Évaluation de sperme de poissons à l’aide de logiciels et de dispositifs de refroidissement

Résumé

Le présent protocole décrit une procédure d’évaluation de sperme du poisson à l’aide de spermogramme assistée par ordinateur et de dispositifs de refroidissement. Le logiciel donne un rapide, précis et l’analyse quantitative de la qualité du sperme poisson basée sur la motilité des spermatozoïdes, qui peut être un outil utile pour l’aquaculture afin d’améliorer le succès de la reproduction.

Résumé

Pour l’évaluation de qualité de gamètes, il y a des techniques innovantes, rapides et quantitatives pouvant fournir des données utiles pour l’aquaculture. Systèmes informatisés pour l’analyse du sperme ont été développées pour mesurer plusieurs paramètres et un du plus souvent mesurée est la motilité des spermatozoïdes.

Au départ, cette technologie informatique a été conçue pour les espèces de mammifères, mais il peut également être utilisé pour l’analyse de sperme des poissons. Les poissons ont des caractéristiques spécifiques qui peuvent affecter le sperme évaluation comme un temps de motilité court après l’activation et, dans certains cas, adaptation aux températures inférieures. Ainsi, il est nécessaire de modifier les composants logiciels et du matériel pour faire l’analyse de motilité plus efficace pour l’analyse du sperme poisson. Pour des spermatozoïdes chez les mammifères, la plaque chauffante est utilisée pour maintenir les températures optimales de spermatozoïdes. Toutefois, pour certaines espèces de poissons, il est avantageux d’utiliser une température plus basse pour prolonger la durée de la motilité, étant donné que les spermatozoïdes restent actives pendant moins de 2 min. Dispositifs de refroidissement sont donc nécessaires de réfrigérer les échantillons à température constante pendant la durée de l’analyse, le microscope optique. Ce protocole décrit l’analyse de la motilité de sperme du poisson à l’aide de logiciels pour l’analyse du sperme et de nouveaux dispositifs afin d’optimiser les résultats de refroidissement.

Introduction

L’efficacité de la reproduction dépend de la qualité de ces deux gamètes (oeufs et du sperme)^1,2. C’est le principal facteur qui contribue à une fécondation réussie, permettant le développement d’une descendance viable^3,4. L’évaluation pratique de la qualité des gamètes est le meilleur outil pour définir le potentiel de fécondité d’un spécimen.

Mélange de spermatozoïdes provenant de plusieurs mâles est une pratique courante dans la production de nombreuses espèces commerciales aquatique⁴. Cependant, la variabilité de sperme entre mâles peut conduire à la compétition spermatique et, par conséquent, pas tous les hommes contribuent également au pool génétique⁵. En ce sens, l’évaluation correcte des fonctionnalités de chaque éjaculat/spermatozoïdes, tels que la motilité, est fondamentale pour obtenir des informations au sujet de la fertilité masculine individuelle potentiel discriminatoires. L’observation directe de la motilité des spermatozoïdes peut produire des données inexactes et subjectives car elle nécessite temps et l’expérience, ce qui conduit à un manque d’uniformité et d’incompatibilité des résultats^6,7. Cependant, il y a beaucoup de techniques innovantes, rapides et quantitatives qui peut fournir un sperme fiable qualité analyse^2,4.

Spermogramme assistée par ordinateur a été développé pour offrir des données précises sur la qualité de sperme⁸. Cette technologie comprend le développement d’un logiciel associé à un microscope à contraste de phase qui permet l’évaluation de la motilité des spermatozoïdes. Cependant, un facteur limitatif du paramètre de la motilité est la fréquence d’images de la caméra vidéo. Spermatozoïdes individuels trajectoires sont basés sur les spermatozoïdes tête position centroïde dans images consécutives d’enregistrements vidéo, qui est en corrélation avec le mouvement flagellaire patrons^{3,9,10, 11}. les principaux paramètres cinétiques mesurés sont la vitesse linéaire (VSL), la vitesse curviligne (VCL) et la vitesse moyenne des chemins (VAP). VSL est la distance entre le début et le virage pris par les spermatozoïdes divisés par le temps. VCL est la vitesse réelle le long de la trajectoire exacte prise par les spermatozoïdes. VAP est la vitesse sur un tracé lissée dérivée de trajectoire. Ces paramètres permettent de plus d’informations cinétiques, y compris linéarité (LIN), rectitude (STR), wobble (WOB) et battant mesures comme l’amplitude de mouvement latéral de la tête (ALH) et la fréquence de battement-Croix (BCF)^4,10.

