Neurone-Macrophage co-cultures d’activer les Macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec l’activité des neurites

Résumé

Le protocole actuel présente des procédures expérimentales afin de stimuler les macrophages à être doté d’une capacité de libérer les facteurs moléculaires qui favorisent la croissance des neurites. Traitement du cAMP aux cultures neuron-macrophage co induit les macrophages pour produire un milieu conditionné qui possède une activité l’excroissance des neurites forte.

Résumé

Il y a des preuves solides que les macrophages peuvent participer à la régénération ou la réparation des blessés du système nerveux. Nous décrivons ici un protocole dans lequel les macrophages sont induites au moyen de produits conditionnés (CM) qui favorise la croissance des neurites. Neurones ganglionnaires (DRG) adulte de la racine dorsale sont parfaitement dissociées et plaqués. Après que les neurones sont solidement attachés, les macrophages péritonéaux sont conjointement cultivées sur un insert de culture cellulaire superposé sur le même bien. Dibutyryl QU'AMP cyclique (AMPc-db) est appliquée aux cultures co pendant 24 h, après quoi la culture cellulaire insert contenant les macrophages est déplacé vers un autre puits pour recueillir des CM pendant 72 h. Le CM des cultures co traités avec db-cAMP, lorsqu’il est appliqué à une culture de neurone DRG adulte séparée, présente une activité l’excroissance des neurites robuste. Le CM obtenu à partir des cultures traitées db-cAMP constitué de cellules du même type seul, neurone DRG ou macrophages péritonéaux, ne montrent pas d’activité de l’excroissance des neurites. Cela indique que l’interaction entre les neurones et les macrophages est indispensable pour l’activation des macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires avec activité l’excroissance des neurites en CM. Ainsi, notre paradigme de co-culture sera aussi utile pour étudier la signalisation intercellulaire dans les interactions neurone-macrophage pour stimuler les macrophages à être doté d’un phénotype pro-régénérative.

Introduction

Diverses études ont cherché à améliorer la régénération axonale CNS après les blessures de la moelle épinière ou du cerveau. Des réactions inflammatoires, inévitablement accompagnant les lésions du système nerveux, sont traditionnellement perçues comme de participer à des processus pathologiques secondaires menant à des résultats néfastes^1,2. En effet, la méthylprednisolone qui peut supprimer les réactions inflammatoires est le seul traitement approuvé pour médullaires graves blessures³. Toutefois, des études plus récentes ont fourni des preuves que les macrophages, un type de cellules inflammatoires représentative, peuvent participer à la régénération ou la réparation du système nerveux lésé^4,5,6. Par exemple, infiltration de macrophages suite à une lentille blessure produits pro-régénérative des molécules pour favoriser la régénération des neurones ganglionnaires rétiniennes^7,8. En outre, les neurones transplantés de DRG a augmenté la croissance axonale jusqu'à la région où les macrophages activés par zymosan⁹. En outre, les macrophages à l’emplacement de la lésion peuvent créer un milieu de croissance-permissive pour les nerfs périphériques blessé¹⁰.

Notre travail a également fourni des preuves solides que les macrophages peuvent contribuer à la capacité de régénération des axones des neurones adjacents. Nous avons montré que l’activation des macrophages dans les ganglions de la racine dorsale (GRD) ont été essentiels dans la capacité de régénération améliorée des DRG neurones sensoriels, suite à un périphérique de préconditionnement nerf blessures¹¹. Un autre laboratoire¹²a été signalée indépendamment des recherches similaires. Nous avons également montré que l’injection intraganglionic de dibutyryl AMP cyclique (AMPc-db), qui est une molécule connue pour renforcer la capacité de régénération axonale¹³, induit l’activation des macrophages. La désactivation des macrophages aboli les effets du db-cAMP sur l’activité de l’excroissance des neurites. Les œuvres ultérieures identifiées expression induite par la blessure de CCL2 dans les neurones comme un signal pour stimuler des macrophages avec un phénotype pro-régénérative^14,15.

Basé sur les résultats expérimentaux ci-dessus, nous avons établi un modèle in vitro ressemblant à des événements moléculaires qui interviennent dans les DRGs suite à une blessure préconditionnement modèle^11,14. Dans ce modèle, db-cAMP est appliquée aux cultures neuron-macrophage co suscitant intercellulaires de signalisation qui aboutit à l’activation des macrophages avec un phénotype pro-régénérative. Nous décrivons ici les protocoles détaillés par lequel nous pouvons produire des macrophages qui sécrètent des facteurs moléculaires qui favorisent la croissance neuritique (Figure 1). Ce modèle expérimental illustre un concept que macrophages peuvent être stimulées ou amenés à soutenir la régénération axonale après les blessures du système nerveux. Notre modèle sera également utile dans l’étude des mécanismes de signalisation intercellulaire qui aboutit à l’activation des macrophages pro-régénérative.

Protocole

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par l’utilisation Comité d’Ajou University School of Medicine et un animalier institutionnel.

1. culture préparation du neurone dissociés DRG adulte

1. Avant la mise en place de la culture, préalablement recouvrir une plaque 6 puits poly-D-lysine et de la laminine. Incuber une plaque 6 puits avec 0,01 % poly-D-lysine à 37° C pendant 2 h ou à 4° C jusqu’au lendemain. Ensuite, laver la plaque deux fois avec de l’eau distillée.
2. Incuber la plaque avec la laminine solution à une concentration de 3 µg/mL pendant 2 h à température ambiante et laver la plaque deux fois avec de l’eau distillée. Sécher la plaque à température ambiante pendant au moins 1 h.
3. Euthanasier une souris dans une chambre de₂ CO transparente reliée à une bouteille de gaz comprimée CO₂ . Inciser la peau recouvrant la colonne vertébrale avec une lame chirurgicale et disséquer les muscles paravertébraux bilatéralement pour exposer l’OS vertébrales. Enlever les os vertébrales méticuleusement à l’aide un rongeur chirurgical de pointe étroite jusqu'à ce que les GHM est entièrement exposés.
   NOTE : Les neurones adultes DRGs proviennent des souris mâles C57BL6 adultes âgés de 8 semaines à 12 semaines.
4. Retirer les DRGs bilatéral de la S1 tout le chemin jusqu’au niveau de la C1 à l’aide de ciseaux iridectomie et pinces à pointe fine sous un microscope à dissection. Essayez de couper les racines entièrement à partir de DRGs afin de minimiser la contamination des cellules de Schwann ou les fibroblastes.
5. Stocker les DRGs découpées dans une boîte de Pétri contenant 5 mL de Dulbecco froid modifié Eagle (DMEM) sur la glace jusqu'à ce que tous les GHM est collectés de 60 mm.
   Remarque : Il est essentiel de disséquer les DRGs aussi rapidement que possible. La collection des tous les GHM de souris ne devrait pas prendre plue de 30 min. 30 min après l’euthanasie, cesser de collecter les DRGs et procéder à l’étape suivante, même si il sont en restant DRGs.
6. Transférer les DRGs à un 1,5 mL tube Eppendorf à l’aide d’un embout de la pipette bleu (1000 µL) avec une extrémité de la ligne de coupure. Enlever le DMEM après un essorage rapide pendant plusieurs secondes en utilisant une centrifugeuse minie. Ajouter 1 mL de DMEM contenant 125 collagénase de XI de type U/mL et incuber le tube pendant 90 min avec une légère rotation (35-40 tr/min) à l’aide d’un agitateur twister dans un incubateur à 37 ° C. Immobiliser le tube sur le plancher de l’agitateur à l’aide de la bande.
7. Jetez DMEM contenant collagénase et ajouter 1 mL de DMEM fraîche. Attendez que les DRGs flottants s’enfoncer complètement vers le bas, puis retirez le DMEM avec les débris tissulaires. Répétez cette étape de lavage au moins six fois.
   Remarque : Ne pas tenter d’éliminer le liquide surnageant complètement. Veillez à ne pas supprimer n’importe quel DRGs avec le surnageant DMEM.
8. Transférer les DRGs dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’un embout de la pipette bleu (1000 µL) avec une extrémité de la ligne de coupure. Pipetter puis monte et descend doucement au moins 15 fois à l’aide d’une pointe de bleue (1000 µL) pour produire une suspension cellulaire homogène. Éviter de faire des bulles et essayez de ne pas toucher le fond du tube à fond conique avec un embout de la pipette.
9. Centrifuger le tube à 239 x g pendant 3 min et éliminer délicatement le surnageant avec bris flottants. Ajouter 1 mL de Neurobasal additionné de B27 (2,0 % v/v) et Resuspendre le culot cellulaire en pipettant également doucement et descendre de 5 à 10 fois.
10. Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 70 µm placée au-dessus d’un tube conique de 50 mL. Attendez 2 min et puis versez moyenne Neurobasal/B-27 sur la crépine à l’aide d’un pipeteur.
11. Plaque de tous les neurones prélevés DRG (un total d’environ 2 x 10⁶ neurones DRG d’une souris) sur deux puits de la plaque 6 puits. Les neurones d’une souris adulte DRG couvrent deux puits dans une plaque 6 puits. Puis placer la plaque dans un incubateur à CO₂ à 37 ° C jusqu'à ce que les macrophages des cultures.

2. la co-culture de P primaires des Macrophages péritonéaux sur Culture de cellules A Insérer

Remarque : Établir les cultures co 4 h après le placage initial des neurones dissociés DRG

1. Les macrophages péritonéaux primaires sont préparés à partir de souris mâles C57BL6 adultes âgés de 8 semaines à 12 semaines. Euthanasier un animal dans une chambre de CO₂ . Inciser la peau abdominale délicatement, exposer le péritoine et éviter de couper le péritoine pour empêcher une fuite de liquide de lavage.
2. Perforation du péritoine à l’aide d’une seringue avec une aiguille de 22G et injecter 10 mL de glacee tampon phosphate salin (PBS) dans la cavité péritonéale. Massez délicatement le péritoine pendant 1-2 min. Ensuite, retirer l’aiguille et faire sortir les PBS à travers le site de ponction de l’aiguille et recueillir le liquide de lavage dans un tube conique de 50 mL.
   Remarque : Avant utilisation, placer la seringue sur la glace pour maintenir la froideur de la PBS.
3. Centrifuger le liquide de lavage à 239 x g pendant 10 min à 4 ° C pour granuler les composants cellulaires. Resuspendre le culot avec 3 mL du tampon de lyse des globules rouges (RBC) pendant 3 min à température ambiante. Centrifuger la suspension cellulaire à nouveau à 239 x g pendant 10 min à 4 ° C. Resuspendre le culot avec 3 mL de PBS et centrifuger la suspension cellulaire à nouveau pour enlever n’importe quel tampon de lyse RBC restante.
   Remarque : Assurez-vous que le tampon de lyse RBC est totalement supprimé. Dans le cas contraire tampon de lyse RBC restant peut-être être toxique pour les macrophages en culture.
4. Remettre en suspension les cellules boulettes dans 1 mL de milieu Neurobasal/B-27. Plaque de la moitié de tous les macrophages prélevés (un total de 3 × 10⁶ 6 x 10⁶ cellules) sur un insert de culture cellulaire avec la surface équivalente de 4,2 cm², qui est placé sur le puits de DRG dissociée.
   Remarque : Au cours de la période de culture mixte, macrophages sont cultivées dans un milieu de culture pour le neurone Neurobasal/B-27. Survie adéquate des macrophages sous cette condition a été confirmée.

3. traitement des Db-Camp et Collection de Macrophage CM

NOTE : Commencer le traitement de db-cAMP 4 h après les co-cultures neuron-macrophage.

1. Ajouter 2 µL de solution de db-cAMP de 100 µM aux co-cultures neuron-macrophage. Ajouter le même volume de PBS pour une expérience de contrôle.
2. Après 24h, remplir un puits vide avec 1 mL de milieu de culture de macrophage dans la même plaque 6 puits. Transférer l’insert de culture cellulaire dans les cultures co neuron-macrophage dans le puits vide avec milieu de culture de macrophage. Garder les cellules dans les mêmes conditions pendant 72 h sans changer le support.
   Remarque : Nous ajoutons seulement 1 mL de milieu de culture de macrophage pendant CM collection faire concentré CM. Lors de la collecte de CM, si nécessaire, nous avons ajouté plus d’efforts pour couvrir complètement les macrophages dans l’insert.
3. Après 72 h, centrifuger le macrophage CM à 239 x g pendant 5 min supprimer les composants cellulaires. Passez le liquide surnageant à travers un filtre de 0,2 µm pour éliminer les débris cellulaires restants. Conserver le CM recueillie à-70 ° C jusqu'à l’utilisation.

4. la croissance des neurites dosage avec CM recueillie

1. Avant de fonder une culture distincte de neurone DRG adulte, pré enduire une lame de 8 puits chambre suivant la même procédure décrite en 1.1 et 1.2.
2. Obtenir les neurones adultes dissociés de DRG dans Neurobasal additionné de B27 utilisant les mêmes méthodes décrits de 1.3 à 1.10. Plaque de 5 x 10⁴ cellules / puits sur le toboggan de la chambre de 8 puits revêtus.
3. Placez la chambre dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 h, permettant aux cellules d’attacher au fond. Ensuite, remplacez le milieu de culture avec la dégelée CM qui est préalablement chauffé à 37 ° C.
   Remarque : Veillez à ne pas toucher le fond de la diapositive 8 puits chambre lors du retrait du milieu de culture et en ajoutant le CM recueillie.
4. 15 h après les ensemencements initiaux, retirez le support et laver les cellules avec du PBS une fois. Ensuite, ajouter 200 µL de solution de paraformaldéhyde glacée 4 % dans les puits et incuber les cellules avec la solution de paraformaldéhyde pendant 20 min à 4 ° C
   Remarque : La culture de neurone DRG pour l’analyse de l’excroissance des neurites doit être précisément limitée à 15 h. Dans ces conditions, il n’y a aucun neurites appréciable.
5. Laver trois fois avec du PBS glacée et puis exécutez bloquant avec 10 % sérum de chèvre normal (NGS) avec 0,1 % Triton-X pour 30 min. Incuber les cellules fixes avec la solution d’anticorps primaire (anti-Tuj-1) diluée avec 10 % NGS (à une concentration de 1 µg/mL) pendant 4 h à la salle température ou toute une nuit à 4 ° C.
6. Laver trois fois avec du PBS et puis incuber les cellules avec solution (chèvre-anti souris) anticorps secondaire pendant 2 h à température ambiante. Ensuite, laver deux fois avec du PBS et monter la lame de la culture avec une lamelle couvre-objet (24 × 50 mm) à l’aide de la solution de montage.
7. Prendre des photos à l’aide d’un microscope à fluorescence pour visualiser des neurites.

Résultats

Les auteurs décrivent un protocole qui peut générer des macrophages capables de sécréter des facteurs moléculaires avec l’activité de l’excroissance des neurites. Le macrophage CM obtenu à partir des co-cultures traités avec db-cAMP a entraîné la croissance des neurites robuste lorsqu’elle est appliquée à une culture distincte du neurone DRG (Figure 2 a). En comparaison, CM obtenu à partir des co-cultures imprégnées de PBS n’induit pas...

Discussion

Il y a plusieurs étapes cruciales pour la génération de ce système de culture mixte. Il est important de s’assurer que les neurones de souris DRG et macrophages péritonéaux sont préparés frais et sain. Nous avons vécu activité l’excroissance des neurites diminuée du CM lors de la dissection des tous les GHM a pris plus de 30 min. En outre, la contamination de produits sanguins labiles dans les macrophages péritonéaux a également conduit à une diminution de l’activité de l’excroissance des neurites...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size	Corning,Falcon	353090	Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate
70-μm nylon cell strainer	Corning, Falcon	352350
8-well culture slide	Biocoat	354632	with a uniform application of Poly-D-Lysine
Red blood cell lysis buffer	Qiagen	158904
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C9407-100MG
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific, Gibco	21103-049	Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin
B-27 supplement, serum free	Thermo Fisher Scientific, Gibco	17504-044	extracellular solution
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	35050-061
Penicillin-streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Gibco	15140-122
Poly-D-lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminin	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	23017-015
Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	28745
10% Normal Goat Serum	Thermo Fisher Scientific	16210072
Triton-X-100	Daejung Chemical and Metal Co	8566-4405
Anti β III tubulin (Tuj-1)	Promega Corporation	G7121	Mouse monoclonal antibody
Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	A11005
Hemacytometer	Marienfeld-Superior	N/A
Cell culture CO2 incubator	Panasonic	N/A
Dissecting stereomicroscope	Carl Zeiss	Stemi DV4
Twist shaker	FINEPCR	Tw3t
Tabletop centrifuge	Sorvall	N/A
Confocal microscope	Olympus America Inc	IX71
FBS (Fetal Bovine Serum)	VWR International, Hyclone	SH30919.03
Friedman Pearson Rongeurs	FST (Fine Science Tools)	16021-14	Stainless steel, 14cm, curved, single joint action
Fine Scissors - Tungsten Carbide & ToughCut	FST (Fine Science Tools)	14558-11	sharp, serrated
Dumont #7 Forceps	FST (Fine Science Tools)	11272-30	Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved
Vannas Spring Scissors	FST (Fine Science Tools)	15000-00	straight, 3mm cutting-edge, sharp
Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge	Artisan Technology Group	DW-41	Input Voltage: 115VAC