Co-cultivos de neurona y macrófagos para activar macrófagos secretando factores moleculares con actividad Neurite consecuencia

Resumen

El protocolo actual presenta procedimientos experimentales para estimular macrófagos cultivados para ser dotado de capacidad para liberar factores moleculares que promueven la consecuencia del neurite. Tratamiento de entrenamiento de los co-cultivos de neurona-macrófago induce a los macrófagos para producir medio condicionado que posee fuerte neurite consecuencia actividad.

Resumen

Hay fuerte evidencia que los macrófagos pueden participar en la regeneración o la reparación del sistema nervioso lesionado. Aquí, describimos un protocolo en el que los macrófagos son inducidos a producir acondicionado medio (CM) que promueve la consecuencia del neurite. Las neuronas del ganglio (DRG) de adultos raíz dorsal agudo disociadas y plateadas. Después de que las neuronas se unen estable, macrófagos peritoneales son cultivados conjuntamente en una inserción de cultura celular superpuesta en el mismo bien. Cyclophosphate que amperio cíclico (campo de la db) se aplica a las culturas Co durante 24 h, después de que el cultivo celular insertar que contiene los macrófagos se traslada a otro pozo para recoger CM 72 h. La CM de los co-cultivos tratados con db-campamento, cuando se aplica a una cultura de neurona adulta independiente DRG, muestra robusta neurite consecuencia actividad. Los CM Obtenido de los cultivos tratados con db y campamento que consta de un solo tipo de células sólo, neurona DRG o macrófago peritoneal, no mostró actividad de consecuencia del neurite. Esto indica que la interacción entre las neuronas y los macrófagos es indispensable para la activación de los macrófagos que secretaban factores moleculares con actividad de consecuencia del neurite en CM. Así, nuestro paradigma de la cultura también será útil para el estudio de señalización intercelular en la interacción macrófago-neurona para estimular a los macrófagos a ser dotado de un fenotipo pro-regenerativa.

Introducción

Una variedad de estudios han intentado mejorar la regeneración del axon de CNS después de las lesiones de la médula espinal o el cerebro. Las reacciones inflamatorias, que inevitablemente acompaña a las lesiones en el sistema nervioso, tradicionalmente se cree que participan en procesos patológicos secundarios conduce a resultados deletéreos de^1,2. De hecho, metilprednisolona que puede suprimir las reacciones inflamatorias es la única terapia aprobada para lesiones de médula espinal aguda³. Sin embargo, estudios más recientes han proporcionado evidencia que los macrófagos, un tipo de célula inflamatoria representante, pueden participar en la regeneración o la reparación del sistema nervioso lesionado^4,5,6. Por ejemplo, infiltrarse en los macrófagos tras un lente lesiones producen pro renovables las moléculas para promover la regeneración de las neuronas ganglionares de la retina^7,8. Además, trasplantado las neuronas DRG aumentaron en el crecimiento del axón hasta la región donde fueron activados los macrófagos por el zymosan⁹. Por otra parte, los macrófagos en el sitio de la lesión pueden crear un entorno permisivo crecimiento de nervios periféricos lesionados¹⁰.

Nuestro trabajo también proporcionó evidencia fuerte que los macrófagos pueden contribuir a la capacidad de regeneración de axones en las neuronas adyacentes. Hemos demostrado que la activación de los macrófagos en los ganglios de raíz dorsal (GRD) es esenciales para mejorar la capacidad regenerativa de DRG neuronas sensoriales siguiendo un preacondicionamiento periférica del nervio lesión¹¹. Una investigación similar fue reportada independientemente de otro laboratorio¹². También demostramos que intraganglionic inyección de cyclophosphate amperio cíclico (campo de db), que es una molécula conocida para mejorar la capacidad de regeneración del axón¹³, inducida por la activación de los macrófagos. La desactivación de los macrófagos suprimió los efectos de la db-campo de actividad de consecuencia del neurite. Obras posteriores identificaron expresión inducida por la lesión de CCL2 en las neuronas como una señal para estimular macrófagos con un fenotipo pro-regenerativa^14,15.

Basado en los resultados experimentales anteriores, hemos establecido un modelo en vitro que se asemeja a los eventos moleculares que ocurren en los DRGs siguiendo un preacondicionamiento lesiones modelo^11,14. En este modelo, db-campo se aplica a las neurona-macrófago co-cultivos obtención de señalización que conduce a la activación de macrófagos con un fenotipo pro-regenerativa intercelular. Aquí, describimos protocolos detallados que podemos generar los macrófagos que secretan factores moleculares que promueven neurite consecuencia (figura 1). Este modelo experimental ilustra un concepto que los macrófagos pueden ser estimulados o inducidos para apoyar la regeneración del axón siguiendo las lesiones al sistema nervioso. Nuestro modelo también será útil en el estudio de mecanismos de señalización intercelular que conduce a la activación de los macrófagos pro-regenerativa.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el institucional Animal cuidado y uso Comité de Ajou University School of Medicine.

1. cultura preparación de neurona disociado DRG adultos

1. Antes de configurar la cultura, la capa de una placa de 6 pozos con poly-D-lisina y laminina. Incubar una placa de 6 pozos con 0.01% poly-D-lisina a 37° C por 2 h o a 4° C durante la noche. Luego, lave la placa dos veces con agua destilada.
2. Incube la placa con solución de laminina en una concentración de 3 μg/mL en 2 h a temperatura ambiente y lavar la placa dos veces con agua destilada. Secar la placa a temperatura ambiente al menos 1 h.
3. Eutanasia a un ratón en una cámara de₂ CO transparente conectado a una bombona de gas comprimida de CO₂ . Haga una incisión en la piel que cubre la columna vertebral con una cuchilla quirúrgica y disecar los músculos paravertebral bilateral para exponer los huesos vertebrales. Quitar los huesos vertebrales meticulosamente con una pinza quirúrgica con punta estrecha hasta que en el GRD se expone completamente.
   Nota: Las neuronas DRG adultos se obtienen de ratones machos adultos C57BL6 entre 8 semanas a 12 semanas de edad.
4. Retire el DRGs bilateralmente el S1 hasta el nivel de C1 con iridectomía tijeras y pinzas de punta fina con un microscopio de disección. Intente cortar las raíces de GRD para reducir al mínimo la contaminación de las células de Schwann o fibroblastos.
5. Guarde los DRGs disecadas en un 60 mm placa de Petri que contiene 5 mL de frío de Dulbecco modificado Eagle medio (DMEM) en hielo hasta que todos los GRD se recoge.
   Nota: Es crítico para disecar el GRD lo antes posible. La colección de los DRGs de un ratón no debe tardar más de 30 min 30 min después de la eutanasia, dejar de recoger los DRGs y proceder al paso siguiente si todavía siguen GRD.
6. Transferencia de los DRGs a un tubo Eppendorf utilizando una pipeta azul (1000 μL) con un final de corte de 1,5 mL. Retire el DMEM después de una vuelta rápida por varios segundos utilizando una mini centrífuga. Añadir 1 mL de DMEM que contenía 125 colagenasa de XI de tipo U/mL e incubar el tubo durante 90 minutos con una rotación suave (35-40 rpm) usando un agitador de twister en una incubadora de 37 ° C. Inmovilizar el tubo en el piso de coctelera con la cinta.
7. Descarte que contienen colagenasa DMEM y añadir 1 mL de DMEM fresco. Espere hasta que el GRD flotante hundirse completamente en la parte inferior y retire el DMEM con los restos de tejido. Repita este paso de lavado por lo menos seis veces.
   Nota: No trate de descartar completamente el sobrenadante. Tenga cuidado de no eliminar cualquier DRGs con DMEM sobrenadante.
8. Transferencia de los DRGs a un tubo cónico de 15 mL, utilizando una pipeta azul (1000 μL) con un final de corte. Luego pipetee hacia arriba y hacia abajo suavemente por lo menos 15 veces con una punta azul (1000 μL) para hacer una suspensión homogénea. Evitar hacer burbujas y tratar de no tocar el fondo de tubo cónico con una punta de pipeta.
9. Centrifugar el tubo a 239 x g durante 3 min y cuidadosamente descarte el sobrenadante con flotante de residuos. Añadir 1 mL de Neurobasal suplementado con B27 (2.0% v/v) y resuspender el precipitado de células mediante pipeteo suavemente arriba y abajo de 5 a 10 veces.
10. Pasar la suspensión celular a través de un tamiz de celular 70 μm overlaid encima de un tubo cónico de 50 mL. Espere 2 minutos y luego vierta medio Neurobasal/B-27 en el filtro con un aspirador.
11. Todos recogidas neuronas DRG (un total de aproximadamente 2 x 10⁶ DRG las neuronas de un ratón) en dos pozos de la placa de 6 pozos de la placa. Las neuronas DRG de un ratón adulto cubren dos pocillos de una placa de 6 pozos. Luego coloque la placa en un incubador de CO₂ a 37 ° C hasta que el macrófago Co culturas.

