생선 정자 평가 소프트웨어를 사용 하 여 및 냉각 장치

요약

현재 프로토콜 물고기 정자 평가 정자 컴퓨터 기반 분석을 사용 하 여 및 냉각 장치에의 한 절차를 설명 합니다. 소프트웨어는 신속, 정확 및 재생산 성공을 개선 하 양식 업에 유용한 도구가 될 수 있는 정 충 운동에 따라 생선 정자 품질의 정량 분석을 제공 합니다.

초록

배우자 품질 평가 대 한 양식 업에 대 한 유용한 데이터를 제공할 수 있는 혁신적이 고 빠른, 양적 기술이 있다. 정자 분석을 위한 전산화 시스템 여러 매개 변수를 측정 하기 위해 개발 되었다 이며 가장 일반적으로 측정의 한 정자 운동 성.

처음, 그것은 또한 물고기 정자 분석에 사용할 수 있지만이 컴퓨터 기술 포유류 종, 위해 설계 되었습니다. 물고기는 정자 평가 짧은 운동 시간 활성화 후, 경우에 따라 낮은 온도 적응에 영향을 미칠 수 있는 특정 기능을가지고 있습니다. 따라서, 그것은 보다 효율적으로 운동 성 분석 생선 정자 분석을 위한 소프트웨어 및 하드웨어 구성 요소를 수정 하는 데 필요한입니다. 포유류 정자에 대 한 난방 격판덮개는 정 충의 최적의 온도 유지 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 일부 어 종에 대 한 그것은 유리를 사용 하 여 낮은 온도 때문에 정자 2 분 미만 대 한 활성 상태로 유지 운동의 기간을 연장. 따라서, 냉각 장치는 일정 온도에서 샘플 분석, 광학 현미경에 포함 하 여의 시간 동안 냉장 보관 하는 데 필요한. 이 프로토콜 물고기 정자 운동 성 정자 분석을 위한 소프트웨어를 사용 하 여 및 새로운 냉각 장치를 최적화 하는 결과의 분석을 설명 합니다.

서문

생식의 효능 두 gametes (계란과 정자)^1,2의 품질에 따라 달라 집니다. 이 성공적인 수정, 허용 가능한 자손^3,4의 개발에 기여 하는 주요 요소입니다. 배우자 품질의 편리한 평가 표본의 불 임 가능성을 정의 하기 위한 최고의 도구입니다.

여러 남성에서 정자를 혼합 많은 수생 상업 종⁴의 생산에 있는 관행 이다. 그러나, 남성 사이 정자 가변성 정자 경쟁으로 이어질 수 있습니다 그리고, 따라서, 모든 남성 동등에 기여 하는 유전자⁵. 이런이 의미에서 개별 정액/정 충 등의 기능 운동, 올바른 평가 잠재적인 개별 남성 불 임에 대 한 차별적인 정보를 얻기 위해 기본적 이다. 정자의 운동 성의 직접 관찰 시간과 경험, 일관성의 부족, 결과^6,7의 호환성 요구 하는 때 부정확 하 고 주관적인 데이터를 생성할 수 있습니다. 그러나, 믿을 수 있는 정자 품질 분석^2,4를 제공할 수 있는 많은 혁신적이 고 신속한 양적 기술이 있다.

컴퓨터 기반 정자 분석 정자 품질⁸에 대 한 정확한 데이터를 제공 하기 위해 개발 되었다. 이 기술은 위상 대비 현미경 정자 운동 성 평가 수와 관련 된 소프트웨어의 개발을 포함 합니다. 그러나, 운동 성 매개 변수의 제한 요소 비디오 카메라의 프레임 속도입니다. 개별 정 충 정 충을 기반으로하는 궤도 머리 중심 위치 연속 프레임에서 비디오 녹화의 flagellar 운동 패턴^3,,910, 와 상관 ¹¹. 주요 운동 매개 변수 측정은 직선 속도 (VSL), 곡선 속도 (VCL)와 평균 경로 속도 (VAP). VSL 시작과 끝점 시간으로 나눈 정 충에 의해 촬영 사이의 거리입니다. 소스는 정 충에 의해 정확한 궤적을 따라 실제 속도입니다. VAP 궤적의 파생된 매끄러운된 경로 따라 속도입니다. 이러한 매개 변수는 선형성 (린), 직진도 (STR), 동요 (WOB) 및 측면 머리 운동 (ALH)와 비트 크로스 주파수 (BCF)^4,10의 진폭 같은 박동 측정을 포함 한 추가 운동 정보를 수 있습니다.

정자 분석 시스템은 원래 포유류 종, 사용 되 고 시스템에 대 한 요구 사항 중 하나는 기증자 (약 37 ° C)의 온도에서 동작 하는 것입니다. 물고기 종;이 소프트웨어를 사용하실 수 있습니다. 비록, 그것은 정자 분석 결과의 오류를 줄이기 위해 몇 가지 적응을 만들 필요가 있다. Salmonids 등 장 어^8,12, 일부 어 종에 수정 낮은 온도 (약 4 ° C)^2,4에 발생합니다. 따라서, 냉각 장치 불편 한 작업 조건을 피하기 위해 개발 되어야 한다. 또한, 물고기 정 충은 정액에서 운동 하 고는 삼투성 충격 운동 성 활성화에 필요한. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다. 그러나, 일부 종 salmonids로 이온 농도 또한 수 있습니다 중요 한^3,,49. 활성화 후 생선 정자 운동 성 (2 분 미만)^13,14 및 신뢰할 수 있는 데이터¹⁵를 최적의 프레임 속도 결정 하는 중요 한 되 고 높은 속도의 급속 한 감소에 의해 특징입니다.

이 연구의 목표는 디자인 생선 정자 샘플에 대 한 냉각 시스템을 적용 하는. 또한,이 프로토콜에는 종에 따라 표준 프로토콜의 설립에 대 한 최적의 프레임 속도 확인 하는 방법을 정의 합니다. 이 프로토콜을 사용 하는 모델로 유럽 장 어를 사용 하 여 물고기 정액 평가의 맥락에서 새로운 문을 엽니다.

프로토콜

절차와 관련 된 동물 주제 되었습니다 승인 (2015/VSC/완두콩/00064) 농업 생산 및 가축 Universitat Politècnica de València에서의 일반적인 방향으로.

1. 포로에서 성숙한 유럽 뱀장어에서 정자 수집

참고: 사용 유럽 장 어 남성 해 수와 일정 온도 (20 ° C)에서 재순환 시스템 탱크에서 유지. (인간의 융 생식 샘 자극 호르몬 (hCG), 물고기 몸 무게의 g 당 1.5 IU) 주간 복 주사를 통해 호르몬 치료. 해 수와 교체 뒤 점차 시작 3 일 민물 물고기 순응 (탱크에서 총 수의 1/3) 37.0 g/mL의 염 분을 도달할 때까지 매 2 일.

1. 더 나은 품질의 정자 샘플을 얻기 위해 호르몬 주사 후 24 h 장 어를 anesthetize.
   1. 사전에 마 취 준비: 70% 에탄올 100ml에 benzocaine의 300 밀리 그램을 추가. 잘 혼합 하 고 4 ° c.에 저장
   2. 60 mg/L의 최종 농도 고 제대로 혼합 시스템 물 5 l 유연한 버킷에서 benzocaine를 희석.
   3. Benzocaine와 시스템 물 양동이에 물고기를 전송 합니다. 물고기는 진정 될 때까지 몇 분 정도 기다립니다.
2. 물으로 음부를 선택을 취소 하 고 정자 샘플 대변, 소변 또는 바닷물의 오염을 피하기 위하여 흡수 성 종이 함께 건조.
3. 복 부 지역에 부드러운 압력을 적용 하 고 15 mL 플라스틱 튜브 진공 펌프를 사용 하 여 정자 샘플을 수집. 정자 볼륨 남성에 따라 최대 6-7 mL.
4. 운동 성 분석 실시 될 때까지 적어도 1 시간에 4 ° C에서 정자 샘플을 유지.

2. 냉동 및 정자 샘플을 희석

1. Diluter 솔루션을 미리 준비 합니다.
   참고: 각 종족에 대 한 특정 extender 솔루션 정자 샘플을 희석 한다.
   1. 장 어 정자 샘플 (P1 매체)에 대 한 비-활성 제 매체를 준비 합니다. 나트륨 중 탄산염, 염화 나트륨, 염화 마그네슘, 염화 칼륨 및 증류수 250 mL를 염화 칼슘의 0.037 g 0.56 g의 0.127 g의 1.828 g의 0.42 g을 추가 합니다. 믹스 잘 분해 하. 4 ° c.에 게
2. 일정 한 온도에서 샘플을 유지 하기 위해 4 ° C에서 쿨러 블록을 설정 합니다. 온도 안정화 될 때까지 기다립니다.
3. 사용 하 여 각 종족에 대 한 diluter 솔루션 특정 정자 샘플을 희석.
   참고: 희석 비율 특정 종족 이며, 표준화 프로토콜을 정의 합니다. 첫째, 정자 농도 3, 4 단계에 설명 된 대로 소프트웨어를 사용 하 여 운동 성의 사전 분석에서 얻은 농도에 따라 예상 됩니다. 이 분석, 그것은 또한 운동 성의 비율에 따라 최고의 정자 샘플을 선택할 수입니다. 이 후, 연구원 최고의 샘플을 사용 하 여 정확한 농도와 실험에 대 한 데이터 수집을 시작할 수 있습니다.
   1. 1시 50분의 비율로 P1 매체에서 장 어 정자 샘플을 희석. 500 µ L 희석 장 어 정자의 준비, 신선한 정자 샘플의 50 µ L과 p 1의 450 µ L를 추가 합니다. 잘 믹스.

3. 평가 정자 운동 성 매개 변수

1. 설정 소프트웨어의 운동 성 모듈
   1. 4 ° C에서 쿨러 무대를 설정 하 고 안정 될 때까지 기다립니다.
   2. 소프트웨어를 오픈 하 고 운동 성 모듈을 선택 합니다. 필요한 경우 사용자 이름 및 암호를 만듭니다.
   3. 속성 을 선택 하 고 정자 분석을 시작 하기 전에 원하는 매개 변수를 선택 합니다.
      1. 종 클릭 | 물고기.
      2. 각 종족에 대 한 최고의 기술 조건에 따라 초당 프레임 및 이미지 번호를선택 합니다. 초당 120 이미지에서 두 옵션을 설정 합니다.
      3. 네거티브 대비를 선택 합니다. 그것은 정 충 궤도¹⁶의 정확한 개조에 대 한 필수입니다.
      4. 해당 계산 챔버 와 비디오 카메라의 규모 를 선택 합니다. 실험에 사용 된 확대 렌즈에 대 한 비디오 카메라를 보정. 세 실으로 SpermTrack10 및 10 X 규모를 설정 합니다.
         참고: 일반적으로, 세 실에서 10 µ m의 깊이 10 X의 확대 렌즈는 권장된 조건 때문에 그들은 모든 정 충의 더 나은 초점을 제공 하 고 세포의 가장 높은 번호를 캡처. 그러나, 각 종족의 운동 성 분석에 대 한 최적의 조건의 이전 연구를 확인 하는 것이 좋습니다.
      5. 각 종족에 대 한 입자 영역 및 연결 을 조정 합니다. 2 µ m² 와 7 µ m에서 연결 최소 입자 영역을 설정 합니다.
         참고: 물고기, 2-5 µ m, 연결 사이 입자 영역 범위의 최소 값에 따라 다릅니다 정 충 속도 및 프레임 속도.
      6. 설정을 저장 합니다.
   4. 캡처를 선택 합니다.
2. 소프트웨어와 함께 유럽 장 어 정자를 분석
   1. 25 ml 증류수 2 %BSA 상업 소금 0.946 g를 추가 하 여 활성 솔루션 (인공 해 수)를 준비 합니다.
   2. 활성 솔루션 (인공 해 수)의 500 mL 고 쿨러 블록에.
      참고: 일반적으로, 생선 정자 활성화 됩니다 삼투성 충격 이벤트, 일부 수 종에 대 한 이온 농도 또한 중요할 수 있지만. 담 수 종, 활성 매체 있어야 당뇨 osmolality 동안 해양 종 매체 고 해야 합니다.
   3. 냉각 단계 아래 세 챔버를 넣고 온도 4 ° c.에 안정화 될 때까지 기다립니다
   4. 활성 제와 희석된 정자 정 충을 활성화 하 고 운동 성 비디오 활성화 후 5-10 s 사이 녹화 시작을 섞는다.
      1. 세 실에서 활성 솔루션 및 장소 4 µ L를 가져가 라.
      2. 부드럽게 정 충 세포에 손상을 방지 하는 microcentrifuge 3 번 흔들어 희석된 정자 균질.
      3. 희석의 0.5 µ L를가지고, 활성기를 함께 혼합 하 고 신속 하 게 계산 챔버에 커버를 넣어.
         참고:이 단계 5 개 이상 걸리지 않을 겁니다 최대한 빨리 분석을 시작 하는 s.
      4. 정 충 세포에 집중 하 고 최고의 시각적 영역, 정 충 (150 ~ 200 셀)을 피하기 위해 셀 (보충 그림 1A) 사이의 차단의 낮은 수에 의해 정의 됩니다. 속도 따라 구분 되는 정 충 트랙을 캡처 비디오 를 선택 합니다.
      5. 결과에서 낮은 변화 하기 전에 진행 하는 최적의 간격을 3 ~ 7 필드를 캡처 를 선택 합니다. 세 실의 표지에 응축을 피하기 위하여 120 s 후 정품 인증까지 기록 영화.
      6. 출구 는 모든 분야의 일반적인 보기를 선택 합니다.

4. 운동 데이터를 얻기

1. 필드를 선택 | 부분 | 저장 파일 이름을 선택 하 고. 저장을 클릭 합니다.
   참고: 스프레드시트 부분 데이터, 차트 및 정 충 트랙의 이미지의 평균값을 제공합니다.
2. 일반 데이터 선택 | 파일 이름 | 저장.
   참고: 데이터를 개별 정 충의 모든 필드에 대 한 운동 값을 제공합니다.

결과

정자의 운동 성에 시간 효과의 분석

유럽 장 어의 경우 정적 정 충의 비율 15에서 증가 120 s s 후 활성화 (24.4%에서 40.7%), 그리고 모바일 진보적인 정 충의 비율 감소 (36.9%에서 20.9%) (그림 1A 그리고 1B). 속도에 따라, 정 충 세포 감소 (그림 1C 및 1d) ?...

토론

이 프로토콜에서 사용 하는 정자 분석 소프트웨어 사용 되었습니다 연구자에 의해 전세계 물고기를 포함 하 여 다른 종족에 대 한. 그러나, 생선 몇 가지 특정 기능을 정자 평가 영향을 미칠 수 있다. 물고기 정 충 신속 하 게 거부 하 고 활성화 후 운동 성의 짧은 시간에 지도 활성화의 순간에 높은 속도 보여주었다. 게다가, 재생산의 온도 종 종속적 이며, 어떤 경우에 약 4 ° C²

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Chorionic Gonadotropin	Argent Chemical Laboratories	hCG	Hormone
Benzocaine	Merck	E1501 Sigma	Anesthesia
sodium bicarbonate	Merck	S5761 Sigma	P1 medium
sodium chloride	Merck	1.06406 EMD Millipore	P1 medium
magnesium chloride	Merck	1374248 USP	P1 medium
potassium chloride	Merck	P3911-500G	P1 medium
calcium chloride	Merck	C7902-500G	P1 medium
commercial salt	Aqua Medic	Meersalz	Activator solution
BSA	Merck	05470 Sigma	Activator solution
Falcon tubes 15 ml	Merck	T1943-1000EA
Falcon tubes support	Merck	R5651-5EA
Eppendorfs	Merck	T9661-1000EA
Micropipet 20 µl	Gilson	PIPETMAN® Classic
Micropipet 10 µl	Merck	Z683787-1EA
Tips for micropipets 20 µl	Merck	Z740030-1000EA
Tips for micropipets 10 µl	Merck	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	Counting chamber
TruMorph	PROiSER	TruMorph
Microscope UB 200i Serie	PROiSER	Microscope
Cooler plate	PROiSER		Prototype
Cooler block	PROiSER		Prototype
ISAS v1	PROiSER	ISAS	Software