АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий Протокол описывает процедуру оценки спермы рыбы с помощью анализа спермы, компьютерный и охлаждения устройства. Программное обеспечение дает быстрый, точный и количественный анализ качества спермы рыбы, основанный на подвижность сперматозоидов, который может быть полезным инструментом в аквакультуре для улучшения воспроизводства успех.

Аннотация

Для оценки качества гамет есть новаторские, быстрое и количественные методы, которые могут предоставить полезные данные для аквакультуры. Компьютеризированных систем для анализа спермы были разработаны для измерения несколько параметров и один из наиболее часто измеряемых сперматозоидов.

Первоначально этой компьютерной техники был разработан для млекопитающих, хотя он также может использоваться для анализа спермы рыбы. Рыбы имеют особенности, которые могут повлиять на спермы оценки например, короткий моторики время после активации и, в некоторых случаях, адаптация к снижению температуры. Таким образом необходимо изменить программное и аппаратное обеспечение компоненты сделать анализ сократительной способности более эффективным для анализа спермы рыбы. Для млекопитающих спермы нагревательная пластинка используется для поддержания оптимальной температуры сперматозоидов. Однако для некоторых видов рыб, это выгодно использовать более низкую температуру продлить продолжительность моторики, так как сперма активна для менее 2 мин. Таким образом Охлаждающие устройства необходимо охладить образцов при постоянной температуре за время анализа, в том числе на оптический микроскоп. Этот протокол описывает анализ Рыба сперматозоидов с помощью программного обеспечения для анализа спермы и новых охлаждающих устройств для оптимизации результатов.

Введение

Эффективность воспроизведения зависит от качества обоих гамет (яйца и сперматозоиды)1,2. Это является важным фактором, который способствует успешного оплодотворения, позволяя развития жизнеспособного потомства3,4. Удобный оценки качества гамет является лучшим инструментом для определения потенциала плодородия образца.

Смешивания спермы от нескольких самцов является обычной практикой в производстве многих водных коммерческих видов4. Однако спермы изменчивость между мужчинами может привести к конкуренции спермы, и, следовательно, не все мужчины одинаково вклад генофонда5. В этом смысле правильной оценки отдельных эякулята/сперматозоидов функций, таких как подвижность, имеет основополагающее значение для получить дискриминационные информацию, касающуюся отдельных мужской фертильности потенциал. Непосредственное наблюдение за сперматозоидов может производить неточными и субъективные данные как он требует времени и опыта, который приводит к несовместимости результатов6,7и отсутствие последовательности. Однако есть много новаторских, быстрое и количественных методов, которые могут обеспечить надежный спермы качества анализа2,4.

Анализ спермы компьютерный был разработан предлагать точные данные о качества спермы8. Эта технология включает в себя разработку программного обеспечения, связанные с микроскопом контраст фазы, которая позволяет оценки подвижности сперматозоидов. Однако ограничивающим фактором моторики параметра является частота кадров видео-камеры. Индивидуальных траекторий основаны на сперматозоиды сперматозоидов голова центроид позиции в последовательных кадров видеозаписей, который коррелирует с flagellar движение модели3,9,10, 11. основные кинетические параметры измерения являются прямой линии скорости (ВУС), криволинейная скорость (VCL) и средней траектории скорости (VAP). VSL — это расстояние между начальной и конечной точки, принятые сперматозоидов, деленному на время. VCL-реальная скорость по точной траектории, принятые сперматозоидов. VAP-скорость пути производных сглаженного траектории. Эти параметры позволяют дополнительную кинетическую информацию, включая линейность (Лин), прямолинейность (STR), колебание (WOB) и избиение измерения как амплитуда бокового движения головы (ALH) и бить крест частоты (КБК)4,10.

Система анализа спермы первоначально использовался для млекопитающих, и одним из требований для системы – для работы при температуре тела донора (около 37 ° C). Это программное обеспечение может также использоваться для видов рыб; Хотя, это необходимо сделать некоторые приспособления, чтобы уменьшить погрешность результатов анализа спермы. В некоторых видов рыб, таких как лососевых и угорь8,12оплодотворение происходит при низкой температуре (около 4 ° C)2,4. Таким образом чтобы избежать неудобных условий труда должны разрабатываться охлаждения устройства. Кроме того Рыба сперматозоидов сперматозоидов в семенной жидкости и требуют осмотическим шоком для активации сократительной способности. Для пресноводных видов средний активатор должны иметь гипотонический осмотического давления, в то время как для морских видов среды должно быть гипертонический. Однако для некоторых видов, как лососевых, концентрация ионов также может быть важным3,4,9. После активации рыбы спермы характеризуется быстрое уменьшение подвижности (менее 2 мин)13,14 и высокой скорости, будучи жизненно необходимо определить оптимальную частоту кадров для получения надежных данных15.

Цели этого исследования, для разработки и применения систем охлаждения для рыб образцов спермы. Кроме того этот протокол определяет способ определить оптимальную частоту для создания стандартных протоколов в зависимости от вида. Использование этого протокола открывает новые двери в контексте рыбы семенных оценки, используя Европейский угорь в качестве модели.

