Equivalentes tridimensionales tejido humano inflamatorio de la encía

Resumen

El objetivo del protocolo es construir un modelo de inflamatoria gingival humano in vitro. Este modelo de tejido co cultiva tres tipos de células humanas, queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, en condiciones de tridimensionales. Este modelo puede aplicarse a la investigación de enfermedades periodontales como gingivitis y periodontitis.

Resumen

Enfermedades periodontales (como gingivitis y periodontitis) son las principales causas de pérdida de dientes en adultos. Inflamación en la encía es la fisiopatología fundamental de las enfermedades periodontales. Actuales modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos para enfermedades periodontales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para reconstruir equivalentes de humano tejido inflamatorio de la encía (iGTE) en vitro. Primero construimos equivalentes de tejido humano de la encía (GTE) utilizando dos tipos de células humanas, incluyendo fibroblastos gingivales humanos (HGF) y queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT), bajo condiciones tridimensionales. Creamos un modelo de la herida usando un golpeador de tejido para hacer un agujero en el GTE. Próxima, humanas THP-1 monocitos mezclados con gel de colágeno se inyectan en el orificio del GTE. Por adimistration de 10 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) por 72 h, distinguen células THP-1 en macrófagos a focos inflamatorios forma en GTE (iGTE) (IGTE también puede ser stumilated con 2 μg/mL de los lipopolisacáridos (LPS) por 48 h para iniciar la inflamación ). IGTE es el primer modelo en vitro de encía inflamatorio con células humanas de una arquitectura tridimensional. IGTE refleja importantes cambios patológicos (immunocytes hidrógeno, interacciones intracelulares entre fibryoblasts, las células epiteliales, monocitos y macrófagos) en enfermedades periodontales. GTE, GTE herido y iGTE pueden utilizarse como herramientas versátiles para el estudio de la cicatrización de heridas, regeneración tisular, inflamación, interacción célula-célula y medicamentos potenciales pantalla para enfermedades periodontales.

Introducción

Enfermedades periodontales son la principal causa de pérdida de dientes en adultos. Gingivitis y la periodontitis son las enfermedades periodontales más comunes. Ambos presentan cambios inflamatorios agudos o crónicos mediada por biofilms en encía. Gingivitis se caracteriza por inflamación aguda, mientras que la periodontitis se presenta generalmente como una inflamación crónica. A nivel histológico, los componentes bacterianos desencadenan la activación de las células inmunes como macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y mastocitos^1,2. Estas células inmunitarias, especialmente macrófagos, interactúan con las células locales (incluyendo las células epiteliales gingivales, fibroblastos, células endoteliales y osteoblastos) dando lugar a lesiones inflamatorias en el tejido periodontal^3,4. Modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales, como ratas, hámsters, conejos, hurones, caninos y primates. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos de enfermedades periodontales⁵. Co cultivo de bacterias periodontales y células epiteliales orales humanos monocapa se ha utilizado para investigar el mecanismo de las infecciones periodontales⁶. Sin embargo, cultivos monocapa de células orales carecen de la arquitectura celular de tridimensional (3D) de tejido intacto; por lo tanto, no imitan la situación en vitro .

Aquí, equivalentes 3D tejido humano inflamatoria de la encía (iGTE) se establecen para representar enfermedades periodontales en vitro. Este modelo 3D de las enfermedades periodontales ocupa una posición intermedia entre los cultivos celulares monocapa y en modelos animales. Tres tipos de células humanas, incluyendo queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, se cultivan conjuntamente en gel de colágeno y estimulados por inflamatorias iniciadores para construir iGTE. IGTE simula de cerca las condiciones en vivo de diferenciación celular, interacción célula-célula y activación de los macrófagos en la encía. Este modelo tiene muchas aplicaciones posibles de drogas evaluación y análisis de nuevas aproximaciones farmacológicas en enfermedades periodontales, así como para analizar los mecanismos celulares y moleculares en la cicatrización de heridas, inflamación y regeneración de los tejidos.

Protocolo

Este protocolo está diseñado para crear equivalentes de tejido gingival humano, modelos de heridas gingivales y gingivitis modelos. Queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT) fueron amablemente proporcionados del Profesor Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Alemania)⁷. Los fibroblastos gingivales humanos (HGFs) fueron aislados de tejidos gingivales según los protocolos previamente publicados⁸. El consentimiento informado fue obtenido previamente y el estudio fue aprobado según los lineamientos establecidos por el Comité de ética, la Nippon Dental University Facultad de vida Odontología de Tokio (número de autorización: NDU-T2012-35). Pasos del protocolo 1 al 3 deben realizarse en una campana de cultivo celular.

1. preparación de los equivalentes de tejido humano 3D de encía (GTE) (figura 1A)

1. Mezclar colágeno tipo-un gel con 10% concentrado MEM-alfa y reconstrucción 10% buffer (2,2 g de NaHCO₃ y 4,47 g HEPES en 100 mL 0.05 N NaOH) en un tubo de 15 mL estéril mediante pipeteo. Mantener la solución de colágeno mezclado en hielo hasta su uso.
2. Colocar insertos de cultura 24-well (poro tamaño 3.0 μm) en una placa de 24 pocillos.
3. Quitar HGFs de la superficie de cultivo con solución al 0.25% tripsina-EDTA. Suspender las células en 10 mL de medio de cultivo A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Contar las células de un contador de células de Türk Bürker.
   1. Extraer la cantidad deseada de las células (1-5 x10⁵ células/mL) y centrifugar durante 4 min a 190 x g.
   2. Suspender las células en la solución de colágeno mixta. Mantenga la mezcla en hielo hasta el siguiente paso.
4. Agregar 0,5 mL de la mezcla de células de colágeno (0,5 – 2,5 x 10⁵ células/pocillo) en el inserto de cultura sin producir burbujas. Incubar la mezcla por 10-30 min en una atmósfera humidificada con 5% CO₂ a 37 º C para coagular la mezcla en un gel.
   Nota: Agregar la mezcla de colágeno en el centro de la inserción de la cultura para evitar la formación desigual del gel de colágeno.
5. Añadir 1 mL de medio de cultivo en el pozo y 0,5 mL en el inserto. Incubar la placa de cultivo de 24 h o toda la noche en una atmósfera humidificada con 5% CO₂ a 37 ° C.
6. Eliminar las células HaCaT desde la superficie de cultivo con solución al 0.25% tripsina-EDTA. Suspender las células en 10 mL de medio B (DMEM 10% FBS + 1% GlutaMAX) y contar las células. Extracto de la cantidad necesaria de células (1 – 5 x 10⁵ células/mL) con una pipeta, centrifugar durante 4 min a x 190 g. suspender las células en medio B.
7. Retire el medio de los insertos de la cultura, que contienen la mezcla de HGF-colágeno, por la aspiración. Agregar 0,5 mL de suspensión de células HaCaT (0,5 – 2,5 x 10⁵ células/pocillo) en la parte superior de la mezcla de HGF-colágeno. Incubar los cultivos para 24 horas o durante la noche.
   Nota: En este momento, el medio de la cultura bien debe ser A medias, mientras que el medio de la inserción de la cultura debe ser medio B.
8. Reemplazar el medio de cultivo con KSR medio (co-cultivo) (MEM-alfa + 15% nocaut suero recambio + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Añadir 1 mL de medio de cultivo en la cultura bien y 0,5 mL en el inserto de la cultura. Incubar los cultivos durante 24 – 48 h.
9. Reemplazar el medio de cultivo con medio KSR + 1% FBS. Añadir 1 mL en la cultura bien y 0,5 mL en el inserto de la cultura. Incubar los cultivos para 24 horas o durante la noche.
10. Reemplazar el medio de cultivo en la cultura con 0,7 – 1 mediano KSR de mL. Retire completamente el medio de la inserción de la cultura (la superficie de la cultura debe estar expuesta al aire). Incubar los cultivos durante 1 – 2 semanas. Cambiar el medio en la cultura bien dos veces por semana.
    Nota: No deje que el aumento del nivel medio sobre la superficie de cultivo (la capa superior compuesta de queratinocitos). Mantenga la superficie de cultivo seco.

2. preparación de GTE herido (figura 1B)

1. Preparar un golpeador de tejido de 1 – 3 mm de diámetro. Esterilizar con un autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.
2. Introduzca el punzón de tejido perpendicular GTE sobre 300 μm de profundidad y perforar un agujero en el tejido para simular una herida.
3. En este paso, utilice el GTE de heridos para la investigación de regeneración de tejido y cicatrización de herida. Por otra parte, fijar GTE uso tampón neutro de formalina al 10% para realizar el análisis histológico.

3. preparación de GTE inflamatoria (iGTE) (figura 1B)

1. Cultivar células THP-1 según el anterior informe⁹.
2. Mezclar colágeno tipo-un gel con 10% concentrado RPMI 1640, almacenador intermediario de la reconstrucción de 10% (2,2 g de NaHCO₃ y 4,47 g HEPES en 100 mL 0.05 N NaOH) y 10 ng/mL PMA. No la solución de colágeno mezclado en hielo hasta su uso.
3. Cuenta de 1-2 x 10⁶ THP-1 células y centrifugar durante 4 min a x 190 g. suspender las células en 1 mL de la solución de colágeno mixta. Mantenga la mezcla en hielo hasta el siguiente paso.
4. Añadir mezcla de 10-30 μL THP-1-colágeno en el área de heridos de GTE. Reemplazar el medio de cultivo a 0,7 – 1 medio KSR de mL que contiene 10 ng/mL de PMA.
5. Incubar la mezcla en una atmósfera humidificada con 5% CO₂ a 37 ° C por 72 h.
6. Utilizar el modelo para la investigación de gingivitis o enfermedad periodontal (por ejemplo, añadir potencial medicamento antinflamatorio a iGTE a ver sus efectos en el cytokine release¹⁰). Como alternativa, omite 72 h PMA-tratamiento, añadir 2 μg/mL de LPS en la cultura e incubar el tejido en una atmósfera humidificada con 5% CO₂ a 37 ° C por 48 h^11,12.

4. la fijación y el Immunostaining de montar toda de GTE y iGTE culturas

1. Fijación de las culturas.
   1. Retire el medio de cultivo de la placa de 24 pocillos. Lavar los tejidos 2 veces con tampón fosfato salino (PBS).
   2. Añadir 1 mL de formol al 10% buffer neutro solución el prospecto y 1 mL a la cultura también. Deje la placa de 24 pocillos en un refrigerador a 4 ° C durante la noche.
   3. Retire la solución de tampón neutro de formalina 10% al día siguiente.
   4. Por todo Monte immunostaining, lavar los tejidos 3 - 4 veces con PBS después de la fijación.
   5. De hematoxilina y eosina (H & E) coloración y immunostaining regular, proceder con la deshidratación, inclusión en parafina y seccionamiento.
      Nota: Para todo immunostaining de Monte, puede omitirse este paso.
2. Todo Monte inmunotinción
   Nota: Este protocolo fue modificado de la referencia 13.
   1. Lavar los tejidos 3 x en PBS 0.5 – 1% Triton, 10-30 min cada vez.
   2. Incubar los tejidos dos veces por 30 min en solución amortiguadora de bloqueo (PBS 1% Tritón + BSA de 10%), a temperatura ambiente.
   3. Lavar los tejidos 2 × en solución amortiguadora de bloqueo, 5 – 10 min cada vez.
   4. Añadir 50 μl de solución de anticuerpo primario en la dilución/concentración requerida a los insertos. Utilice una película delgada transparente plástico para envolver los insertos para evitar secar el tejido.
   5. Incubar el tejido durante 1 a 2 días a 4 ° C.
   6. Lavar los tejidos 3 veces, durante 30 minutos en PBS 1% Tritón + 10% de BSA. Lavar nuevamente 3 veces, durante 5 minutos en PBS 1% Triton.
   7. Añadir 50 μl de anticuerpo secundario en solución amortiguadora de bloqueo (PBS 1% Tritón + BSA de 10%) y 5 μl de solución de Hoechst 33342 (tinción de NucBlue en vivo de la célula) para cada insert. Utilice una película delgada transparente plástico para envolver los insertos para evitar secar el tejido.
   8. Incubar durante 1 a 2 días a 4 ° C. Envolver la placa de 24 pocillos en una toalla de papel húmeda y luego ponerlo en un envase plástico para ser utilizado a lo largo de la incubación.
   9. Lavar los tejidos 3 veces, durante 10 min en el Tritón de PBS 1%
   10. Utilice una aguja afilada para cortar la membrana de la inserción de la cultura para obtener el tejido. Colocar la membrana en un portaobjetos.
       Nota: El tejido debe estar en la membrana.
   11. Añadir 2-3 gotas de medio de montaje de fluorescencia. Cubrir el tejido con una cubierta de vidrio y conservar a 4 ° C en la oscuridad hasta su análisis.
   12. Ver los tejidos con un láser confocal de barrido microscopía (LSM).

Resultados

Las células HaCaT muestran morfología típica del keratinocyte bajo observación microscópica de contraste de fase (figura 2A). Scanner electrón microscópico (SEM) las imágenes demostraron que las superficies de células HaCaT estaban cubiertas por microvellosidades muchos. Conexiones intercelulares entre las células HaCaT fueron mediadas por procesos de membrana (figura 2B). Las células HaCaT expresaron epitelio gingival...

Discusión

Este protocolo se basa en métodos de creación de tejido gingival equivalentes y equivalentes de tejido adiposo subcutáneos, según anteriores informes^8,21,22. Aunque este es un método simple y fácil, algunos pasos requieren especial atención. Por ejemplo, la mezcla de colágeno debe conservarse en hielo hasta su uso para evitar la formación de gel en la solución. Cuando se agrega la mezcla de colágeno en el inserto de l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen type I-A	Nitta Gelatin Inc		For making dermis of GTE
MEM-alpha	Thermo Fisher Scientific	11900073	Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm	Corning, Inc.	353096	For tissue culture
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Cell culture reagent
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31600034	Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Cell culture reagent
Tissue puncher	Shibata system service co., LTD	SP-703	For punching holes in GTE
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	31800022	Cell culture medium
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)	Thermo Fisher Scientific	R37605	For labeling nuclei
Fluorescence mount medium	Dako		For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3]	abcam	ab17139	For identifying epithelium
Scaning electron microscope	Hitachi, Ltd.	HITACHI S-4000	For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy	LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.	LSM 700	For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody	abcam	ab52625	For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody	abcam	ab92547	For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody	Millipore	CBL271	For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody	Sigma-Aldrich	SAB2700244	For identifying macrophages
Human CD14 Antibody	R&D Systems	MAB3832-SP	For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody	Thermo Fisher Scientific	A11012	For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11001	For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific		For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells	Riken BRC cell bank	RCB1189	For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)	Sigma-Aldrich	P8139	For differentiatting THP-1 cells