Valutazione di sperma di pesce utilizzando Software e dispositivi di raffreddamento

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una procedura di valutazione di sperma di pesce mediante analisi computerizzata dello sperma e dispositivi di raffreddamento. Il software dà un rapido, accurato e l'analisi quantitativa della qualità dello sperma di pesce basata sulla motilità degli spermatozoi, che può essere un utile strumento nel settore dell'acquacoltura per migliorare il successo di riproduzione.

Abstract

Per la valutazione della qualità dei gameti, esistono tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire dati utili per l'acquacoltura. Sistemi computerizzati per l'analisi dello sperma sono stati sviluppati per misurare diversi parametri e uno dei più comunemente misurato è la motilità degli spermatozoi.

Inizialmente, questa tecnologia informatica è stata progettata per specie di mammiferi, anche se può anche essere utilizzato per l'analisi dello sperma dei pesci. I pesci hanno caratteristiche specifiche che possono influenzare la sperma valutazione come un momento di breve motilità dopo l'attivazione e, in alcuni casi, adattamento a temperature più basse. Pertanto, è necessario modificare i componenti hardware e software per analisi di motilità più efficiente per l'analisi dello sperma dei pesci. Per gli spermatozoi dei mammiferi, la piastra di riscaldamento viene utilizzata per mantenere la temperatura ottima di spermatozoi. Tuttavia, per alcune specie di pesci, è vantaggioso utilizzare una temperatura più bassa per prolungare la durata della motilità, dato che gli spermatozoi rimangono attivi per meno di 2 min. Di conseguenza, dispositivi di raffreddamento sono necessari per refrigerare i campioni a temperatura costante sopra il tempo di analisi, tra cui il microscopio ottico. Questo protocollo descrive l'analisi di motilità dello sperma di pesce utilizzando il software per l'analisi dello sperma e nuovi dispositivi per ottimizzare i risultati di raffreddamento.

Introduzione

L'efficacia di riproduzione dipende dalla qualità dei due gameti (uova e spermatozoi)^1,2. Questo è il fattore principale che contribuisce alla fecondazione, permettendo lo sviluppo di prole vitale^3,4. Il conveniente valutazione della qualità dei gameti è lo strumento migliore per definire il potenziale di fertilità di un esemplare.

Miscelazione di sperma da più maschi è una pratica comune nella produzione di molte specie acquatiche commerciali⁴. Tuttavia, la variabilità di sperma tra maschi può portare a concorrenza dello sperma e, di conseguenza, non tutti i maschi sono ugualmente contribuendo al pool genico⁵. In questo senso, la corretta valutazione delle caratteristiche individuali eiaculare/spermatozoi, come motilità, è fondamentale per ottenere informazioni discriminatorie per quanto riguarda la fertilità maschile individuale potenziale. Osservazione diretta di motilità dello sperma può produrre dati inesatti e soggettivi come richiede tempo ed esperienza, che porta a una mancanza di coerenza e incompatibilità di risultati^6,7. Tuttavia, ci sono molte tecniche innovative, rapide e quantitative che possono fornire un affidabile sperma qualità analisi^2,4.

Analisi computerizzata dello sperma è stata sviluppata per offrire dati accurati su sperma qualità⁸. Questa tecnologia comprende lo sviluppo di software associato con un microscopio di contrasto di fase che permette la valutazione della motilità spermatica. Tuttavia, un fattore limitante del parametro motilità è la frequenza dei fotogrammi della telecamera. Individuali degli spermatozoi traiettorie si basano su spermatozoi testa posizione di baricentro in fotogrammi consecutivi di registrazioni video, che è correlata con il movimento flagellare modelli^{3,9,10, 11}. i principali parametri cinetici misurati sono la velocità lineare (VSL), la velocità curvilinea (VCL) e la velocità di percorso medio (VAP). VSL è la distanza tra l'inizio e il punto finale presi dagli spermatozoi divisi da tempo. VCL è la reale velocità lungo la traiettoria precisa presa di spermatozoi. VAP è la velocità lungo un percorso levigato derivata della traiettoria. Questi parametri consentono ulteriori informazioni cinetiche, tra cui linearità (LIN), rettilineità (STR), wobble (WOB) e misurazioni di battitura come ampiezza di movimento laterale della testa (ALH) e frequenza di battimento-Croce (BCF)^4,10.

Il sistema di analisi dello sperma è stato originariamente utilizzato per specie di mammiferi, e uno dei requisiti per il sistema è quello di operare alla temperatura corporea del donatore (circa 37 ° C). Questo software potrebbe essere utilizzato anche per le specie ittiche; anche se, è necessario effettuare alcuni adattamenti per ridurre l'errore di risultati di analisi dello sperma. In alcune specie di pesci, come i salmonidi e anguille^8,12, la fecondazione avviene a bassa temperatura (circa 4 ° C)^2,4. Così, dispositivi di raffreddamento dovrebbero essere sviluppato per evitare scomode condizioni di lavoro. Inoltre, gli spermatozoi di pesce sono immotile nel liquido seminale e richiedono un shock osmotico per attivare la motilità. Per le specie d'acqua dolce, il mezzo di attivatore dovrebbe avere osmolalità ipotonico, mentre per le specie marine il mezzo dovrebbe essere ipertonico. Tuttavia, per alcune specie, come i salmonidi, la concentrazione di ioni potrebbe anche essere importante^3,4,9. Dopo l'attivazione, sperma di pesce è caratterizzato da una rapida diminuzione della motilità (meno di 2 min)^13,14 e ad alta velocità, essendo essenziale per determinare la frequenza di fotogrammi ottimale per ottenere dati affidabili¹⁵.

Gli obiettivi di questo studio sono per progettare e applicare sistemi di refrigerazione per campioni di sperma di pesce. Inoltre, il presente protocollo definisce le modalità determinare i tassi di fotogrammi ottimale per l'istituzione di protocolli standard a seconda della specie. L'utilizzo di questo protocollo apre nuove porte nel contesto della valutazione seminale pesce, utilizzando l'anguilla europea come un modello.

Protocollo

Procedure che coinvolge soggetti animali sono stati approvati (2015/VSC/pisello/00064) dalla direzione generale della produzione agricola e del bestiame presso la Universitat Politècnica de València.

1. raccogliere lo sperma da anguille adulte europee in cattività

Nota: Maschi di anguilla europea uso mantenuti in vasche con acqua di mare e un sistema di ricircolo a temperatura costante (20 ° C). Trattare con gli ormoni attraverso iniezione intraperitoneale settimanale (gonadotropina corionica umana (hCG); 1,5 IU / g del peso corporeo di pesce). Acclimatare pesci gradualmente, cominciando con 3 giorni in acqua dolce seguita da sostituzione con acqua di mare (1/3 del totale dell'acqua del serbatoio) ogni 2 giorni fino a raggiungere una salinità di 37,0 g/mL.

1. Anestetizzare l'Anguilla 24 h dopo l'iniezione di ormone per ottenere campioni con migliore qualità dello sperma.
   1. Preparare in anticipo l'anestesia: aggiungere 300 mg di benzocaina per 100 mL di etanolo al 70%. Mescolare bene e conservare a 4 ° C.
   2. Diluire benzocaina in un secchio flessibile con 5 L di acqua dell'impianto per ottenere una concentrazione finale di 60 mg/L e mescolare bene.
   3. Trasferire il pesce al secchio con acqua dell'impianto e benzocaina. Attendere alcuni minuti fino a quando il pesce si calmi.
2. Cancellare l'area genitale con acqua e asciugare con carta assorbente per evitare la contaminazione dei campioni di sperma da feci, urine o acqua di mare.
3. Applicare una leggera pressione nella zona addominale e raccogliere i campioni di sperma in tubi di plastica da 15 mL con la pompa a vuoto. Volume di sperma fino a 6-7 mL, a seconda del maschio.
4. Mantenere i campioni di sperma a 4 ° C per almeno 1 h fino a motilità analisi viene svolta.

2. mettere in frigorifero e diluire i campioni di sperma

1. Preparare la soluzione di diluente in anticipo.
   Nota: I campioni di sperma devono essere diluiti in soluzione di estensione specifica per ciascuna specie.
   1. Preparare il supporto non-attivatore per campioni di sperma di Anguilla (P1 medio). Aggiungere 0,42 g di bicarbonato di sodio, 1,828 g di cloruro di sodio, 0,127 g di cloruro di magnesio, 0,56 g di cloruro di potassio e 0,037 g di cloruro di calcio a 250 mL di acqua distillata. Miscela bene per dissolvere. Conservare a 4 ° C.
2. Impostare il blocco di raffreddamento a 4 ° C per mantenere i campioni a temperatura costante. Attendere che la temperatura si stabilizzi.
3. Diluire i campioni di sperma usando il DILUENTE soluzione specifici per ogni specie.
   Nota: Il rapporto di diluizione è specie specifico e deve essere definito per standardizzare il protocollo. In primo luogo, stimare la concentrazione di spermatozoi basata sulla concentrazione ottenuta in pre-analisi della motilità utilizzando software, come spiegato nei passaggi 3 e 4. Con questa analisi, è anche possibile selezionare i migliori campioni di sperma sulla base della percentuale di motilità. Dopo questo, il ricercatore può iniziare a raccogliere dati per l'esperimento con i migliori campioni con la giusta concentrazione.
   1. Diluire i campioni di sperma di Anguilla in mezzo P1 con un rapporto di 01:50. Per preparare 500 µ l di sperma diluito di Anguilla, aggiungere 50 µ l del campione di sperma fresco e 450 µ l di P1. Mescolare bene.

3. valutare i parametri di motilità dello sperma

1. Set-up del modulo di motilità del Software
   1. Impostare la fase di raffreddamento a 4 ° C e attendere finché non si stabilizza.
   2. Aprire il software e selezionare il Modulo di motilità. Se necessario, creare nome utente e password.
   3. Selezionare Proprietà e scegliere i parametri desiderati prima di iniziare l'analisi dello sperma.
      1. Fare clic su specie di | Pesce.
      2. Selezionare i Fotogrammi al secondo e il Numero di immagini, a seconda delle condizioni tecniche migliori per ciascuna specie. Impostare entrambe le opzioni 120 immagini al secondo.
      3. Scegliere contrasto negativo. È obbligatorio per la ricostruzione accurata delle traiettorie spermatozoi¹⁶.
      4. Selezionare la corrispondente Camera di conteggio e la scala della videocamera. Calibrare la videocamera per la lente di ingrandimento usata nell'esperimento. Impostare SpermTrack10 come camera di conteggio e 10 X scala.
         Nota: In generale, una profondità di 10 µm nella camera di conteggio e una lente di ingrandimento di 10x sono condizioni raccomandate poiché forniscono la migliore messa a fuoco di tutti gli spermatozoi e catturare il maggior numero di cellule. Tuttavia, si consiglia di fare uno studio precedente delle condizioni ottimali per l'analisi di motilità di ogni specie.
      5. Regolare l'Area delle particelle e la connettività per ciascuna specie. Impostare area minima particella a 2 µm² e connettività a 7 µm.
         Nota: Per i pesci, il valore minimo di particelle zona varia tra 2-5 µm e connettività dipende la velocità di spermatozoi e il frame rate.
      6. Salvare il set-up.
   4. Selezionare cattura.
2. Analizzare lo sperma di anguilla europea con Software
   1. Preparare la soluzione di attivatore (acqua di mare artificiale) aggiungendo 0,946 g di sale commerciale a 25 mL di acqua distillata con 2% BSA.
   2. Prendere 500 mL di soluzione di attivatore (acqua di mare artificiale) e nel blocco di raffreddamento.
      Nota: In generale, la sperma di pesce viene attivato da un evento shock osmotico, anche se per alcune specie la concentrazione di ioni potrebbe inoltre essere importante. Per le specie d'acqua dolce, il mezzo di attivatore dovrebbe avere osmolalità ipotonico, mentre per le specie marine il mezzo dovrebbe essere ipertonico.
   3. Mettere la vaschetta del conteggio sotto la fase di raffreddamento e attendere che la temperatura si stabilizza a 4 ° C.
   4. Mescolare l'attivatore e sperma diluito per attivare gli spermatozoi e avviare la registrazione tra 5-10 s dopo l'attivazione del video di motilità.
      1. Prendere 4 µ l di soluzione attivatore e posto nella camera di conteggio.
      2. Delicatamente e omogeneizzare lo sperma diluito agitando microcentrifuga 3 volte per evitare danni in cellule di spermatozoi.
      3. Prendere 0,5 µ l di sperma diluito, mescolare con l'attivatore e riporre il coperchio della camera di conteggio rapidamente.
         Nota: Questo passaggio non dovrebbe richiedere più di 5 s per avviare l'analisi appena possibile.
      4. Concentrarsi sulle cellule degli spermatozoi e trovare la migliore area visiva, che è definito da un numero basso di spermatozoi (150-200 celle) per evitare l'intercettazione tra cellule (Supplemental Figura 1A). Selezionare Acquisisci Video per ottenere le tracce di spermatozoi, che sono separate in base alla velocità.
      5. Selezionare Capture per ottenere campi da 3 a 7, che sono l'intervallo ottimale per ottenere una bassa variabilità nei risultati e procedere come prima. Registrare video fino a 120 post-attivazione s al fine di evitare fenomeni di condensa sul coperchio della camera di conteggio.
      6. Selezionare uscita per avere una visione generale di tutti i campi.

4. ottenere i dati di motilità

1. Selezionare campi di | Parziale | Salvare e scegliere un nome di file. Fare clic su Salva.
   Nota: Il foglio di calcolo fornisce i valori medi di dati parziali, grafici e immagini di tracce di spermatozoi.
2. Selezionare dati generali | Nome del file | Salvare.
   Nota: I dati forniscono valori cinetici per spermatozoi individuali di tutti i campi.

Risultati

Analisi dell'effetto tempo sulla motilità dello sperma

Nel caso l'anguilla europea, la percentuale degli spermatozoi statici aumentato da 15 s a 120 s dopo l'attivazione (dal 24,4% al 40,7%) e la percentuale di spermatozoi mobili progressivi è diminuito (da 36,9% al 20,9%) (Figura 1A e 1B). Basato su velocità, le cellule degli spermatozoi hanno mostrato una dimin...

Discussione

Il software di analisi dello sperma utilizzato in questo protocollo è stato utilizzato dai ricercatori in tutto il mondo per le diverse specie, tra cui pesce. Tuttavia, i pesci hanno alcune caratteristiche specifiche che possono influenzare la valutazione di sperma. Spermatozoi di pesce ha mostrati ad alta velocità al momento dell'attivazione che declina rapidamente e conduce ad un a breve termine della motilità dopo l'attivazione. Inoltre, la temperatura della riproduzione è specie-dipendente e, in alcuni casi, potr...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Chorionic Gonadotropin	Argent Chemical Laboratories	hCG	Hormone
Benzocaine	Merck	E1501 Sigma	Anesthesia
sodium bicarbonate	Merck	S5761 Sigma	P1 medium
sodium chloride	Merck	1.06406 EMD Millipore	P1 medium
magnesium chloride	Merck	1374248 USP	P1 medium
potassium chloride	Merck	P3911-500G	P1 medium
calcium chloride	Merck	C7902-500G	P1 medium
commercial salt	Aqua Medic	Meersalz	Activator solution
BSA	Merck	05470 Sigma	Activator solution
Falcon tubes 15 ml	Merck	T1943-1000EA
Falcon tubes support	Merck	R5651-5EA
Eppendorfs	Merck	T9661-1000EA
Micropipet 20 µl	Gilson	PIPETMAN® Classic
Micropipet 10 µl	Merck	Z683787-1EA
Tips for micropipets 20 µl	Merck	Z740030-1000EA
Tips for micropipets 10 µl	Merck	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	Counting chamber
TruMorph	PROiSER	TruMorph
Microscope UB 200i Serie	PROiSER	Microscope
Cooler plate	PROiSER		Prototype
Cooler block	PROiSER		Prototype
ISAS v1	PROiSER	ISAS	Software