Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen, Makrophagen sezernieren molekulare Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität zu aktivieren

Zusammenfassung

Das aktuelle Protokoll präsentiert experimentelle Verfahren zur kultivierte Makrophagen, ausgestattet mit einer Kapazität, molekulare Faktoren freizugeben, die Neuriten Auswuchs fördern zu stimulieren. Behandlung des Lagers, das Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen induziert die Makrophagen, konditionierten Medium zu produzieren, die starke Neuriten Auswuchs Aktivität besitzt.

Zusammenfassung

Es gibt starke Hinweise, dass Makrophagen in der Regeneration oder Reparatur des verletzten Nervensystems teilnehmen können. Hier beschreiben wir ein Protokoll, in dem Makrophagen produzieren konditioniert Medium (CM) induziert werden, die Neuriten Auswuchs fördert. Erwachsenen Dorsal Root Ganglion (DRG) Neuronen sind akut dissoziiert und vernickelt. Nachdem die Neuronen stabil befestigt sind, sind peritoneale Makrophagen Co kultiviert auf einer Zelle Kultur einfügen überlagert, gleich gut. Dibutyryl, das zyklische AMP (Db-cAMP), um die Ko-Kulturen für 24 h angewendet wird, nach denen die Zellkultur einfügen, enthält der Makrophagen wird zu einem anderen verschoben, CM 72 h zu sammeln. CM von der Ko-Kulturen behandelt mit Db-cAMP, angewandt auf eine separate Erwachsenen DRG Neuron Kultur zeigt robuste Neuriten Auswuchs Aktivität. Die CM gewonnen aus der Db-cAMP-behandelten Kulturen bestehend aus einzelnen Zellentyp allein, DRG-Neuronen oder peritonealen Makrophagen nicht Neuriten Auswuchs Aktivität aufweisen. Dies bedeutet, dass die Interaktion zwischen Neuronen und Makrophagen ist unverzichtbar für die Aktivierung von Makrophagen sezernieren molekulare Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität in CM. So wird unser Kokultur Paradigma studieren interzelluläre signalisieren in der Neuron-Makrophagen Interaktion stimulieren die Makrophagen, mit einem Pro-regenerative Phänotyp ausgestattet werden auch nützlich.

Einleitung

Eine Vielzahl von Studien haben versucht, CNS Axon Regeneration nach Verletzungen des Rückenmarks oder des Gehirns zu verbessern. Entzündliche Reaktionen, zwangsläufig begleitenden Verletzungen des Nervensystems sind traditionell dachte, zur Teilnahme an sekundären pathologischer Prozessen führt zu den schädlichen Ergebnisse^1,2. Methylprednisolon, die Entzündungsreaktionen zu unterdrücken, kann nämlich die einzige zugelassene Therapie für akute Rückenmark Verletzungen³. Jedoch haben neuere Studien nachgewiesen, dass Makrophagen, einem repräsentativen entzündliche Zelltyp in der Regeneration oder Reparatur des verletzten Nervensystem^4,5,6teilnehmen können. Z. B. infiltrieren Makrophagen nach einem Objektiv Verletzungen produzieren Pro-regenerative Moleküle zu fördern die Regeneration der retinalen Ganglienzellen Neuronen^7,8. Darüber hinaus erhöht die transplantierten DRG-Neuronen Axon Wachstum der Region, wo die Makrophagen durch Zymosan⁹aktiviert wurden. Darüber hinaus können die Makrophagen an der Stelle der Läsion ein Wachstum-freizügigen Milieu für verletzten peripheren Nerven¹⁰erstellen.

Unsere Arbeit hat auch starke Beweise, die Makrophagen, die Kapazität der Axon Regeneration im benachbarten Neuronen beitragen können. Wir haben gezeigt, dass die Aktivierung von Makrophagen in den Dorsal Root Ganglien (DRG) wurden wesentlich verbesserte Regenerationsfähigkeit der DRG sensorische Neuronen nach einer Vorkonditionierung peripheren Nerven Verletzung¹¹. Ähnliche Forschungen wurde unabhängig von einem anderen Labor-¹²berichtet. Wir haben auch gezeigt, dass intraganglionic Injektion von Dibutyryl zyklisches AMP (Db-cAMP), die eine bekannte Molekül, die Kapazitäten der Axon Regeneration¹³ist, die Aktivierung von Makrophagen induziert. Die Deaktivierung von Makrophagen abgeschafft die Auswirkungen des Db-Camps auf Neuriten Auswuchs Aktivität. Spätere Werke identifiziert Verletzungen-induzierte Expression von CCL2 in Neuronen als Signal zu stimulieren Makrophagen mit einem Pro-regenerative Phänotyp^14,15.

Basierend auf den oben genannten experimentellen Ergebnissen, haben wir eine in-vitro- Modell molekularen Ereignisse, die in den DRGs nach ein preconditioning Verletzungen Modell^11,14auftreten ähnlich aufgebaut. In diesem Modell wird die Db-cAMP auf der Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen entlocken interzelluläre signalisieren, dass das zur Aktivierung von Makrophagen mit einem Pro-regenerative Phänotyp führt angewendet. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle durch die Makrophagen erzeugen kann, die molekulare Faktoren fördern Neuriten Auswuchs (Abbildung 1) absondern. Dieses experimentelle Modell zeigt ein Konzept, dass Makrophagen können angeregt oder veranlasst, Axon Regeneration nach Verletzungen des Nervensystems zu unterstützen. Unser Modell wird auch bei der Untersuchung der Mechanismen bei der interzellulären Signalisierung, die zur Aktivierung des Pro-regenerativen Makrophagen führt nützlich sein.

Protokoll

Alle Experimente mit Tieren stimmten die institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss der Ajou University School of Medicine.

