Нейрон макрофагального Сопредседатель культур для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с Neurite результатом деятельности

Резюме

Текущий протокол представляет экспериментальные процедуры для стимулирования культивировали макрофаги быть наделен способность освободить молекулярные факторы, которые способствуют neurite нарост. Лечение лагеря нейрон макрофагального Сопредседатель культур индуцирует макрофаги производить кондиционером среда, которая обладает сильным neurite результатом деятельности.

Аннотация

Существует убедительные доказательства того, что макрофаги могут участвовать в регенерации или ремонт пострадавшего нервной системы. Здесь мы описываем протокол, в котором макрофаги вынуждены производят кондиционером среднего (см), что способствует neurite нарост. Взрослый Спинной корень нейроны ганглии (DRG) остро в отрыве и покрытием. После того, как нейроны стабильно прикреплены, перитонеальных макрофагов совместно культивируемых на вставке культуры клеток, накладывается на то же хорошо. Иммунобиологический циклических AMP (db лагерь) применяется для совместного культур за 24 ч, после чего содержащий макрофаги вставить культуры клеток перемещается в другой хорошо для сбора см за 72 ч. СМ от совместного культур, относились с db лагерь, когда применяется к культуре, нейрон отдельный взрослый DRG, экспонаты надежные neurite результатом деятельности. СМ, полученные из db лагерь лечение культур, состоящий из одной ячейки типа только, DRG нейрон или перитонеальных макрофагов, не проявляют neurite активность нарост. Это означает, что взаимодействия между нейронами и макрофагами незаменима для активации макрофагов, секретирующих молекулярные факторы с neurite результатом деятельности см. Таким образом наш парадигмы сотрудничества культуры также будет полезным для изучения межклеточной сигнализации в нейрон макрофагального взаимодействия стимулировать макрофаги быть наделен про восстановительной фенотип.

Введение

Целый ряд исследований стремились к повышению регенерации аксона ЦНС после травмы спинного или головного мозга. Воспалительные реакции, неизбежно сопутствующих травм нервной системы, традиционно считаются участвовать в вторичной патологических процессов, ведущих к пагубным результатам^1,2. Действительно метилпреднизолон, который может подавить воспалительные реакции является только утвержденные терапия острого спинного мозга травмы³. Однако более поздние исследования представили доказательства того, что макрофаги, представитель воспалительных клеток типа, могут участвовать в регенерации или ремонт пострадавшего нервной системы^4,5,6. Например проникнув макрофаги после про восстановительной молекул объектив травмы производят регенерации сетчатки ганглия нейронов^7,8. Кроме того пересаженные нейроны DRG увеличение роста аксона до региона, где были активированы макрофаги, zymosan⁹. Кроме того макрофаги в месте поражения можно создать роста разрешительной окружение для¹⁰раненых периферических нервов.

Наша работа также представил сильные доказательства того, что макрофаги могут способствовать способности регенерации аксона в соседних нейронов. Мы показали, что активация макрофагов в спинной корень ганглиев (DRG) были в расширенной регенеративной способностью DRG сенсорных нейронов после предварительной подготовки периферической нерв травмы¹¹. Подобные исследования сообщили независимо от другой лаборатории¹². Мы также показали, что intraganglionic инъекции иммунобиологический ЦАМФ (db лагерь), который является известным молекулы для повышения способности регенерации аксона¹³, индуцированной активации макрофагов. Деактивация макрофаги отменил эффекты db лагерь на neurite нарост активность. Последующие работы определены травмы индуцированной выражение CCL2 в нейронах как сигнал для стимулирования макрофагов с про восстановительной фенотип^14,15.

