נוירון-מקרופאג תרבויות שותפה להפעלת מקרופאגים הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר Neurite

Summary

בפרוטוקול הנוכחי מציג ניסיוני ההליכים כדי להמריץ מקרופאגים בתרבית כדי להיות ניחן היכולת לשחרר מולקולרי גורמים המקדמים neurite תוצר. טיפול של מחנה לתרבויות המשנה נוירון-מקרופאג המניע את המקרופאגים לייצר בינוני ממוזגים שמחזיק neurite חזק תוצר פעילות.

Abstract

יש ראיות חזקות מקרופאגים יכולים להשתתף התחדשות או תיקון של מערכת העצבים פצועים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול שבו המקרופאגים הם המושרה לבינונית התוצרת ממוזגים (ס מ) המקדמת תוצר neurite. שורש העזוב למבוגרים גנגליון (DRG) נוירונים בחריפות הפומבית, מצופה. לאחר הנוירונים stably מחוברים, מקרופאגים הצפק הם שיתוף בתרבית על הוספה תרבות תאים בשכבות על אותו טוב. Dibutyryl שמחזורי AMP (db-מחנה) מוחל על התרבויות שותף במשך 24 שעות, לאחר מכן להוסיף התרבות התא המכיל את המקרופאגים מועבר היטב אחר כדי לאסוף ס מ עבור 72 h. ס מ התרבויות שיתוף שטופלו db-מחנה, כאשר חל נפרדות למבוגרים DRG נוירון תרבות, תערוכות פעילות תוצר neurite חזקים. ס מ שהתקבל מן התרבויות db מחנה-שטופלו המורכב סוג תא בודד לבד, DRG נוירון או מקרופאג הצפק, לא להפגין פעילות תוצר neurite. אפשרות זו מציינת כי האינטראקציה בין הנוירונים ו מקרופאגים היא הכרחית עבור ההפעלה של מקרופאגים הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר neurite ס מ. לפיכך, הפרדיגמה תרבות משותפת שלנו גם יהיה מועיל ללמוד איתות המערכת באינטראקציה נוירון-מקרופאג כדי לגרות את המקרופאגים כדי להיות ניחן הפנוטיפ משובי pro.

Introduction

מגוון רחב של מחקרים ניסו לשפר את מערכת העצבים המרכזית האקסון חידוש לאחר הפציעות של חוט השדרה או המוח. תגובות דלקתיות, באופן בלתי נמנע המלווה את הפגיעה במערכת העצבים, נחשבים באופן מסורתי להשתתף משני תהליכים פתולוגיים שמוביל התוצאות המזיקות^1,2. אכן, מתילפרהדניזולון יכול לדיכוי תגובות דלקתיות הוא הטיפול היחיד שאושרו עבור פגיעה בחוט השדרה חריפה³. עם זאת, מחקרים מאוחרים יותר סיפקו ראיות כי מקרופאגים, סוג תאים דלקתיים נציג, יכולים להשתתף התחדשות או תיקון של מערכת העצבים פצועים-^4,-^5,-⁶. לדוגמה, שחדר מקרופאגים בעקבות של עדשה פציעה תוצרת פרו משובי מולקולות רגנרציה של גנגליון נוירונים^7,8. בנוסף, נוירונים DRG המושתלים גדל האקסון הצמיחה את האזור שבו מקרופאגים הופעלו על ידי zymosan⁹. יתר על כן, המקרופאגים באתר הנגע יכול ליצור וחשש צמיחה-מתירני העצבים ההיקפיים נפגעים¹⁰.

העבודה שלנו גם סיפק ראיות חזקות מקרופאגים יכול לתרום הקיבולת של האקסון התחדשות של נוירונים סמוכים. הראינו כי ההפעלה של מקרופאגים, הגרעינים העזוב שורש (DRG) היו חיוניים ביכולת הרגנרציה משופרת של DRG החישה הניריונים בעקבות היקפי preconditioning עצב פציעה¹¹. מחקר דומה נמסר באופן עצמאי מן המעבדה עוד¹². גם הראנו כי הזרקת intraganglionic dibutyryl מחזורי AMP (db-מחנה), אשר הוא מולקולה ידועים כדי לשפר את היכולת של האקסון התחדשות¹³, המושרה את ההפעלה של מקרופאגים. שחרור משרות של מקרופאגים ביטל את ההשפעות של db-מחנה על פעילות תוצר neurite. עבודות עוקבות זיהו פגיעה-induced ביטוי CCL2 בנוירונים בתור אות להמריץ מקרופאגים עם פנוטיפ משובי pro^14,15.