протокол

Процедуры с участием животных темы были одобрены общее направление производства сельскохозяйственной продукции и скота на университетской политехнического де Валенсия (2015/VSC/горох/00064).

1. сбор спермы от зрелых Европейский угорь в плену

Примечание: Использование угорь мужчины поддерживали в цистернах с морской водой и системой рециркуляции при постоянной температуре (20 ° C). Лечить гормонами через загрузок внутрибрюшинной инъекции (хорионического гонадотропина человека (ХГЧ); 1,5 МЕ / г массы тела рыбы). Акклиматизировать постепенно начиная с 3 суток в пресноводных рыб после замены с морской водой (1/3 от общего объема воды в баке) каждые 2 дня до достижения соленость 37.0 g/мл.

  1. Анестезировать угорь 24 ч после инъекции гормона для получения образцов с лучшее качество спермы.
    1. Заранее подготовить анестезии: добавить 300 мг бензокаин до 100 мл 70% этанола. Хорошо перемешать и хранить при 4 ° C.
    2. Разбавьте бензокаин в гибкой ведро с 5 Л воды системы получить окончательный концентрации 60 мг/Л и смешайте правильно.
    3. Передача рыбы в ведро с водой системы и бензокаин. Подождите несколько минут, пока рыба успокоиться.
  2. Очистка области половых органов с водой и высушить фильтровальную бумагу, чтобы избежать загрязнения образцов спермы, калом, мочой или морской воды.
  3. Применить нежное давление в брюшной области и сбор образцов спермы в 15 мл пластиковых трубок с помощью вакуумного насоса. Объем спермы до 6-7 мл, в зависимости от мужчин.
  4. Держите образцов спермы на 4 ° C для по крайней мере 1 h, пока проводится анализ подвижности.

2. хранить в холодильнике и развести образцы спермы

  1. Заранее подготовьте разбавителя решение.
    Примечание: Образцов спермы следует разбавить в расширитель решения, специфичные для каждого вида.
    1. Подготовьте средне-активатор для образцов спермы угорь (P1 средний). Добавьте 0,42 г бикарбоната натрия, 1.828 г натрия хлорида, 0,127 г хлорида магния, 0,56 г калия хлорида и 0,037 г хлорида кальция до 250 мл дистиллированной воды. Смесь хорошо распустить. Хранить при 4 ° C.
  2. Установите кулер блок на 4 ° C для поддержания образцов при постоянной температуре. Подождите, пока температура стабилизируется.
  3. Развести образцы спермы с помощью разбавителя конкретные решения для каждого вида.
    Примечание: Коэффициент разрежения конкретные виды и должен быть определен для стандартизации протокол. Во-первых оценки концентрации сперматозоидов, основанный на концентрации, полученные в предварительный анализ сократительной способности, с помощью программного обеспечения, как описано в шагах 3 и 4. С этим анализом это также можно выбрать лучшие образцы спермы, основанные на процентах подвижности. После этого исследователь может начать сбор данных для эксперимента с использованием лучших образцов с правильной концентрации.
    1. Развести образцы спермы угорь в средстве P1 с соотношением 1:50. Чтобы подготовить 500 мкл угорь разбавленный спермы, добавьте 50 мкл пример свежей спермы и 450 мкл P1. Хорошо перемешайте.