На основании выше экспериментальные результаты, мы создали модель в пробирке , напоминающие молекулярные события, которые происходят в ДРГ после предварительной травмы модель^11,14. В этой модели db лагерь применяется к нейрон макрофагального Сопредседатель культур, вызывая межклеточной сигнализации, что приводит к активации макрофагов с про восстановительной фенотип. Здесь мы описываем подробные протоколы, по которым мы можем генерировать макрофаги, которые выделяют молекулярные факторы, содействующие нарост neurite (рис. 1). Эта экспериментальная модель иллюстрирует концепцию, что макрофаги могут быть стимулировали или индуцированной поддержать регенерации аксона после травмы нервной системы. Наша модель будет также полезно в изучении механизмов в межклеточной сигнализации, что приводит к активации про восстановительной макрофагов.

протокол

Все эксперименты с участием животных были одобрены институциональные животное уход и использование Комитета из АДЖУ школы медицины университета.

1. Культура подготовка диссоциированных взрослых DRG нейрона

1. Перед настройкой культуры, предварительно Покройте 6-ну пластины с поли D-лизин и Ламинин. Инкубируйте 6-ну плита с 0,01% поли D-лизин при 37° C на 2 ч или при температуре 4° C на ночь. Затем промойте пластины дважды с дистиллированной водой.
2. Инкубировать пластины с Ламинин решения в концентрации 3 мкг/мл в течение 2 ч при комнатной температуре, а затем вымыть пластину дважды с дистиллированной водой. Сухие пластины при комнатной температуре по крайней мере за 1 час.
3. Усыпить мышь в прозрачной CO₂ камеры подключены к сжатого баллончика CO₂ . Надрезать кожу вышележащих позвоночника с хирургическое лезвие и вскрыть паравертебральные мышцы на двусторонней основе подвергать позвоночной кости. Удаление позвоночных костей, тщательно с использованием УЗК накренилась хирургического rongeur до тех пор, пока полностью подвергаются ГДК.
   Примечание: Взрослый ДРГ нейронов получаются из взрослых C57BL6 мышей-самцов в возрасте 8 недель до 12 недель.
4. Удалите ДРГ на двусторонней основе с S1 до уровня C1, используя ножницы иридэктомия и штраф наконечником щипцы под микроскопом рассечения. Попробуйте вырезать корни полностью от ГДК для того, чтобы свести к минимуму загрязнение Шванновские клетки или фибробластов.
5. Храните расчлененных ДРГ в 60 мм Петри, содержащий 5 мл из холодной Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) на льду пока все собранные ГДК.
   Примечание: Очень важно как можно быстрее вскрыть ГДК. Коллекция всех КЗГ из одной мыши не следует занять больше чем 30 min. 30 мин после эвтаназии, остановить сбор ДРГ и переходите к следующему шагу, даже если все еще оставшиеся ГДК.
6. Передать ДРГ 1,5 мл трубки Эппендорф, используя кончик синей пипетки (1000 мкл) с концом отключения. Удаление DMEM после быстрого спин на несколько секунд, с использованием Мини центрифуги. Добавьте 1 mL DMEM, содержащих 125 ед/мл тип XI коллагеназы и инкубировать трубки для 90 мин с нежным вращения (35-40 мин) с помощью шейкера Торнадо в инкубаторе 37 ° C. Иммобилизации трубку на этаже шейкер, с помощью ленты.
7. Отменить коллагеназы содержащих DMEM и добавьте 1 mL свежих DMEM. Подождите, пока Плавающая ДРГ полностью опуститься на дно, а затем удалить DMEM с мусором ткани. Повторите этот шаг стирки по крайней мере шесть раз.
   Примечание: Не пытайтесь удалить супернатант полностью. Будьте осторожны, чтобы не удалить любой ДРГ с супернатанта DMEM.
8. Передать ДРГ 15 мл Конические трубки, используя кончик синей пипетки (1000 мкл) с концом отключения. Затем аккуратно Пипетка вверх и вниз по крайней мере 15 раз используя кончик синей (1000 мкл) чтобы сделать суспензию однородных клеток. Избежать пузырей и старайтесь не касаться нижней конической трубки с кончиком пипетки.
9. Центрифуга трубки на 239 x g 3 мин и тщательно удалить супернатант с плавающей мусора. Добавьте 1 mL Neurobasal среды, дополнена B27 (2,0% v/v) и Ресуспензируйте клетки Пелле, мягко закупорить вверх и вниз 5-10 раз.
10. Передайте суспензию клеток через стрейнер ячейки 70 мкм, накладывается на верхней части 50 мл Конические трубки. Подождите 2 минуты, а затем налить среднего Neurobasal/B-27 на сито с помощью пипетки контроллера.
11. Пластина все собранные DRG нейронов (в общей сложности приблизительно 2 x 10⁶ DRG нейронов из одной мыши) на двух скважинах 6-ну пластины. DRG нейроны от одной взрослой мыши охватывают две скважины в пластине 6-хорошо. Затем поместите пластины в инкубатор CO₂ при 37 ° C, до тех пор, пока макрофага совместно культур.

