA
Micropipet 20 µl	Gilson	PIPETMAN® Classic
Micropipet 10 µl	Merck	Z683787-1EA
Tips for micropipets 20 µl	Merck	Z740030-1000EA
Tips for micropipets 10 µl	Merck	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	Counting chamber
TruMorph	PROiSER	TruMorph
Microscope UB 200i Serie	PROiSER	Microscope
Cooler plate	PROiSER		Prototype
Cooler block	PROiSER		Prototype
ISAS v1	PROiSER	ISAS	Software