3. оценки параметров подвижности спермы

  1. Настройка модуля сократительной способности программного обеспечения
    1. Установите кулер этап при температуре 4 ° C и подождите, пока она стабилизируется.
    2. Откройте программу и выберите Модуль подвижности. При необходимости создайте имя пользователя и пароль.
    3. Выберите Свойства и выберите желаемые параметры перед началом анализа спермы.
      1. Нажмите на видов | Рыба.
      2. Выберите Кадров в секунду и Число изображений, в зависимости от лучших технических условий для каждого вида. Установите оба варианта в 120 кадров в секунду.
      3. Выберите отрицательный контраст. Она является обязательной для точной реконструкции сперматозоидов траекторий16.
      4. Выберите соответствующий Подсчета камеры и масштаб видео-камеры. Калибровка камеры видео для увеличения объектива используется в эксперименте. Задать SpermTrack10 в качестве счетной палаты и 10 X масштаба.
        Примечание: В целом, на глубину 10 мкм в Счетной палате и увеличение объектива 10 X являются Рекомендуемые условия так как они обеспечивают лучшее сосредоточение всех сперматозоидов и захватить наибольшее количество клеток. Однако рекомендуется сделать предыдущие исследования оптимальных условий для анализа подвижности каждого вида.
      5. Настройка Области частиц и подключения для каждого вида. Задать область минимальный частиц на 2 мкм2 и подключения на 7 мкм.
        Примечание: Для рыб, минимальное значение частиц области колеблется от 2-5 мкм и подключения зависит от скорости сперматозоидов и частоту кадров.
      6. Сохраните настройки.
    4. Выберите захват.
  2. Анализ спермы угорь с программным обеспечением
    1. Приготовляют раствор активатора (искусственный морской воды) путем добавления 25 мл дистиллированной воды с 2% BSA 0.946 g коммерческих соли.
    2. Возьмите 500 мл раствора активатор (искусственный морской воды) и место в блоке прохладнее.
      Примечание: В целом, рыбы спермы активируется событием осмотическим шоком, хотя для некоторых видов концентрации ионов может также иметь важное значение. Для пресноводных видов средний активатор должны иметь гипотонический осмотического давления, в то время как для морских видов среды должно быть гипертонический.
    3. Положите Счетной палаты стадии охлаждения и подождать до тех пор, пока температура стабилизируется до 4 ° C.
    4. Mix активатор и разбавленных спермы, чтобы активировать сперматозоидов и начать запись между 5-10 секунд после активации сократительной способности видео.
      1. Возьмите 4 мкл раствора активатор и место в Счетной палате.
      2. Аккуратно гомогенизировать разреженных спермы путем встряхивания microcentrifuge 3 раза, чтобы избежать повреждения клеток сперматозоидов.
      3. Возьмите 0.5 мкл разбавленного спермы, смешать с активатором и Поставьте крышку в Счетной палате быстро.
        Примечание: Этот шаг не следует принимать более чем 5 s, чтобы как можно скорее начать анализ.
      4. Фокус на клетки сперматозоидов и найти лучшие визуальные области, которая определяется низкое количество сперматозоидов (150-200 клеток) чтобы избежать перехвата между ячейками (Дополнительные рис. 1A). Выберите Захват видео для получения сперматозоидов треков, которые разделены согласно скорость.
      5. Выберите захват для получения поля 3-7, которые являются оптимальный интервал для получения нижней изменчивость в результатах и приступить, как раньше. Запись видео до 120 s после активации во избежание конденсации на обложке Счетной палаты.
      6. Выберите выход , чтобы иметь общее представление о всех полей.

4. получение данных моторики

  1. Выберите поля, | Частичный | Сохранить и выбрать имя файла. Нажмите кнопку сохранить.
    Примечание: Таблица обеспечивает средние значения частичные данные, графики и изображений сперматозоидов треков.
  2. Выберите Общие данные | Имя файла | Сохранить.
    Примечание: Данные предоставляют кинетическая значения для отдельных сперматозоидов всех полей.

Результаты

Анализ времени влияние на подвижность сперматозоидов

В случае угорь, доля статической сперматозоидов, увеличилась с 15 s до 120 секунд после активации (с 24,4% до 40,7%) и процент мобильных прогрессивного сперматозоидов сократилось (?...

Обсуждение

Программное обеспечение анализа спермы, используемые в настоящем Протоколе использовался исследователями во всем мире для различных видов, включая рыб. Однако рыбы имеют некоторые особенности, которые могут повлиять на оценки спермы. Рыба сперматозоидов показали высокую скорость в м...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Этот проект получил финансирование от стоимости ассоциации (продовольствие и сельское хозяйство стоимость действий FA1205: AQUAGAMETE и научных исследований и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 под Марии Склодовской-Кюри проекта ВПЕЧАТЛЯЮТ (GA No 642893). Мы хотели бы поблагодарить научный коллектив PROiSER, специально для студентов Альберто Vendrell Бернабеу, за его активное участие в записи видео этого проекта.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Human Chorionic GonadotropinArgent Chemical LaboratorieshCGHormone
BenzocaineMerckE1501 SigmaAnesthesia
sodium bicarbonateMerckS5761 Sigma P1 medium
sodium chlorideMerck1.06406 EMD MilliporeP1 medium
magnesium chlorideMerck1374248 USPP1 medium
potassium chlorideMerckP3911-500GP1 medium
calcium chlorideMerckC7902-500GP1 medium
commercial saltAqua Medic MeersalzActivator solution 
BSAMerck05470 SigmaActivator solution 
Falcon tubes 15 mlMerckT1943-1000EA
Falcon tubes supportMerckR5651-5EA
EppendorfsMerckT9661-1000EA
Micropipet 20 µlGilsonPIPETMAN® Classic
Micropipet 10 µlMerckZ683787-1EA
Tips for micropipets 20 µlMerckZ740030-1000EA
Tips for micropipets 10 µlMerckZ740028-2000EA
SpermtrackPROiSERCounting chamber
TruMorphPROiSERTruMorph
Microscope UB 200i SeriePROiSERMicroscope
Cooler platePROiSERPrototype
Cooler blockPROiSERPrototype
ISAS v1PROiSERISASSoftware

Ссылки

  1. Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
  2. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
  3. Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
  4. Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
  5. Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
  6. Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
  7. Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
  8. Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
  9. Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
  10. Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
  11. Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
  12. Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout - the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
  13. Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
  14. Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
  15. Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?. Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
  16. Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
  17. Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
  18. Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
  19. Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
  20. Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
  21. Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
  22. Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
  23. Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
  24. Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
  25. Holt, W. V., O'Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
  26. Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
  27. Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
  28. Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
  29. Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
  30. Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
  31. Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
  32. Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
  33. Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
  34. Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
  35. David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
  36. Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
  37. Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
  38. Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
  39. Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
  40. Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
  41. Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations' structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
  42. Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
  43. Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
  44. Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

137

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены