JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Geçerli protokol neurite çıkıntı teşvik moleküler faktörler serbest bırakmak için kapasite ile donatılmış için kültürlü makrofajlar uyarmak için deneysel yordamları sunar. Nöron-makrofaj ortak kültürler kampa tedavisinde makrofajlar güçlü neurite çıkıntı faaliyet sahip klimalı orta üretmek için neden olmaktadır.

Özet

Makrofajlar rejenerasyon veya onarım yaralı sinir sisteminin katılabilir güçlü kanıtlar var. Burada, bir protokol makrofajlar neurite çıkıntı teşvik şartına üretim ortamına (CM) indüklenir açıklayın. Yetişkin dorsal kök gangliyon (DRG) neurons Akut ayrışmış ve kaplama. Nöronlar stabil ilişik sonra Periton makrofajlar ortak bir hücre kültür eklemek de aynı overlaid kültürlenir. Siklik AMP (db-kampı) için 24 saat, hangi sonra hücre kültürü eklemek makrofajlar içeren ortak kültürler uygulanır Dibutyryl için başka bir şey için 72 h CM toplamak için taşınır. Db-kampıyla ayrı yetişkin DRG nöron kültürü için uygulanan tedavi co kültürlerden CM sağlam neurite yapılan etkinlik sergiler. Tek hücre türü yalnız oluşan db kampı tedavi kültürler elde edilen CM, DRG nöron ya da Periton makrofaj, değil sergi neurite yapılan etkinlik. Bu sinir hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimi makrofajlar moleküler faktörler ile neurite yapılan faaliyet CM içine salgılayan aktivasyonu için vazgeçilmez olduğunu gösterir. Böylece, bizim ortak kültür paradigma da hücreler arası nöron-makrofaj etkileşiminde pro rejeneratif fenotip ile donatılmış makrofajlar uyarmak için sinyal eğitim yararlı olacaktır.

Giriş

Çalışmalar çeşitli beyin ve omurilik yaralanmaları sonra CNS axon rejenerasyon geliştirmeye çalışmışlardır. İnflamatuar reaksiyonları, kaçınılmaz olarak sinir sisteminde yaralanmalar eşlik eden geleneksel olarak ikincil patolojik süreçler için zararlı sonuçlar1,2önde gelen katılmak için tahmin edilmektedir. Nitekim, inflamatuar reaksiyonları önleyebilirsiniz Metilprednizolon tek onaylı tedavisi akut omurilik yaralanması3için olduğunu. Bununla birlikte, daha yeni çalışmalar makrofajlar, temsilcisi inflamatuar hücre tipi, rejenerasyon veya onarım yaralı sinir sistemi4,5,6katılabilir kanıt sağlamış. Örneğin, retina ganglion sinir hücreleri7,8rejenerasyon tanıtmak için bir lens yaralanma üretmek pro rejeneratif molekülleri takip makrofajlar sızmak. Buna ek olarak, transplante DRG nöronlar tarafından zymosan9makrofajlar etkinleştirdiğiniz yere bölge axon büyümesini arttı. Ayrıca, lezyon sitesinde makrofajlar yaralı periferik sinirler10büyüme izin veren bir ortam oluşturabilirsiniz.

Çalışmalarımız da makrofajlar bitişik nöronlar axon yenilenme kapasitesi katkıda bulunabilir güçlü kanıtlar sağlanan. Dorsal kök gangliyon (DRG) makrofajlar aktivasyonu olduğunu göstermiştir DRG gelişmiş yeniden üretim kapasitesini önemli bir periferik Önkoşullanma takip duyusal sinir hücreleri yaralanma11sinir. Benzer araştırma bağımsız olarak başka bir laboratuvar12den bildirildi. Biz de intraganglionic enjeksiyon dibutyryl siklik AMP (db-kampı), akson rejenerasyon13kapasitesini artırmak için iyi bilinen bir molekül olan makrofajlar Etkinleştirme indüklenen gösterdi. Makrofajlar, etkinliğini db-cAMP etkisi neurite çıkıntı etkinliği kaldırıldı. Sonraki eserler yaralanma kaynaklı ifade CCL2 içinde sinir hücreleri makrofajlar pro rejeneratif fenotip14,15ile uyarmak için bir sinyal olarak tespit edilmiştir.

Yukarıdaki deneysel sonuçlarına göre biz bir preconditioning yaralanma modeli11,14takip DRGs oluşan moleküler olaylarını benzeyen bir vitro modeli kurduk. Bu modelde, db-kampı makrofajlar pro rejeneratif fenotip ile aktivasyonu yol açar sinyal hücreler arası alabilme nöron-makrofaj ortak kültürler uygulanır. Burada, biz hangi tarafından biz moleküler faktörler neurite çıkıntı (şekil 1) teşvik salgılar makrofajlar oluşturabilirsiniz detaylı iletişim kuralları açıklar. Bu deneysel model makrofajlar uyarılmış veya yaralanmalar sinir sistemi için aşağıdaki axon rejenerasyon desteklemek için indüklenen bir kavram gösterilmektedir. Modelimiz da pro rejeneratif makrofajlar harekete geçirmek yol açar hücreler arası sinyal içinde mekanizmaları okumak yararlı olacaktır.

Protokol

Tüm deneylerin hayvanlar içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Ajou Üniversitesi Tıp Fakültesi tarafından kabul edildi.

1. Kültür Disosiye yetişkin DRG nöron hazırlanması

  1. Kültürünü ayarlamadan önce Poli-D-lizin ve laminin ile 6-şey plaka önceden kat. Gecede 6-şey plaka ile % 0,01 Poli-D-lizin için 2 h 37 ° C'de veya 4 ° C'de kuluçkaya. Sonra kalenin iki kez distile su ile yıkayın.
  2. Laminin çözüm için oda sıcaklığında 2 h 3 µg/mL bir konsantrasyon ile plaka kuluçkaya ve sonra plaka iki kez distile su ile yıkayın. Plaka, oda sıcaklığında en az 1 h için kuru.
  3. Bir fare odasında sıkıştırılmış CO2 gaz silindir için bağlı bir şeffaf CO2 ötenazi. Vertebral sütunun cerrahi bir bıçakla örten cilt deşmek ve çift taraflı vertebral kemikleri ortaya çıkarmak için paravertebral kasları incelemek. DRGs tamamen maruz kadar titizlikle dar uçlu cerrahi rongeur kullanarak vertebra kemik kaldırın.
    Not: Yetişkin DRGs nöronlar arasında 8 hafta 12 hafta yaşlı yaşlı yetişkin C57BL6 erkek fareler elde edilir.
  4. DRGs çift taraflı S1 ta iridectomy makas ve ince uçlu forseps diseksiyon mikroskop altında kullanarak C1 düzeyine kadar kaldırın. Schwann hücreleri veya fibroblastlar kirlenme en aza indirmek için tamamen DRGs kökleri tutmaya çalıştı.
  5. Disseke DRGs 60 mm Petri kabına 5 mL, soğuk Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) buz üzerinde tüm kadar DRGs toplanan içeren saklayın.
    Not: DRGs en kısa zamanda incelemek için önemlidir. Bir fareden tüm DRGs toplanması gerektiğini sonra ötenazi 30 dk. 30 dk uzun sürer, DRGs toplamayı durdurmak ve orada hala kalan DRGs bile sonraki adıma geçin.
  6. DRGs 1.5 mL mavi pipet ucu (1000 µL) kesme uç ile kullanarak Eppendorf tüp aktarın. DMEM birkaç saniye mini santrifüj kullanarak hızlı bir tur sonra kaldırın. 125 U/mL türü XI collagenase içeren DMEM 1 mL ekleyin ve bir kasırga shaker 37 ° C kuluçka kullanarak tüp nazik döndürme (35-40 d/d) 90 dk için kuluçkaya. Bant kullanarak shaker katta tüp hareketsiz.
  7. Collagenase-DMEM içeren atın ve 1 mL taze DMEM ekleyin. Kayan DRGs tamamen altına lavabo ve sonra DMEM ile doku enkaz kaldırmak kadar bekleyin. Bu çamaşır en az altı kez tekrarlayın.
    Not: tamamen süpernatant atmak çalışmayın. Herhangi bir DRGs süpernatant DMEM ile değil çıkarmak için dikkatli olun.
  8. DRGs 15 mL konik tüp kesme son ile mavi pipet ucu (1000 µL) kullanarak aktarın. Sonra yukarı ve aşağı yavaşça pipet homojen hücre süspansiyon yapmak için mavi ucu (1000 µL) en az 15 kere kullanarak. Kabarcıklar yapmaktan kaçınmak ve alt kısmında bir pipet ucu konik boru dokunmak deneyin.
  9. Tüp vasıl 239 x g 3 dk santrifüj kapasitesi ve dikkatli bir şekilde enkaz yüzen ile süpernatant atın. 1 mL Neurobasal orta B27 ile desteklenmiş ekleyin (%2.0 v/v) ve hücre Pelet yavaşça yukarı ve aşağı 5-10 kez pipetting tarafından resuspend.
  10. Hücre süspansiyon 50 mL konik tüp üstüne overlaid bir 70 µm hücre süzgeç geçişi. İçin 2 dk bekleyin ve sonra Neurobasal/B-27 orta bir pipet denetleyicisi kullanarak süzgeç üzerine dökün.
  11. Tüm toplanan DRG (yaklaşık 2 x 106 DRG neurons bir fare toplam) iki kuyu 6-şey plaka üzerine nöronlar plaka. Bir yetişkin fare neurons DRG iki kuyu bir 6-şey plaka kapak. Makrofaj ortak kültürlerin kadar 37 ° C'de CO2 kuluçka sonra plaka koyun.