בהתבסס על תוצאות הניסוי הנ ל, הקמנו במבחנה מודל הדומה האירועים המולקולריים המתרחשים DRGs בעקבות preconditioning פגיעה דגם^11,14. במודל זה, db-מחנה מוחל על התרבויות שיתוף נוירון-מקרופאג העלאת המערכת איתות. שמוביל ההפעלה של מקרופאגים עם פנוטיפ משובי pro. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים מפורט שבו אפשרי לייצר המקרופאגים להפריש מולקולרי גורמים קידום neurite תוצר (איור 1). מודל ניסיוני זה ממחיש רעיון כי מקרופאגים יכול להיות מגורה או המושרה לתמוך התחדשות האקסון בעקבות הפציעות למערכת העצבים. המודל שלנו גם יהיה שימושי בלימוד מנגנוני איתות המערכת שמוביל ההפעלה של מקרופאגים משובי pro.

Protocol

כל הניסויים המערבות בעלי חיים אושרו על ידי מוסדיים חיה אכפת ועל שימוש הוועדה של ד אלעג'ו הספר לרפואה של אוניברסיטת.

1. תרבות הכנה של נוירון הפומבית DRG למבוגרים

1. לפני הגדרת התרבות, מעיל מראש צלחת 6-ובכן עם פולי-D-ליזין ו laminin. דגירה צלחת 6-ובכן עם 0.01% פולי-D-ליזין ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים.
2. דגירה לצלחת עם פתרון laminin ריכוז של 3 µg/mL עבור 2 h בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת פעמיים עם מים מזוקקים. יבש את הצלחת בטמפרטורת החדר לפחות לשעה.
3. המתת חסד עכבר בתוך תא₂ ושות שקופה מחובר צילינדר גז דחוס של₂ CO. פצעים וחתכים בעור המכסים את עמוד השדרה עם להב כירורגי ומנתחים את השרירים הבין-חולייתיים דו צדדיים לחשוף את העצמות בחוליות. הסר את העצמות בחוליות בקפידה בעזרת rongeur כירורגית שקצהו צר עד DRGs חשופים לגמרי.
   הערה: נוירונים בוגרים DRGs מתקבלים מן הבוגרים C57BL6 זכר עכברים בגילאי 8 שבועות עד 12 שבועות.
4. הסר את DRGs באופן דו-צדדי ו- S1 כל הדרך עד רמת C1 באמצעות מספריים iridectomy ומלקחיים שקצהו הקנס תחת מיקרוסקופ ויבתר. נסו לחתוך את השורשים וזכר DRGs כדי למזער את הזיהום של תאי שוואן או fibroblasts.
5. אחסן את DRGs גזור 60 מ מ המכיל 5 מ"ל של Dulbecco קר ששינה נשר בינוני (DMEM) על הקרח עד שכל DRGs נאספים צלחת פטרי.
   הערה: חיוני כדי לנתח את DRGs מהר ככל האפשר. לא, האוסף של כל DRGs של עכבר אחד אמור להימשך יותר מ-30 דקות 30 דקות לאחר המתת החסד, לעצור את איסוף של DRGs, להמשיך לשלב הבא, גם אם עדיין נותר DRGs.
6. להעביר את DRGs mL 1.5 צינור גלאים באמצעות טיפ כחול פיפטה (1000 µL) עם קצה ניתוק. הסר את DMEM לאחר סיבוב מהיר למשך מספר שניות בעזרת צנטריפוגה מיני. להוסיף 1 מ"ל של DMEM המכילה 125 U/mL סוג XI collagenase, דגירה הצינור במשך 90 דקות עם סיבוב עדין (35-40 סל ד) בעזרת מטרף טוויסטר ב חממה 37 ° C. לשתק את הצינורית על הרצפה שאכר בעזרת הטייפ.
7. התעלם collagenase המכילים DMEM ולהוסיף 1 מ"ל של DMEM טריים. המתן עד DRGs צף לחלוטין שקעו ולאחר מכן הסר את DMEM עם ההריסות רקמות. חזור על שלב זה כביסה לפחות שש פעמים.
   הערה: אל תנסו למחוק לחלוטין את תגובת שיקוע. יש להיזהר לא להסיר את כל DRGs עם DMEM supernatant.
8. להעביר את DRGs צינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות טיפ כחול פיפטה (1000 µL) עם קצה ניתוק. ואז פיפטה למעלה ולמטה בעדינות לפחות 15 פעמים באמצעות טיפ כחול (1000 µL) כדי להפוך השעיה תא הומוגנית. להימנע מביצוע בועות ולנסות לא תיגע בתחתית של התחתית חרוט עם טיפ פיפטה.
9. Centrifuge את הצינור ב g x 239 למשך 3 דקות וזורקים בקפידה את תגובת שיקוע עם צף פסולת. להוסיף 1 מ"ל של מדיום Neurobasal בתוספת B27 (v 2.0% / v) ו- resuspend בגדר תא על-ידי pipetting בעדינות לאורך 5 כדי 10 פעמים.
10. עוברים התליה תא מסננת תא 70-מיקרומטר בשכבות מעל צינור חרוטי 50 מ. לחכות 2 דקות, ואז לשפוך Neurobasal/B-27 בינוני על גבי מסננת באמצעות בקר פיפטה.
11. צלחת כל שנאספו DRG נוירונים (סך של נוירונים DRG⁶ 2 x 10 משוער של עכבר אחד) על גבי שתי בארות צלחת 6-. טוב. DRG נוירונים של עכבר בוגר אחד מכסה שתי בארות בצלחת 6-. טוב. ואז למקם את הצלחת חממה₂ CO ב 37 ° C עד מקרופאג שיתוף תרבויות.

2. תרבות משותפת של מקרופאגים הצפק rimary P-A תא תרבות הכנס

הערה: להקים התרבויות שיתוף 4 שעות לאחר ציפוי הראשונית של הנוירונים DRG dissociated

1. מקרופאגים הצפק העיקרי מוכנות מן הבוגרים C57BL6 זכר עכברים בגילאי 8 שבועות עד 12 שבועות. המתת חסד חיה בחדר₂ CO. פצעים וחתכים בעור בטן בעדינות, לחשוף את הצפק ולהימנע חיתוך של הצפק כדי למנוע של דליפה של נוזל שטיפה.
2. לנקב את הצפק באמצעות מזרק עם מחט 22 גרם ולהזריק 10 מ"ל של סאלין באגירה פוספט כקרח (PBS) לתוך חלל הצפק. לעסות בעדינות את הצפק למשך 1-2 דקות. לאחר מכן, להוציא את המחט, לסחוט PBS דרך החדירה המחט ולאסוף נוזל שטיפת צינור חרוטי 50 מ.
   הערה: לפני השימוש, יש לשים את המזרק על קרח כדי לשמור על קור, טוב, מגניב.
3. Centrifuge נוזל שטיפת ב 239 g x 10 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה את מרכיבי התא. Resuspend בגדר עם 3 מ"ל של המאגר פירוק תאי הדם האדומים (RBC) למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. ואז centrifuge התליה תא שוב ב 239 g x 10 דקות ב 4 º C. Resuspend בגדר עם 3 מ"ל של PBS, centrifuge התליה תא שוב כדי להסיר את כל מאגר פירוק RBC הנותרים.
   הערה: ודא שהמאגר פירוק RBC מוסר לחלוטין. אחרת מאגר הנותרים של פירוק RBC עשוי להיות רעיל מקרופאגים בתרבית.
4. Resuspend תאי pelleted 1 מ"ל של Neurobasal/B-27 בינוני. צלחת מחצית מקרופאגים שנאספו כל (סך של 3 × 10⁶ על 6 x 10⁶ תאים) על תרבות תא להוסיף עם שטח אפקטיבי של 4.2 ס"מ², אשר תמוקם מעל הבאר של חלופה מועדפת DRG.
   הערה: במהלך תקופת תרבות משותפת, מקרופאגים גדלים Neurobasal/B-27 נוירון תרבות בינוני. הישרדות נאותה של מקרופאגים תחת תנאי זה אושר.

3. טיפול של Db-מחנה ואוסף של מקרופאג ס מ

הערה: להתחיל טיפול db-מחנה 4 שעות לאחר התרבויות שיתוף נוירון-מקרופאג.

1. להוסיף 2 µL של 100 מיקרומטר db-מחנה פתרון התרבויות שיתוף מקרופאג נוירון. להוסיף באותו אמצעי אחסון של PBS עבור ניסוי שליטה.
2. לאחר 24 שעות, למלא טוב ריק של 1 מ"ל של תרבות מקרופאג במדיום באותה צלחת 6-. טוב. להעביר את תותב תרבות תא בתרבויות שיתוף נוירון-מקרופאג הבאר ריקה מקרופאג תרבות בינונית. שמור את התאים תחת התנאי זהה עבור 72 h מבלי לשנות את המדיום.
   הערה: אנו מוסיפים רק 1 מ"ל מקרופאג בינוני תרבות במהלך אוסף ס מ כדי להפוך מרוכז ס מ. במהלך איסוף ס מ, במידת הצורך, הוספנו עוד לכסות לגמרי את המקרופאגים בתוך תותב.
3. לאחר 72 h, centrifuge את מקרופאג ס מ- 239 g x עבור 5 דקות כדי להסיר את מרכיבי התא. עוברים את תגובת שיקוע מסנן 0.2-מיקרומטר כדי להסיר את כל פסולת הסלולר הנותרים. לאחסן את ס"מ שנאספו ב-70 מעלות צלזיוס עד השימוש.

4. תוצר Neurite Assay עם שנאספו ס מ

1. לפני הגדרת תרבות נוירון DRG נפרדות למבוגרים, מראש מעיל של שקופיות הקאמרית 8-ובכן, באותו ההליך המתואר 1.1 ו- 1.2.
2. להשיג הפומבית של נוירונים DRG למבוגרים בינוני Neurobasal בתוספת B27 באותן שיטות תיאר מ 1.3 1.10. צלחת 5 x 10⁴ תאים לכל טוב על גבי השקופית הקאמרית 8-ובכן מצופים מראש.
3. מקום השקופית הקאמרית חממה 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, המאפשר את התאים לצרף התחתון. לאחר מכן, החלף המדיום תרבות ס מ המופשרים זה היא טרופה ב 37 º C.
   הערה: היזהרו לא לגעת בקרקעית של השקופית הקאמרית 8-ובכן בעת הסרת המדיום תרבות, הוספת את ס מ שנאספו.
4. h 15 לאחר ציפוי הראשונית, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם PBS פעם אחת. לאחר מכן, הוסף 200 µL של פתרון paraformaldehyde 4% קר כקרח הבארות ולאחר דגירה התאים עם הפתרון paraformaldehyde עבור 20 דקות ב 4 ° C
   הערה: תרבות נוירון DRG assay תוצר neurite צריך להיות מוגבל בדיוק 15 h. תחת תנאי זה, יש אין תוצר neurite ניכר.
5. לשטוף שלוש פעמים עם PBS קר כקרח ולאחר מכן לבצע חסימת עם 10% סרום עז רגילה (הגדרות) עם 0.1% טריטון-X במשך 30 דקות דגירה התאים קבוע עם נוגדן ראשוני (anti-Tuj-1) הפתרון מדולל עם 10% המיתרים (על ריכוז של µg 1/mL) במשך 4 שעות בחדר טמפרטורה או לילה ב 4 º C.
6. לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולאחר מכן דגירה התאים עם נוגדנים משניים (עז-אנטי עכבר) פתרון 2 h בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף פעמיים עם PBS והר השקופית תרבות עם coverslip (24 × 50 מ"מ) באמצעות הרכבה פתרון.
7. קח תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות להמחיש תוצר neurite.

תוצאות

אנו מתארים פרוטוקול שיכולות לייצר מקרופאגים מסוגל הפרשת גורמים מולקולרית עם פעילות תוצר neurite. מקרופאג ס מ שהתקבל מן התרבויות שיתוף שטופלו db-מחנה הביא תוצר neurite חזקים כאשר חל על תרבות נוירון DRG נפרד (איור 2 א). לשם השוואה, ס מ שהתקבל מן התרבויות שיתוף שטופלו PBS...

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים עבור הדור של מערכת זו תרבות משותפת. זה חשוב להבטיח העכבר DRG נוירונים ו מקרופאגים הצפק מוכנים טרי ובריא. שאנו חווים neurite מופחתת פעילות תוצר של ס מ ניתוח כל DRGs לקח יותר מ 30 דקות. בנוסף, הזיהום של רכיבי הדם מקרופאגים הצפק גם הובילו לירידה של neurite תוצר פעילות ס מ. כדי להפיק נ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size	Corning,Falcon	353090	Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate
70-μm nylon cell strainer	Corning, Falcon	352350
8-well culture slide	Biocoat	354632	with a uniform application of Poly-D-Lysine
Red blood cell lysis buffer	Qiagen	158904
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Gibco	21103-049	Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin
B-27 supplement, serum free	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	extracellular solution
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminin	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
10% Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	16210072
Triton-X-100	Daejung Chemical and Metal Co	8566-4405
Anti β III tubulin (Tuj-1)	Promega Corporation	G7121	Mouse monoclonal antibody
Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
Hemacytometer	Marienfeld-Superior	N/A
Cell culture CO2 incubator	Panasonic	N/A
Dissecting stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi DV4
Twist shaker	FINEPCR	Tw3t
Tabletop centrifuge	Sorvall	N/A
Confocal microscope	Olympus America Inc	IX71
FBS (Fetal Bovine Serum)	VWR International, Hyclone	SH30919.03
Friedman Pearson Rongeurs	FST (Fine Science Tools)	16021-14	Stainless steel, 14cm, curved, single joint action
Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut	FST (Fine Science Tools)	14558-11	sharp, serrated
Dumont #7 Forceps	FST (Fine Science Tools)	11272-30	Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved
Vannas Spring Scissors	FST (Fine Science Tools)	15000-00	straight, 3mm cutting-edge, sharp
Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge	Artisan Technology Group	DW-41	Input Voltage: 115VAC