Le système d’analyse de sperme a été initialement utilisé pour les espèces de mammifères, et l’une des exigences pour le système doit fonctionner à la température du corps du donneur (environ 37 ° C). Ce logiciel pourrait également être utilisé pour les espèces de poissons ; mais, il est nécessaire de faire quelques adaptations afin de réduire l’erreur des résultats d’analyse de sperme. Chez certaines espèces de poissons, tels que les salmonidés et les anguilles^8,12, la fécondation a eu lieu à basse température (environ 4 ° C)^2,4. Ainsi, les dispositifs de refroidissement devraient être élaboré afin d’éviter des conditions de travail pénibles. En outre, les spermatozoïdes de poissons sont immobiles dans le liquide séminal et nécessitent un choc osmotique pour activer la motilité. Pour les espèces d’eau douce, le milieu de l’activateur devrait avoir osmolalité hypotonique, tandis que les espèces marines, le milieu doit être hypertonique. Toutefois, pour certaines espèces, comme les salmonidés, la concentration en ions pourrait également être important^3,4,9. Après activation, poisson sperme est caractérisé par une rapide diminution de la motilité (moins de 2 min)^13,14 et haute vitesse, étant essentiel pour déterminer la fréquence d’images optimale afin d’obtenir des données fiables¹⁵.

Cette étude vise à concevoir et appliquer des systèmes de réfrigération pour les échantillons de sperme de poissons. En outre, ce protocole définit comment déterminer la cadence optimale pour la mise en place de protocoles normalisés selon les espèces. L’utilisation de ce protocole ouvre de nouveaux horizons dans le cadre de l’évaluation séminal du poisson, à l’aide de l’anguille européenne comme un modèle.

Protocole

Procédures avec des sujets animaux ont été approuvées (2015/VSC/pois/00064) par la Direction générale de la Production agricole et l’élevage à l’Universitat Politècnica de València.

1. recueillir des spermatozoïdes d’anguilles européennes matures en captivité

Remarque : Utilisation anguille européenne les mâles maintenus dans des réservoirs avec l’eau de mer et un système de recirculation à température constante (20 ° C). Traiter avec des hormones par injection intrapéritonéale hebdomadaire (gonadotrophine chorionique humaine (hCG) ; 1,5 UI / g de poids poisson). Acclimater les poissons graduellement à partir de 3 jours en eau douce suivie de remplacement avec l’eau de mer (1/3 de l’eau dans le réservoir) tous les 2 jours jusqu'à arriver à une salinité de 37,0 g/mL.

1. Anesthésier l’anguille 24 h après l’injection d’hormones pour prélever des échantillons avec une meilleure qualité de sperme.
   1. Avant l’anesthésie au préalable : ajouter 300 mg de benzocaïne à 100 mL d’éthanol à 70 %. Bien mélanger et conserver à 4 ° C.
   2. Diluer dans un seau flexible avec 5 L d’eau du système pour obtenir une concentration finale de 60 mg/L et de mélanger correctement la benzocaïne.
   3. Transférer le poisson dans le seau d’eau de système et de la benzocaïne. Attendez quelques minutes jusqu'à ce que le poisson se calme.
2. Effacer les parties génitales avec de l’eau et sécher avec du papier absorbant pour éviter la contamination des échantillons de sperme par les matières fécales, urine ou l’eau de mer.
3. Appliquez une légère pression dans la région abdominale et recueillir des échantillons de sperme dans des tubes en plastique 15 mL à l’aide de la pompe à vide. Volume de sperme jusqu'à 6-7 mL, dépendant de l’homme.
4. Conserver les échantillons de sperme à 4 ° C pendant au moins 1 h jusqu'à ce que la motilité analyse est effectuée.

2. conserver au réfrigérateur et de diluer les échantillons de sperme

1. Préparer la solution DILUTEUR au préalable.
   Remarque : Les échantillons de sperme doivent être dilués dans la solution d’extension spécifique pour chaque espèce.
   1. Préparer le milieu non-activator pour les échantillons de sperme anguille (P1 moyen). Ajouter 0,42 g de bicarbonate de sodium, 1,828 g de chlorure de sodium, 0,127 g de chlorure de magnésium, 0,56 g de chlorure de potassium et 0,037 g de chlorure de calcium à 250 mL d’eau distillée. Mélange bien à dissoudre. Conserver à 4 ° C.
2. Définir le bloc refroidisseur à 4 ° C pour conserver les échantillons à une température constante. Attendez que la température se stabilise.
3. Diluer les échantillons de sperme à l’aide de DILUTEUR solution spécifique pour chaque espèce.
   Remarque : Le coefficient de dilution est spécifique à l’espèce et doit être défini afin de standardiser le protocole. Tout d’abord, évaluer la concentration des spermatozoïdes après la concentration obtenue dans l’analyse préalable de la motilité utilisant le logiciel, comme indiqué dans les étapes 3 et 4. Avec cette analyse, il est également possible de sélectionner les meilleurs échantillons de sperme selon le pourcentage de la motilité. Après cela, le chercheur peut commencer à collecter les données de l’expérience en utilisant les meilleurs échantillons avec la concentration correcte.
   1. Diluer les échantillons de sperme anguille dans le milieu de la P1 avec un ratio de 01:50. Pour préparer 500 µL de sperme anguille dilué, ajouter 50 µL de l’échantillon de sperme frais et 450 µL de P1. Bien mélanger.

3. évaluer les paramètres de la motilité de sperme

1. Mise en place du Module de motilité du logiciel
   1. Préparer un refroidisseur à 4 ° C et attendre qu’il se stabilise.
   2. Ouvrez le logiciel et sélectionnez Le Module de motilité. Créer le nom d’utilisateur et mot de passe si nécessaire.
   3. Sélectionnez Propriétés et choisissez les paramètres souhaités avant de commencer l’analyse du sperme.
      1. Cliquez sur espèces | Poissons.
      2. Sélectionnez Nombre d’Images, Images par seconde et selon les meilleures conditions techniques pour chaque espèce. Définissez les deux options à 120 images par seconde.
      3. Choisissez le contraste négatif. Il est obligatoire pour une reconstruction exacte des spermatozoïdes trajectoires¹⁶.
      4. Sélectionnez la correspondante Chambre de comptage et l' échelle de la caméra vidéo. Calibrer la caméra vidéo pour la lentille de grossissement utilisée dans l’expérience. Définir SpermTrack10 comme chambre de comptage et échelle de X 10.
         Remarque : en général, une profondeur de 10 µm dans la chambre de comptage et une lentille de grossissement de 10 X sont les conditions recommandées car elles fournissent la meilleure mise au point de tous les spermatozoïdes et capturent le plus grand nombre de cellules. Toutefois, il est recommandé de réaliser une étude précédente sur les conditions optimales pour l’analyse de la motilité de chaque espèce.
      5. Ajustez la Zone de particules et de la connectivité pour chaque espèce. Définir zone minimale de particules à 2 µm² et la connectivité à 7 µm.
         Remarque : Pour les poissons, la valeur minimale de la plage s’étend entre 2 à 5 µm et la connectivité des particules dépend de la vélocité des spermatozoïdes et la cadence.
      6. Enregistrer la mise en place.
   4. Sélectionnez Capture.
2. Analyse de sperme anguille européenne avec le logiciel
   1. Préparer la solution d’activateur (eau de mer artificielle) en ajoutant 0,946 g de sel commercial à 25 mL d’eau distillée avec 2 % de BSA.
   2. Prenez 500 mL de solution d’activateur (eau de mer artificielle) et placer dans le bloc refroidisseur.
      Remarque : en général, poisson sperme est activé par un événement choc osmotique, bien que pour certaines espèces, la concentration en ions pourrait aussi être importante. Pour les espèces d’eau douce, le milieu de l’activateur devrait avoir osmolalité hypotonique, tandis que les espèces marines, le milieu doit être hypertonique.
   3. Mettre la chambre de comptage dans l’étape de refroidissement et attendez que la température se stabilise à 4 ° C.
   4. Mélanger le déclencheur et le sperme dilué pour activer les spermatozoïdes et lancer la vidéo de la motilité d’enregistrement entre 5-10 s après l’activation.
      1. Prendre 4 µL de solution d’activateur et place dans la chambre de comptage.
      2. Homogénéiser doucement le sperme dilué en secouant la microcentrifugeuse 3 fois pour éviter des dommages dans les cellules des spermatozoïdes.
      3. Prendre 0,5 µL de sperme dilué, mixer avec l’activateur et mettez le couvercle dans la chambre de comptage rapidement.
         Remarque : Cette étape ne devrait pas prendre plus de 5 s pour commencer l’analyse dès que possible.
      4. Mettre l’accent sur les cellules des spermatozoïdes et trouver la meilleure zone visuelle, qui est définie par un faible nombre de spermatozoïdes (150 à 200 cellules) pour éviter l’interception entre les cellules (Supplemental Figure 1 a). Sélectionnez Capture vidéo pour obtenir les pistes de spermatozoïdes, qui sont séparées en fonction de la vitesse.
      5. Sélectionnez capturer pour obtenir 3 à 7 champs, qui sont l’intervalle optimal pour obtenir une faible variabilité dans les résultats et procédez comme ci-dessus. Enregistrer des vidéos jusqu'à 120 s après l’activation afin d’éviter la condensation sur le couvercle de la chambre de comptage.
      6. Appuyez sur Exit pour avoir une vue générale de tous les champs.

4. obtenir des données de motilité

1. Sélectionnez les champs de | Partielle | Enregistrer et choisir un nom de fichier. Cliquez sur Enregistrer.
   NOTE : La feuille de calcul donne des valeurs moyennes des données partielles, des graphiques et des images de morceaux de spermatozoïdes.
2. Sélectionnez les données générales de | Nom du fichier | Enregistrer.
   NOTE : Les données fournissent les valeurs cinétiques pour les spermatozoïdes individuels de tous les champs.

Résultats

Analyse de l’effet du temps sur la motilité des spermatozoïdes

Dans le cas de l’anguille européenne, le pourcentage de spermatozoïdes statiques est passée de 15 s à 120 s après l’activation (à partir de 24,4 % à 40,7 %) et le pourcentage de spermatozoïdes progressives mobiles a diminué (passant de 36,9 % à 20,9 %) (Figure 1 a et 1 b). Basé sur la ...

Discussion

Le logiciel d’analyse de sperme utilisé dans le présent protocole a servi par des chercheurs dans le monde entier pour les différentes espèces, y compris les poissons. Cependant, les poissons ont certaines caractéristiques spécifiques qui peuvent influer sur l’évaluation de sperme. Spermatozoïdes de poissons a montré la grande vitesse au moment de l’activation qui décline rapidement et mène à une courte période de motilité après activation. En outre, la température de reproduction dépend de l’esp...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Human Chorionic Gonadotropin	Argent Chemical Laboratories	hCG	Hormone
Benzocaine	Merck	E1501 Sigma	Anesthesia
sodium bicarbonate	Merck	S5761 Sigma	P1 medium
sodium chloride	Merck	1.06406 EMD Millipore	P1 medium
magnesium chloride	Merck	1374248 USP	P1 medium
potassium chloride	Merck	P3911-500G	P1 medium
calcium chloride	Merck	C7902-500G	P1 medium
commercial salt	Aqua Medic	Meersalz	Activator solution
BSA	Merck	05470 Sigma	Activator solution
Falcon tubes 15 ml	Merck	T1943-1000EA
Falcon tubes support	Merck	R5651-5EA
Eppendorfs	Merck	T9661-1000EA
Micropipet 20 µl	Gilson	PIPETMAN® Classic
Micropipet 10 µl	Merck	Z683787-1EA
Tips for micropipets 20 µl	Merck	Z740030-1000EA
Tips for micropipets 10 µl	Merck	Z740028-2000EA
Spermtrack	PROiSER	Counting chamber
TruMorph	PROiSER	TruMorph
Microscope UB 200i Serie	PROiSER	Microscope
Cooler plate	PROiSER		Prototype
Cooler block	PROiSER		Prototype
ISAS v1	PROiSER	ISAS	Software