2. Сопредседатель культура P rimary перитонеальных макрофагов на культуры клеток вставить

Примечание: Установить совместно культур 4 h после первоначального покрытия диссоциированных нейронов DRG

1. Основная перитонеальных макрофагов готовятся из взрослых C57BL6 мышей-самцов в возрасте 8 недель до 12 недель. Усыпить животных в камере CO₂ . Деликатно надрезать кожу живота, разоблачить брюшины и Избегайте резки брюшины во избежание утечки жидкости промывания.
2. Прокол брюшины, с помощью шприца с иглой 22G и залить 10 мл ледяной фосфат амортизированное Салин (PBS) в брюшной полости. Мягко массаж брюшины для 1-2 мин. Затем вытащить иглу и выдавить PBS через сайт прокола иглой и собирать жидкость лаважа в 50 мл Конические трубки.
   Примечание: Перед использованием, положил шприц на льду для поддержания холодность PBS.
3. Центрифуга промывание жидкости в 239 x g 10 мин при 4 ° C для пеллет клеточных компонентов. Ресуспензируйте лепешка с 3 мл буфера lysis эритроцитов (РБК) 3 мин при комнатной температуре. Затем центрифуга суспензию клеток снова на 239 x g 10 мин при 4 ° C. Ресуспензируйте лепешка с 3 мл PBS и центрифуги суспензию клеток снова, чтобы удалить любые оставшиеся буфера lysis РБК.
   Примечание: Убедитесь, что РБК литического буфера удаляется полностью. В противном случае оставшиеся буфера lysis РБК могут быть токсичными для искусственного макрофаги.
4. Ресуспензируйте гранулированных клеток в 1 мл Neurobasal/B-27 среды. Плита, половина всех собранных макрофагов (в общей сложности 3 × 10⁶ -6 х 10⁶ клеток) на культуре клеток вставить с эффективной площадью 4,2 см², который находится на вершине хорошо диссоциированных DRG.
   Примечание: В период совместного культуры, макрофаги, выращенных в Neurobasal/B-27 нейрон питательной среды. Адекватные выживания макрофагов под это условие было подтверждено.

3. Лечение Db лагерь и сбор макрофагов см

Примечание: Начало лечения 4 h db лагерь после совместного культур нейрон макрофагов.

1. Добавьте 2 мкл раствора 100 мкм db лагерь в нейрон макрофагального Сопредседатель культур. Добавьте такой же объем PBS для управления эксперимента.
2. После 24 часов Заполните пустой колодец с 1 мл питательной среды макрофагов в пластину же 6-хорошо. Вставка культуры клеток в нейрон макрофагального Сопредседатель культур передать пустой колодец с макрофагов питательной среды. Держите клетки при том же условии за 72 ч без изменения среды.
   Примечание: Мы добавляем только 1 мл макрофагов питательной среды во время сбора см сделать сосредоточены см. Во время сбора см при необходимости, мы добавили больше, чтобы полностью покрыть макрофаги в insert.
3. После 72 ч центрифуга макрофага см на 239 x g 5 мин для удаления клеточных компонентов. Супернатант проходят через 0,2 мкм фильтр, чтобы удалить любые оставшиеся сотовой мусора. Храните собранные см-70 ° c до использования.

4. Neurite нарост Assay с собранных см

1. Прежде чем настраивать отдельный взрослый DRG нейрон культуры, предварительно покройте слайд 8-Ну палата следуя той же процедуре, описанной в 1.1 и 1.2.
2. Получения диссоциированных взрослых DRG нейронов в Neurobasal среде с B27 используя те же методы, описанные от 1,3 до 1,10. Клемная 5 x 10⁴ клетки на хорошо на предварительно покрытых камеры 8-Ну слайд.
3. Место в камере слайд инкубатора 37 ° C 2 h, позволяя клетки, чтобы прикрепить к нижней. Затем замените питательной среды с талой см, который подогревается в 37 ° C.
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы не прикасайтесь к нижней части камеры 8-Ну слайд при удалении питательной среды и добавление собранных см.
4. 15 ч после первоначального покрытия, удалите среды и вымыть клетки с PBS раз. Затем добавьте 200 мкл раствора ледяной параформальдегида 4% к скважинам и инкубировать клетки с параформальдегида решение для 20 минут при температуре 4 ° C
   Примечание: DRG нейрон культуры для neurite нарост assay должна ограничиваться именно 15 h. При этом условии существует без заметных neurite нарост.
5. Вымойте три раза с ледяной PBS и затем выполнить блокирование с 10% нормальной козьего сыворотки (НГС) с 0.1% тритон-X на 30 мин инкубировать фиксированные ячейки с основного антитела (анти Tuj-1) раствор, разбавленный с 10% NGS (в концентрации 1 мкг/мл) за 4 ч в номер температуре или на ночь при 4 ° C.
6. Вымойте три раза с PBS и затем инкубации клеток с вторичное антитело (коза анти мышь) решение для 2 ч при комнатной температуре. Затем мыть дважды с PBS и смонтировать культуры слайд с coverslip (24 × 50 мм) с помощью установки решения.
7. Возьмите изображения с помощью микроскопа флуоресценции для визуализации neurite нарост.

Результаты

Мы описываем протокол, который может генерировать Макрофаги способны секреции молекулярные факторы с neurite результатом деятельности. Макрофага см, полученные из совместного культур, относились с db лагерь в результате нарост надежные neurite при применении к отдельной ку?...

Обсуждение

Существует несколько важных шагов для создания этой системы совместного культуры. Это важно обеспечить что мыши DRG нейронов и перитонеальные макрофаги готовятся свежие и здоровые. Мы испытали снижение neurite активности нарост см, когда вскрытие всех ДРГ приняла более 30 мин. Кроме того за?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size	Corning,Falcon	353090	Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate
70-μm nylon cell strainer	Corning, Falcon	352350
8-well culture slide	Biocoat	354632	with a uniform application of Poly-D-Lysine
Red blood cell lysis buffer	Qiagen	158904
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Gibco	21103-049	Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin
B-27 supplement, serum free	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	extracellular solution
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminin	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
10% Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	16210072
Triton-X-100	Daejung Chemical and Metal Co	8566-4405
Anti β III tubulin (Tuj-1)	Promega Corporation	G7121	Mouse monoclonal antibody
Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
Hemacytometer	Marienfeld-Superior	N/A
Cell culture CO2 incubator	Panasonic	N/A
Dissecting stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi DV4
Twist shaker	FINEPCR	Tw3t
Tabletop centrifuge	Sorvall	N/A
Confocal microscope	Olympus America Inc	IX71
FBS (Fetal Bovine Serum)	VWR International, Hyclone	SH30919.03
Friedman Pearson Rongeurs	FST (Fine Science Tools)	16021-14	Stainless steel, 14cm, curved, single joint action
Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut	FST (Fine Science Tools)	14558-11	sharp, serrated
Dumont #7 Forceps	FST (Fine Science Tools)	11272-30	Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved
Vannas Spring Scissors	FST (Fine Science Tools)	15000-00	straight, 3mm cutting-edge, sharp
Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge	Artisan Technology Group	DW-41	Input Voltage: 115VAC