(1) Kultur Vorbereitung der dissoziierten Erwachsenen DRG Neuron

1. Vor dem Einrichten der Kulturkreis, Pre-Mantel eine 6-Well-Platte mit Poly-D-Lysin und Laminin. Über Nacht inkubieren Sie eine 6-Well-Platte mit 0,01 % Poly-D-Lysin bei 37° C für 2 h oder bei 4° C. Waschen Sie die Platte zweimal mit destilliertem Wasser.
2. Inkubieren Sie die Platte mit Laminin-Lösung mit einer Konzentration von 3 µg/mL für 2 h bei Raumtemperatur, und dann waschen Sie die Platte zweimal mit destilliertem Wasser. Trocknen Sie die Platte bei Raumtemperatur mindestens 1 h.
3. Einschläfern Sie eine Maus in einer transparenten CO₂ Kammer an einer komprimierten CO₂ Gasflasche angeschlossen. Einzuschneiden Sie die Haut über der Wirbelsäule mit einer chirurgischen Klinge und sezieren Sie die paravertebralen Muskeln auf bilateraler Ebene um die vertebralen Knochen freizulegen. Entfernen Sie die vertebralen Knochen sorgfältig mit einer schmalen Spitze chirurgische Rongeur, bis der DRGs voll ausgesetzt sind.
   Hinweis: Erwachsene DRGs Neuronen stammen von erwachsenen männlichen Mäusen, die C57BL6 im Alter von 8 Wochen, 12 Wochen alt.
4. Entfernen Sie die DRGs bilateral von S1 bis hin zu dem Niveau C1 mit Iridektomie Schere und feine Spitzen Pinzette unter dem sezierenden Mikroskop. Versuchen Sie, die Wurzeln vollständig von DRGs ausgeschnitten, um die Kontamination von Schwann-Zellen oder Fibroblasten zu minimieren.
5. Speichern Sie seziert DRGs in einer 60 mm Petrischale mit 5 mL der kalten Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) auf Eis bis alle der DRGs gesammelt werden.
   Hinweis: Es ist wichtig, so schnell wie möglich die DRGs zu zergliedern. Die Sammlung von allen DRGs von einer Maus sollte nicht länger als 30 min. 30 min. nach der Euthanasie, sammeln der DRGs zu stoppen und mit dem nächsten Schritt fortfahren, selbst wenn gibt es nach wie vor DRGs noch.
6. Der DRGs auf eine 1, 5 mL Eppendorf-Röhrchen mit einem blauen Pipettenspitze (1000 µL) mit einem Cut-Off Ende übertragen. Entfernen Sie die DMEM, nach einer schnellen Runde für einige Sekunden mit einer Mini-Zentrifuge. Fügen Sie 1 mL DMEM mit 125 U/mL Typ XI Kollagenase und inkubieren Sie das Rohr für 90 min mit einer leichten Drehung (35-40 u/min) mit einem Twister Shaker in einem Inkubator 37 ° C. Das Rohr auf dem Shaker-Boden mit Klebeband zu immobilisieren.
7. Verwerfen Sie Kollagenase-haltigen DMEM zu und 1 mL frische DMEM. Warten Sie, bis die schwimmenden DRGs komplett nach unten auf den Boden sinken, und entfernen Sie dann die DMEM mit den Trümmern der Gewebe. Wiederholen Sie dies waschen mindestens sechsmal.
   Hinweis: Versuchen Sie nicht, den Überstand vollständig zu verwerfen. Achten Sie darauf, dass Sie keine DRGs mit Überstand DMEM entfernen.
8. Der DRGs auf eine 15 mL konische Rohr mit einem blauen Pipettenspitze (1000 µL) mit einem Cut-Off Ende übertragen. Dann pipette vorsichtig nach oben und unten mindestens 15 Mal mit einer blauen Spitze (1000 µL) zu einem homogenen Zellsuspension. Verhindern Sie, dass Luftblasen und nicht versuchen Sie, den Boden der konische Rohr mit einer Pipettenspitze berühren.
9. Zentrifugieren Sie das Rohr auf 239 X g für 3 min und entsorgen Sie sorgfältig des Überstands mit Treibgut. Fügen Sie 1 mL Neurobasal Medium ergänzt mit B27 (2,0 % V/V) und Aufschwemmen der Zelle Pellet durch sanft auf und ab 5 bis 10 Mal pipettieren.
10. Ein 70 µm Zelle Sieb auf eine 50 mL konische Rohr überlagert durchlaufen Sie die Zellsuspension. 2 min warten Sie, und gießen Sie dann Neurobasal/B-27 Medium auf das Sieb mit einer Pipette-Controller.
11. Alle gesammelten DRG Neuronen (insgesamt ca. 2 x 10⁶ DRG Neuronen aus einer Maus) auf zwei Brunnen von 6-Well-Platte-Platte. DRG-Neuronen aus einer erwachsenen Maus umfassen zwei Brunnen in einem 6-Well-Platte. Dann legen Sie die Platte in eine CO₂ Inkubator bei 37 ° C, bis die Makrophagen Co Kulturen.

(2) Kokultur P rimary peritonealen Makrophagen auf A Zelle Kultur einfügen

Hinweis: Gründen Sie der Ko-Kulturen 4 h nach der ersten Beschichtung von dissoziierten DRG-Neuronen

1. Primären peritoneale Makrophagen bereiten wir von erwachsenen männlichen Mäusen, die C57BL6 im Alter von 8 Wochen, 12 Wochen alt. Einschläfern eines Tieres in einer CO-₂ -Kammer. Einzuschneiden Sie die Bauchhaut zart, setzen Sie das Peritoneum und vermeiden Sie, schneiden das Bauchfell um ein Austreten von Lavage-Flüssigkeit zu verhindern.
2. Punktieren Sie das Bauchfell mit einer Spritze mit einer 22G Nadel und Spritzen Sie 10 mL eiskaltes Phosphat-gepufferte Salin (PBS) in der Bauchhöhle. Massieren Sie das Peritoneum für 1-2 min. Dann, Nadel herausziehen und squeeze-out der PBS durch die Nadel Punktionsstelle und sammeln die Lavage-Flüssigkeit in einem 50 mL konische Röhrchen.
   Hinweis: Vor dem Gebrauch die Spritze auf Eis die Kälte des öffentlich-rechtlichen Rundfunks zu gelegt.
3. Zentrifugieren der Lavage-Flüssigkeit bei 239 X g für 10 min bei 4 ° C zu die zellulären Komponenten Pellets. Aufschwemmen der Pellet mit 3 mL Erythrozyten (RBC) Lysis Buffer für 3 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension wieder bei 239 X g für 10 min bei 4 ° C. Das Pellet mit 3 mL PBS Aufschwemmen und Zentrifugieren der Zellsuspension erneut, um alle verbleibenden RBC Lyse Puffer zu entfernen.
   Hinweis: Sicherstellen Sie, dass die RBC-Lyse-Puffer vollständig entfernt wird. Sonst möglicherweise verbleibenden RBC Lyse Puffer für den kultivierten Makrophagen toxisch.
4. Die gebeizte Zellen in 1 mL Neurobasal/B-27 Medium aufzuwirbeln. Platte die Hälfte aller gesammelten Makrophagen (insgesamt 3 × 10⁶ bis 6 x 10⁶ Zellen) auf einer Zellkultur mit der Nutzfläche von 4,2 cm², einfügen, die auf den Brunnen der dissoziierten DRG platziert wird.
   Hinweis: Zur Zeit der Kokultur Makrophagen im Neurobasal/B-27 Neuron Kulturmedium angebaut. Angemessene Überleben von Makrophagen unter dieser Bedingung wurde bestätigt.

3. Behandlung von Db-Camp und Sammlung von Makrophagen CM

Hinweis: Starten Sie Db-cAMP Behandlung 4 h nach der Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen.

1. Der Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen 2 µL 100 µM-Db-Lager-Lösung hinzufügen. Fügen Sie die gleiche Menge an PBS für ein Kontrollexperiment.
2. Füllen Sie nach 24 Stunden einen leeren Brunnen mit 1 mL Kulturmedium Makrophagen in den gleichen 6-Well-Platte. Übertragen Sie die Zelle-Kultur-Einlage in der Neuron-Makrophagen Ko-Kulturen auf den leeren Brunnen mit Makrophagen Nährmedium. Halten Sie die Zellen unter der gleichen Bedingung für 72 h ohne Ändern des Mediums.
   Hinweis: Wir fügen Sie nur 1 mL der Makrophagen Kulturmedium während CM Sammlung zu CM konzentriert. Während der CM-Auflistung hinzugefügt, falls erforderlich wir mehr um die Makrophagen innerhalb der Einsatz vollständig zu bedecken.
3. Nach 72 h Zentrifugieren der Makrophagen CM 239 X g für 5 min um den zellulären Komponenten zu entfernen. Durchlaufen Sie den Überstand einen 0,2 µm-Filter, um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. Speichern Sie die gesammelten CM bei-70 ° C bis zur Verwendung.

(4) Neurit Auswuchs Assay mit gesammelten CM

1. Vor dem Einrichten einer separaten Erwachsenen DRG Neuron Kultur, Pre-Mantel eine 8-Well-Kammer-Folie nach dem gleichen Verfahren in 1.1 und 1.2 beschrieben.
2. Erhalten dissoziierte Erwachsenen DRG-Neuronen im Neurobasal Medium mit B27 ergänzt mit den gleichen Methoden von 1,3 auf 1.10 beschrieben. Platte 5 x 10-⁴ -Zellen pro Bohrloch auf der Folie vorbeschichtete 8-Well-Kammer.
3. Legen Sie die Kammer-Folie in einem 37 ° C Inkubator für 2 h, so dass die Zellen an der Unterseite befestigen. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit dem aufgetauten CM, die bei 37 ° c vorgewärmt
   Hinweis: Achten Sie darauf, die unten auf der Folie 8-Well-Kammer zu berühren, wenn das Kulturmedium entfernen und Hinzufügen der gesammelten CM.
4. 15 h nach der ersten Beschichtung, entfernen Sie das Medium und einmal die Zellen mit PBS waschen. Fügen Sie dann 200 µL des eiskalten 4 % Paraformaldehyd Lösung in die Vertiefungen, und die Zellen mit der Paraformaldehyd-Lösung für 20 min bei 4 ° C inkubieren
   Hinweis: Die DRG-Neuron-Kultur für Neuriten Auswuchs Assay sollte genau auf 15 h beschränkt. Unter dieser Bedingung gibt es keine nennenswerten Neuriten Auswuchs.
5. Dreimal mit eiskaltem PBS waschen und führen Sie dann die Sperrung mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) mit 0,1 % Triton-X für 30 min. inkubieren der fixen Zellen mit primären Antikörper (Anti-Tuj-1) Lösung verdünnt mit 10 % NGS (in einer Konzentration von 1 µg/mL) für 4 h am Zimmer Temperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
6. Dreimal mit PBS waschen, und dann die Zellen mit Sekundärantikörper (Ziege-Anti-Maus) Lösung für 2 h bei Raumtemperatur inkubieren. Dann zweimal mit PBS waschen Sie und montieren Sie die Kultur-Folie mit einem Deckgläschen (24 × 50 mm) mit Montage-Lösung.
7. Nehmen Sie Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop Neuriten Auswuchs zu visualisieren.

Ergebnisse

Wir beschreiben eine Protokoll, die Makrophagen in der Lage, die Sekretion von molekularer Faktoren mit Neuriten Auswuchs Aktivität erzeugen kann. Die Makrophagen CM entnommen der Ko-Kulturen behandelt mit Db-cAMP führte robuste Neuriten Auswuchs bei Anwendung auf eine separate DRG-Neuron-Kultur (Abbildung 2A). Im Vergleich dazu CM aus der PBS-behandelten Ko-Kulturen gewonnen nicht Neuriten Auswuchs in unseren 15-h Kultur-Dauer (Abb. 2 ...

Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte zur Erzeugung von diesem Kokulturen-System. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Maus DRG-Neuronen und peritonealen Makrophagen werden frisch zubereitet und gesund. Verminderte Neuriten Auswuchs Aktivität des CM haben wir erlebt, als das Sezieren von der DRGs mehr als 30 min nahmen. Darüber hinaus führte die Kontamination von Blutbestandteilen in peritonealen Makrophagen auch zu einem Rückgang der Neurit Auswuchs Aktivität der CM. Um robuste Neuron-Makrophagen Interaktion von Db...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size	Corning,Falcon	353090	Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate
70-μm nylon cell strainer	Corning, Falcon	352350
8-well culture slide	Biocoat	354632	with a uniform application of Poly-D-Lysine
Red blood cell lysis buffer	Qiagen	158904
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Gibco	21103-049	Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin
B-27 supplement, serum free	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	extracellular solution
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminin	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
10% Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	16210072
Triton-X-100	Daejung Chemical and Metal Co	8566-4405
Anti β III tubulin (Tuj-1)	Promega Corporation	G7121	Mouse monoclonal antibody
Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
Hemacytometer	Marienfeld-Superior	N/A
Cell culture CO2 incubator	Panasonic	N/A
Dissecting stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi DV4
Twist shaker	FINEPCR	Tw3t
Tabletop centrifuge	Sorvall	N/A
Confocal microscope	Olympus America Inc	IX71
FBS (Fetal Bovine Serum)	VWR International, Hyclone	SH30919.03
Friedman Pearson Rongeurs	FST (Fine Science Tools)	16021-14	Stainless steel, 14cm, curved, single joint action
Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut	FST (Fine Science Tools)	14558-11	sharp, serrated
Dumont #7 Forceps	FST (Fine Science Tools)	11272-30	Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved
Vannas Spring Scissors	FST (Fine Science Tools)	15000-00	straight, 3mm cutting-edge, sharp
Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge	Artisan Technology Group	DW-41	Input Voltage: 115VAC