2. ortak kültür P birincil Periton makrofajlar A hücre kültür Ekle-Tarih

Not: ortak kültürler 4 h sonra Disosiye DRG nöronların kaplama ilk kurmak.

  1. Birincil Periton makrofajlar yetişkin C57BL6 erkek fareler 12 haftalık 8 hafta arasında yaş üzerinden hazırlanır. Bir hayvan CO2 odasında ötenazi. Karın deri ince deşmek, karın zarını açığa ve Periton lavaj sıvı kaçağı önlemek için kesme önlemek.
  2. 22 G iğne ile kullanarak karın zarını ponksiyon ve Periton boşluğuna buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) 10 mL enjekte. Yavaşça karın zarını 1-2 min için masaj. Daha sonra iğne çekin ve PBS iğne ponksiyon sitesi aracılığıyla dışarı sıkmak ve 50 mL konik tüp lavaj sıvı toplamak.
    Not: kullanmadan önce şırınga PBS soğuğunu korumak için buza koy.
  3. Lavaj sıvı vasıl 239 x g 4 ° C'de hücresel bileşenleri cips için 10 dk santrifüj kapasitesi. Pelet kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek 3 dk 3 mL ile oda sıcaklığında resuspend. Hücre süspansiyon tekrar vasıl 239 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Pelet PBS 3 mL ile resuspend ve tekrar kalan herhangi bir RBC lizis arabellek kaldırmak için hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
    Not: RBC lizis arabellek tamamen çıkarıldığından emin olun. Aksi takdirde geri kalan RBC lizis arabellek kültürlü makrofajlar toksik olabilir.
  4. Neurobasal/B-27 orta 1 mL pelleted hücrelerde resuspend. Plaka tüm toplanan makrofajlar (3 × 106 6 x 106 hücrelere toplam) bir hücre kültürü üzerinde yarısı olan 4.2 cm2Disosiye DRG kuyunun üzerine yerleştirilir, etkili alan ekleyin.
    Not: ortak kültür döneminde makrofajlar Neurobasal/B-27 nöron kültür ortamında yetiştirilmektedir. Yeterli makrofajlar bu koşul altında yaşama doğrulandı.