2. la cultura de los macrófagos peritoneales rimary P en A cultura de célula introducir

Nota: Establecer las culturas Co 4 h después de la chapa inicial de las neuronas DRG disociadas

1. Macrófagos peritoneales primarios son preparados de ratones machos adultos C57BL6 entre 8 semanas a 12 semanas de edad. Eutanasia a un animal en una cámara de CO₂ . Haga una incisión en la piel abdominal con delicadeza, exponer el peritoneo y evitar cortar el peritoneo para evitar una fuga del líquido de lavado.
2. Punción del peritoneo utilizando una jeringa con una aguja de 22G e inyectar 10 mL de helado salin con tampón fosfato (PBS) en la cavidad peritoneal. Masajee suavemente el peritoneo durante 1-2 minutos. Entonces, saque la aguja y exprimir el PBS a través del sitio de punción de aguja y recoja el líquido de lavado en un tubo cónico de 50 mL.
   Nota: Antes de usarlo, ponga la jeringa en el hielo para mantener la frialdad de la PBS.
3. Centrifugar el líquido del lavado a 239 x g por 10 min a 4 ° C para que sedimenten los componentes celulares. Resuspender el precipitado con 3 mL del tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) por 3 min a temperatura ambiente. Luego Centrifugue la suspensión de células en 239 x g por 10 min a 4 ° C. Resuspender el precipitado con 3 mL de PBS y Centrifugue la suspensión de células otra vez para eliminar cualquier resto tampón de lisis RBC.
   Nota: Asegúrese de que el tampón de lisis RBC se quita totalmente. De lo contrario tampón de lisis RBC restante puede ser tóxica para los macrófagos cultivados.
4. Resuspender las células concentradas en 1 mL de medio de Neurobasal/B-27. La mitad de todos los macrófagos recogidos (un total de 3 × 10⁶ a 6 x 10⁶ células) en un cultivo celular insertar con el área efectiva de 4,2 cm², que se coloca en la parte superior del pozo de la placa disociado DRG.
   Nota: Durante el período de la cultura, los macrófagos se cultivan en medio de cultivo de neuronas de Neurobasal/B-27. Adecuada sobrevivencia de macrófagos bajo esta condición fue confirmada.

3. tratamiento del campo de la Db y colección de macrófagos CM

Nota: Iniciar el tratamiento de la db-campo 4 h después de los co-cultivos de neurona-macrófago.

1. Añadir 2 μl de solución de db-campo de 100 μm a los co-cultivos de neurona-macrófago. Añadir el mismo volumen de PBS para un experimento de control.
2. Después de 24 h, llenar un pozo vacío con 1 mL de medio de cultivo de macrófagos en la misma placa de 6 pozos. Transferencia del célula cultura inserto en las culturas de la neurona y macrófagos al pozo vacío con medio de cultivo de macrófagos. Mantener las células en la misma condición durante 72 h sin cambiar el medio.
   Nota: Agregamos sólo 1 mL de medio de cultivo de macrófagos durante colección de CM para hacer concentrado CM. Durante la colección de CM, si es necesario, agregamos más para cubrir completamente los macrófagos dentro de la inserción.
3. Después de 72 h, centrifugar el macrófago CM a 239 x g durante 5 min eliminar los componentes celulares. Pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0.2 μm para eliminar los residuos celulares restantes. Almacenar el CM recogida a-70 ° C hasta su uso.

4. Neurite consecuencia ensayo recogido cm

1. Antes de configurar una cultura de neuronas DRG adultos separada, la capa de una diapositiva 8-pozo cámara siguiendo el mismo procedimiento descrito en 1.1 y 1.2.
2. Obtener disociado adulto neuronas DRG Neurobasal suplementado con B27 utilizando los mismos métodos descritos de 1,3 a 1.10. Placa de 5 x 10⁴ células por pocillo en la diapositiva de cámara 8-bien prelacado.
3. Coloque el portaobjetos de la cámara en una incubadora de 37 ° C por 2 h, permitiendo que las células en las partes inferiores. Luego, sustituir el medio de cultivo con el CM descongelada que es precalentado a 37 ° C.
   Nota: Tenga cuidado de no tocar la parte inferior de la diapositiva 8-pozo cámara al retirar el medio de cultivo y agregar los centímetros recogidos.
4. 15 h después de la primera chapa, quitarlo del medio y lavar las células con PBS una vez. A continuación, añadir 200 μL de solución de paraformaldehído al 4% helada a los pozos e incubar las células con la solución de paraformaldehído por 20 min a 4 ° C
   Nota: La cultura de neuronas DRG para ensayo de neurite consecuencia debería restringirse precisamente a 15 h. Bajo esta condición, no hay ninguna consecuencia apreciable de la neurita.
5. Lavar tres veces con PBS helado y luego realizar el bloqueo con 10% suero normal de cabra (NGS) con 0,1% Triton-X 30 min incubar las células fijas con solución de anticuerpo primario (anti-Tuj-1) diluida con 10% NGS (en una concentración de 1 μg/mL) durante 4 h en la sala de temperatura o durante la noche a 4 ° C.
6. Lavar tres veces con PBS y luego incubar las células con solución de anticuerpo secundario (cabra anti ratón) por 2 h a temperatura ambiente. Luego, Lave dos veces con PBS y Monte la corredera de la cultura con un cubreobjetos (24 × 50 m m) con solución de montaje.
7. Tomar imágenes utilizando un microscopio de fluorescencia para visualizar la consecuencia del neurite.

Resultados

Se describe un protocolo que puede generar macrófagos capaces de secretar factores moleculares con actividad de consecuencia del neurite. El macrófago CM obtenida de los co-cultivos tratados con db-campo dio lugar a la consecuencia del neurite robusto cuando se aplica a una cultura separada de neurona DRG (figura 2A). En comparación, CM de co-cultivos tratados con PBS no indujo la consecuencia del neurite en nuestra duración 15h cultura (

Discusión

Hay varios pasos fundamentales para la generación de este sistema de co-cultivo. Es importante asegurarse de que las neuronas de ratón DRG y macrófagos peritoneales están preparados frescos y saludables. Hemos experimentado disminución neurite consecuencia actividad del CM cuando la disección de los DRGs tomó más de 30 minutos. Además, la contaminación de los componentes de la sangre en los macrófagos peritoneales también condujo a una disminución de la actividad de consecuencia del neurite en el CM. Con el ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size	Corning,Falcon	353090	Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate
70-μm nylon cell strainer	Corning, Falcon	352350
8-well culture slide	Biocoat	354632	with a uniform application of Poly-D-Lysine
Red blood cell lysis buffer	Qiagen	158904
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Gibco	21103-049	Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin
B-27 supplement, serum free	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	extracellular solution
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminin	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
10% Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	16210072
Triton-X-100	Daejung Chemical and Metal Co	8566-4405
Anti β III tubulin (Tuj-1)	Promega Corporation	G7121	Mouse monoclonal antibody
Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
Hemacytometer	Marienfeld-Superior	N/A
Cell culture CO2 incubator	Panasonic	N/A
Dissecting stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi DV4
Twist shaker	FINEPCR	Tw3t
Tabletop centrifuge	Sorvall	N/A
Confocal microscope	Olympus America Inc	IX71
FBS (Fetal Bovine Serum)	VWR International, Hyclone	SH30919.03
Friedman Pearson Rongeurs	FST (Fine Science Tools)	16021-14	Stainless steel, 14cm, curved, single joint action
Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut	FST (Fine Science Tools)	14558-11	sharp, serrated
Dumont #7 Forceps	FST (Fine Science Tools)	11272-30	Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved
Vannas Spring Scissors	FST (Fine Science Tools)	15000-00	straight, 3mm cutting-edge, sharp
Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge	Artisan Technology Group	DW-41	Input Voltage: 115VAC