Neurone-macrofago co-colture per attivare i macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di neuriti

Riepilogo

Il protocollo attuale presenta procedure sperimentali per stimolare macrofagi coltivati a essere dotati di capacità di rilasciare fattori molecolari che promuovono la conseguenza del neurite. Trattamento dell'accampamento per la co-colture di neuroni-macrofago induce i macrofagi a produrre medium condizionato che possiede l'attività la conseguenza del neurite forte.

Abstract

C'è forte evidenza che i macrofagi possono partecipare la rigenerazione o la riparazione del sistema nervoso danneggiato. Qui, descriviamo un protocollo in cui i macrofagi sono indotti a produrre condizionata medio (CM) che promuove la conseguenza del neurite. Neuroni gangliari (DRG) adulto radice dorsale sono acutamente dissociati e placcati. Dopo avere collegati stabilmente i neuroni, i macrofagi peritoneali sono co-coltivati su un inserto di cultura cellulare sovrapposto sullo stesso bene. Dibutyryl che amp ciclico (db-accampamento) viene applicato per la co-colture per 24 h, dopo di che la coltura delle cellule ins contenente i macrofagi viene spostato in un altro pozzo di raccogliere CM per 72 h. Il CM da co-colture trattate con db-cAMP, quando applicato a una cultura separata per la neuroni DRG adulta, esibisce l'attività di escrescenza robusto del neurite. Il CM ottenuto dalle colture del db-cAMP-trattati che consiste di tipo singola cella da solo, o neuroni DRG o dei macrofagi peritoneali, non ha esibito del neurite escrescenza attività. Questo indica che l'interazione tra macrofagi e neuroni è indispensabile per l'attivazione dei macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di conseguenza del neurite in CM. Così, il nostro paradigma di co-coltura sarà anche utile per studiare segnalazione intercellulare nell'interazione neurone-macrofago per stimolare i macrofagi di essere dotato di un fenotipo pro-rigenerativa.

Introduzione

Vari studi hanno cercato di migliorare la rigenerazione dell'assone di CNS dopo le lesioni del midollo spinale o del cervello. Reazioni infiammatorie, che inevitabilmente accompagnano le lesioni nel sistema nervoso, sono tradizionalmente pensate di partecipare a processi patologici secondari che conduce ai risultati deleteri^1,2. Infatti, il methylprednisolone che possa sopprimere le reazioni infiammatorie è l'unica terapia approvata per acuta del midollo spinale lesioni³. Tuttavia, gli studi più recenti hanno fornito la prova che i macrofagi, un tipo di cellula infiammatoria rappresentative, possano partecipare la rigenerazione o la riparazione del sistema nervoso feriti^4,5,6. Ad esempio, infiltrazione macrofagi seguendo una molecole pro-rigenerativa del produrre lesioni di lente per promuovere la rigenerazione dei neuroni ganglionari^7,8. Inoltre, trapiantati neuroni DRG aumentata crescita assonale nella regione dove sono stati attivati i macrofagi di zymosan⁹. Inoltre, i macrofagi al luogo della lesione possono creare un ambiente permissivo in crescita per nervi periferici feriti¹⁰.

Il nostro lavoro anche fornito la prova ben fondata che i macrofagi possono contribuire alla capacità di rigenerazione dell'assone in neuroni adiacenti. Abbiamo dimostrato che l'attivazione dei macrofagi a livello dei gangli della radice dorsale (DRG) era essenziali per la capacità rigenerativa migliorata delle DRG neuroni sensoriali seguendo un precondizionamento periferico del nervo ferita¹¹. Simile ricerca è stata segnalata in modo indipendente da un altro laboratorio¹². Abbiamo anche dimostrato che l'iniezione intragangliari di dibutirrile AMP ciclico (db-cAMP), che è una molecola ben nota per migliorare la capacità di rigenerazione dell'assone¹³, ha indotto l'attivazione dei macrofagi. La disattivazione dei macrofagi ha abolito gli effetti di db-cAMP sull'attività di conseguenza del neurite. Lavori successivi identificati espressione indotta da lesione di CCL2 nei neuroni come un segnale per stimolare i macrofagi con un fenotipo pro-rigenerativa^14,15.

In base ai risultati sperimentali sopra, abbiamo stabilito un modello in vitro simile ad eventi molecolari che si verificano in DRGs seguendo un precondizionamento ferita modello^11,14. In questo modello, db-cAMP viene applicato alle co-culture neurone-macrofago suscitando intercellulare segnalazione che conduce all'attivazione dei macrofagi con un fenotipo pro-rigenerativa. Qui, descriviamo protocolli dettagliati mediante il quale possiamo generare i macrofagi che secernono fattori molecolari che promuovono neuriti (Figura 1). Questo modello sperimentale illustra un concetto che i macrofagi possono essere stimolati o indotti a sostenere la rigenerazione assonale dopo le lesioni al sistema nervoso. Il nostro modello sarà anche utile per studiare i meccanismi di segnalazione intercellulare che porta all'attivazione dei macrofagi pro-rigenerativa.

Protocollo

Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Comitato di Ajou University School of Medicine.

1. cultura preparazione del neurone dissociata DRG adulto

1. Prima di impostare le impostazioni cultura, pre-cappotto una piastra a 6 pozzetti con poli-D-lisina e laminina. Incubare una piastra a 6 pozzetti con 0,01% poli-D-lisina a 37° C per 2 h o a 4° C durante la notte. Quindi, lavare la piastra due volte con acqua distillata.
2. Incubare la piastra con laminina soluzione ad una concentrazione di 3 µ g/mL per 2 h a temperatura ambiente e poi lavare la piastra due volte con acqua distillata. Asciugare la piastra a temperatura ambiente almeno per 1 h.
3. Eutanasia di un topo in una camera di₂ CO trasparente collegato al cilindro del gas compresso CO₂ . Incidere la cute sovrastante la colonna vertebrale con una lama chirurgica e sezionare i muscoli paravertebrali bilateralmente per esporre le ossa vertebrali. Rimuovere le ossa vertebrali meticolosamente utilizzando una Pinza ossivora chirurgica con punta stretta fino a quando il DRG sono completamente esposti.
   Nota: I neuroni DRG adulto sono ottenuti da topi del maschio adulto C57BL6 di età compresa tra 8 settimane a 12 settimane di età.
4. Rimuovere il DRGs bilateralmente da S1 tutta la strada fino al livello di C1 utilizzando iridectomy forbici e pinze a punta fine sotto un microscopio per dissezione. Provate a tagliare le radici interamente da DRGs al fine di ridurre al minimo la contaminazione delle cellule di Schwann o nei fibroblasti.
5. Memorizzare il DRGs dissecato in una capsula di Petri contenente 5 mL di freddo di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) su ghiaccio fino a quando tutti i DRG sono raccolti di 60 mm.
   Nota: È fondamentale per sezionare il DRG più rapidamente possibile. La raccolta di tutti i DRG da un mouse non dovrebbe richiedere più di 30 min 30 min dopo l'eutanasia, interrompere la raccolta il DRGs e procedere al passaggio successivo, anche se ci sono ancora DRGs.
6. Trasferire il DRGs un 1,5 mL provetta Eppendorf utilizzando un puntale blu (1000 µ l) con un fine di cut-off. Rimuovere il DMEM dopo un giro veloce per alcuni secondi usando una mini centrifuga. Aggiungere 1 mL di DMEM contenente collagenasi XI di 125 U/mL tipo e incubare la provetta per 90 min con una delicata rotazione (35-40 giri/min) utilizzando un agitatore per twister in un incubatore a 37 ° C. Immobilizzare il tubo al piano di shaker utilizzando il nastro.
7. Scartare DMEM contenente collagenasi e aggiungere 1 mL di DMEM fresco. Attendere che il galleggiante DRGs completamente sprofondare verso il basso e quindi rimuovere DMEM con i residui di tessuto. Ripetere questo passaggio di lavaggio almeno sei volte.
   Nota: Non tentare di eliminare il supernatante completamente. Fare attenzione a non rimuovere qualsiasi DRGs con il surnatante DMEM.
8. Trasferire il DRGs in una provetta conica da 15 mL utilizzando un puntale blu (1000 µ l) con un fine di cut-off. Quindi pipettare su e giù delicatamente almeno 15 volte usando una punta di blu (1000 µ l) per fare una sospensione cellulare omogenea. Evitare di fare bolle e cercare di non toccare il fondo della provetta conica con un puntale.
9. Centrifugare la provetta a 239 x g per 3 min e attentamente scartare il surnatante con detriti galleggianti. Aggiungere 1 mL di Neurobasal supplementato con B27 (2,0% v/v) e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente su e giù per 5 a 10 volte.
10. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella di 70 µm sovrapposto nella parte superiore una provetta conica da 50 mL. Attendere 2 min e poi versare 27/B-Neurobasal medio sul filtro usando un pipettatore automatico.
11. Tutti i neuroni DRG raccolti (un totale di circa 2 x 10⁶ neuroni DRG da un mouse) su due pozzetti della piastra a 6 pozzetti della piastra. Neuroni DRG da un topo adulto coprono due pozzetti in una piastra a 6 pozzetti. Quindi posizionare la piastra in un incubatore a CO₂ a 37 ° C fino a quando il macrofago co-culture.

2. co-coltura dei macrofagi peritoneali principa P su un inserto di cultura cellulare

Nota: Stabilire la co-colture 4 h dopo la placcatura iniziale dei neuroni DRG dissociati

1. Macrofagi peritoneali primari sono preparati da topi del maschio adulto C57BL6 di età compresa tra 8 settimane a 12 settimane di età. Eutanasia di un animale in una camera di CO₂ . Incidere la pelle dell'addome delicatamente, esporre il peritoneo ed evitare di tagliare il peritoneo per evitare una fuoriuscita del fluido di lavaggio.
2. Perforare il peritoneo usando una siringa con un ago 22G e iniettare 10 mL di salin ghiacciata di tampone fosfato (PBS) nella cavità peritoneale. Massaggiare delicatamente il peritoneo per 1-2 min. Quindi, estrarre l'ago e spremere il PBS attraverso il sito di puntura dell'ago e raccogliere il liquido di lavaggio in una provetta conica da 50 mL.
   Nota: Prima dell'uso, mettere la siringa sul ghiaccio per mantenere la freddezza di PBS.
3. Centrifugare il fluido di lavaggio a 239 x g per 10 min a 4 ° C per appallottolare le componenti cellulari. Risospendere il pellet con 3 mL di tampone di lisi di globuli rossi (RBC) per 3 min a temperatura ambiente. Poi Centrifugare la sospensione cellulare nuovo a 239 x g per 10 min a 4 ° C. Risospendere il pellet con 3 mL di PBS e centrifugare la sospensione cellulare nuovo per rimuovere qualsiasi buffer di lisi RBC rimanenti.
   Nota: Assicurarsi che il buffer di lisi RBC viene completamente rimosso. In caso contrario buffer di lisi RBC rimanenti possono essere tossici per i macrofagi coltivati.
4. Risospendere le cellule pellettate in 1 mL di terreno Neurobasal/B-27. Piastra metà dei macrofagi raccolti tutti (un totale di 3 × 10⁶ a 6 x 10⁶ cellule) su una coltura cellulare inserire con l'area efficace di 4,2 cm², che è posto sopra il pozzo di DRG dissociata.
   Nota: Durante il periodo di co-coltura, i macrofagi sono coltivati in terreno di coltura del neurone Neurobasal/B-27. Sopravvivenza adeguata dei macrofagi in questa circostanza è stata confermata.

3. trattamento di Db-Camp e raccolta del macrofago CM

Nota: Iniziare il trattamento di db-cAMP 4 h dopo la co-colture di neuroni-macrofago.

1. Aggiungere 2 µ l di soluzione di db-cAMP 100 µM per il co-colture di neuroni-macrofago. Aggiungere lo stesso volume di PBS per un esperimento di controllo.
2. Dopo 24 h, riempire un pozzo vuoto con 1 mL di terreno di coltura del macrofago nello stesso piatto 6 pozzetti. Trasferire l'inserto di cultura delle cellule nelle co-culture neurone-macrofago il pozzo vuoto con terreno di coltura del macrofago. Mantenere le cellule nella stessa circostanza per 72 h senza cambiare mezzo.
   Nota: Aggiungiamo solo 1 mL di terreno di coltura del macrofago durante CM collezione per rendere concentrato CM. Durante la raccolta di CM, se necessario, abbiamo aggiunto più per coprire completamente i macrofagi all'interno dell'inserto.
3. Dopo 72 h, centrifugare il macrofago CM a 239 x g per 5 min rimuovere i componenti cellulari. Passare il surnatante attraverso un filtro da 0,2 µm per rimuovere eventuali detriti residui cellulari. Conservare i raccolti CM a-70 ° C fino all'utilizzo.

4. neuriti Assay con raccolti CM

1. Prima di impostare una cultura di neuroni DRG adulta separata, pre-cappotto una diapositiva 8 pozzetti camera seguendo la stessa procedura descritta in 1.1 e 1.2.
2. Ottenere neuroni DRG adulti dissociati in Neurobasal supplementato con B27 utilizzando gli stessi metodi descritti da 1,3 a 1.10. 5 x 10⁴ cellule per pozzetto sulla diapositiva prepatinato camera 8 pozzetti della piastra.
3. Porre il vetrino di alloggiamento in un incubatore a 37 ° C per 2 h, permettendo che le cellule fissare alla parte inferiore. Quindi, sostituire il terreno di coltura con i CM scongelati che viene preriscaldato a 37 ° C.
   Nota: Fare attenzione a non toccare la parte inferiore della diapositiva 8 pozzetti camera quando si rimuove il terreno di coltura e aggiungendo i raccolti CM.
4. 15 h dopo la placcatura iniziale, rimuovere il supporto e lavare le cellule con PBS una volta. Quindi, aggiungere 200 µ l di soluzione di paraformaldeide 4% ghiacciata ai pozzetti e incubare le cellule con la soluzione di paraformaldeide per 20 min a 4 ° C
   Nota: La cultura di neuroni DRG per l'analisi di conseguenza del neurite dovrebbe essere precisamente limitata a 15 h. In questa circostanza, non c'è nessun apprezzabile neuriti.
5. Lavare tre volte con PBS ghiacciata e quindi eseguire il blocco con 10% siero di capra normale (NGS) con 0,1% Triton-X per 30 min. Incubare le cellule fisse con soluzione di anticorpo primario (anti-Tuj-1) diluita con 10% NGS (ad una concentrazione di 1 µ g/mL) per 4 h a camera temperatura o durante la notte a 4 ° C.
6. Lavare tre volte con PBS e poi incubare le cellule con anticorpo secondario (anti-capra murine) soluzione per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare due volte con PBS, quindi montare il vetrino di cultura con un vetrino coprioggetti (24 × 50 mm) utilizzando la soluzione di montaggio.
7. Prendere immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza per visualizzare neuriti.

Risultati

Descriviamo un protocollo che può generare i macrofagi in grado di secernere fattori molecolari con attività di conseguenza del neurite. Il macrofago CM ottenuti da co-colture trattate con db-cAMP ha provocato neuriti robusto quando applicato a una cultura separata di neuroni DRG (Figura 2A). In confronto, CM ottenuti dalle co-culture PBS-trattati non ha indotto la conseguenza del neurite nella nostra durata coltura 15h (Figura 2B

Discussione

Ci sono diversi passaggi critici per la generazione di questo sistema di co-coltura. È importante garantire che i neuroni DRG mouse e macrofagi peritoneali sono preparati fresco e sano. Abbiamo sperimentato attività di conseguenza diminuita del neurite del CM quando la dissezione di tutti i DRG ha preso più di 30 min. Inoltre, la contaminazione di emocomponenti in macrofagi peritoneali inoltre ha condotto ad una diminuzione di attività la conseguenza del neurite in CM. Al fine di suscitare l'interazione neurone-macro...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size	Corning,Falcon	353090	Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate
70-μm nylon cell strainer	Corning, Falcon	352350
8-well culture slide	Biocoat	354632	with a uniform application of Poly-D-Lysine
Red blood cell lysis buffer	Qiagen	158904
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Gibco	21103-049	Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin
B-27 supplement, serum free	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	extracellular solution
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminin	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
10% Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	16210072
Triton-X-100	Daejung Chemical and Metal Co	8566-4405
Anti β III tubulin (Tuj-1)	Promega Corporation	G7121	Mouse monoclonal antibody
Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
Hemacytometer	Marienfeld-Superior	N/A
Cell culture CO2 incubator	Panasonic	N/A
Dissecting stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi DV4
Twist shaker	FINEPCR	Tw3t
Tabletop centrifuge	Sorvall	N/A
Confocal microscope	Olympus America Inc	IX71
FBS (Fetal Bovine Serum)	VWR International, Hyclone	SH30919.03
Friedman Pearson Rongeurs	FST (Fine Science Tools)	16021-14	Stainless steel, 14cm, curved, single joint action
Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut	FST (Fine Science Tools)	14558-11	sharp, serrated
Dumont #7 Forceps	FST (Fine Science Tools)	11272-30	Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved
Vannas Spring Scissors	FST (Fine Science Tools)	15000-00	straight, 3mm cutting-edge, sharp
Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge	Artisan Technology Group	DW-41	Input Voltage: 115VAC