3. tedavi Db-kamp ve makrofaj CM topluluğu

Not: db-kampı tedaviye 4 h nöron-makrofaj ortak kültürler sonra başlayın.

  1. 100 µM db-kampı çözüm 2 µL nöron-makrofaj ortak kültürler için ekleyin. PBS aynı birim denetim deney için ekleyin.
  2. 24 saat sonra boş bir şey aynı 6-şey plaka makrofaj kültür ortamının 1 mL ile doldurun. Nöron-makrofaj ortak kültürler hücre kültür INSERT boş kuyunun makrofaj kültür orta ile aktarın. 72 h için aynı koşul altında hücreler orta değiştirmeden tutmak.
    Not: Sadece 1 mL makrofaj kültür orta yapmak için CM toplama sırasında CM konsantre ekleyin. CM toplama sırasında gerekirse, biz tamamen makrofajlar eklemek içinde karşılamak için daha fazla ekledi.
  3. 72 saat sonra santrifüj kapasitesi vasıl 239 x g hücresel bileşenleri kaldırmak 5 min için makrofaj CM. Süpernatant kalan herhangi bir hücresel enkaz kaldırmak için 0.2 µm filtreden geçmek. -70 ° C'de toplanan CM kullanmak kadar saklamak.

4. Neurite yapılan tahlil ile toplanan CM

  1. Bir ayrı yetişkin DRG nöron kültürünü ayarlamadan önce 1.1 ve 1.2 açıklanan yordamın aynısını takip bir 8-şey odası slayt önceden kat.
  2. Neurobasal orta B27 ile desteklenmiş Disosiye yetişkin DRG nöronlarda elde 1.3 1,10 için açıklanan aynı yöntemleri kullanarak. Peki önceden kaplanmış 8-şey odası slayda başına 5 x 104 hücre plaka.
  3. Yer altına eklemek hücre izin için 2 h, 37 ° C kuluçka odası slayt. O zaman, 37 ° C'de ısıtılmış çözdürülen CM kültür orta yerine
    Not: 8-şey odası slayt alt kültür orta kaldırırken dokunmak dikkatli olun ve toplanan CM ekleme.
  4. ilk kaplama sonra 15 h orta kaldırmak ve PBS hücrelerle bir kez yıkayın. Daha sonra buz gibi %4 paraformaldehyde çözüm 200 µL wells için ekleyin ve 4 ° C'de 20 dk paraformaldehyde üçün hücrelerle kuluçkaya
    Not: DRG nöron kültürü neurite yapılan tahlil için 15 h ile tam olarak verilmelidir. Bu durum altında hiçbir kayda değer neurite çıkıntı vardır.
  5. Buz gibi PBS ile üç kez yıkayın ve % 10 ile engelleme gerçekleştirin normal keçi serum (NGS) % 0.1 ile Triton-X 30 dakika süreyle kuluçkaya sabit hücrelerin % 10 ile seyreltilmiş birincil antikoru (anti-Tuj-1) çözüm ile (adlı bir konsantrasyon 1 µg/ml) NGS Oda 4 h için Sıcaklık veya gecede 4 ° C'de
  6. Üç kez PBS ile yıkama ve oda sıcaklığında 2 h için ikincil antikor (keçi-anti fare) çözüm hücrelerle kuluçkaya. Sonra iki kez PBS ile yıkama ve kültür slayt montaj çözümü kullanarak bir coverslip (24 × 50 mm) ile monte.
  7. Neurite çıkıntı görselleştirmek için bir floresan mikroskop kullanarak görüntü alabilir.

Sonuçlar

Biz makrofajlar neurite çıkıntı aktivitesiyle moleküler faktörler salgılayan yeteneğine sahip-ebilmek oluşturmak bir protokol tanımlamak. Makrofaj CM db-kamp ile tedavi ortak kültürler elde edilen ayrı bir DRG nöron kültürü (şekil 2A) uygulandığında sağlam neurite çıkıntı sonuçlandı. Buna karşılık, PBS tedavi ortak kültürler elde CM neurite çıkıntı bizim 15-h kültür süresi (şekil 2B) neden...

Tartışmalar

Bu ortak kültür sistemi oluşturmak için çeşitli kritik adımlar vardır. Fare DRG neurons ve Periton makrofajlar taze hazır sağlamak önemli ve sağlıklı. Tüm DRGs diseksiyon daha--dan 30 dk aldığında azalmış neurite yapılan etkinlik cm yaşadım. Buna ek olarak, Periton makrofajlar bileşenlerinde kan kirlenme de CM neurite çıkıntı etkinliği azalmaya yol açtı. Sağlam nöron-makrofaj etkileşim db-kamp tarafından temin için kapsamlı yıkama Ayrıca doku enkaz tümüyle kaldırılmasını ve si...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu iletişim kuralı bir hibe NMG-2015R1A2A1A01003410 Bilim Bakanlığı, ICT ve gelecek planlama, Kore Cumhuriyeti tarafından desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore sizeCorning,Falcon353090Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate
70-μm nylon cell strainerCorning, Falcon352350
8-well culture slideBiocoat354632with a uniform application of Poly-D-Lysine
Red blood cell lysis bufferQiagen158904
Collagenase from Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9407-100MG
Neurobasal mediumThermo Fisher Scientific, Gibco21103-049Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin
B-27 supplement, serum freeThermo Fisher Scientific, Gibco17504-044extracellular solution
GlutamaxThermo Fisher Scientific, Gibco35050-061
Penicillin-streptomycinThermo Fisher Scientific, Gibco15140-122
Poly-D-lysine HydrobromideSigma-AldrichP6407-5MG
LamininThermo Fisher Scientific, Invitrogen23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium saltMerck Millipore Corporation, Calbiochem28745
10% Normal Goat SerumThermo Fisher Scientific16210072
Triton-X-100Daejung Chemical and Metal Co8566-4405
Anti β III tubulin (Tuj-1)Promega CorporationG7121Mouse monoclonal antibody
Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibodyThermo Fisher Scientific, InvitrogenA11005
HemacytometerMarienfeld-SuperiorN/A
Cell culture CO2 incubatorPanasonicN/A
Dissecting stereomicroscopeCarl ZeissStemi DV4
Twist shakerFINEPCRTw3t
Tabletop centrifugeSorvallN/A
Confocal microscopeOlympus America IncIX71
FBS (Fetal Bovine Serum)VWR International, HycloneSH30919.03
Friedman Pearson RongeursFST (Fine Science Tools)16021-14Stainless steel, 14cm, curved, single joint action
Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCutFST (Fine Science Tools)14558-11sharp, serrated
Dumont #7 ForcepsFST (Fine Science Tools)11272-30Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved
Vannas Spring ScissorsFST (Fine Science Tools)15000-00straight, 3mm cutting-edge, sharp
Qualitron DW-41 Micro-CentrifugeArtisan Technology GroupDW-41Input Voltage: 115VAC

Referanslar

  1. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
  2. Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
  3. Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
  4. Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
  5. DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
  6. Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
  7. Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
  8. Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
  9. Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
  10. Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
  11. Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
  12. Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
  13. Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
  14. Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
  15. Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
  16. Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
  17. Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
  18. Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 133makrofajdorsal k k gangliyon n ronortak k lt rakson rejenerasyonn ron makrofaj etkile imsiklik AMPyaralanma Merkezi Klima

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır