Equivalenti di tessuto umano infiammatorio tridimensionale del Gingiva

Riepilogo

L'obiettivo del protocollo è quello di costruire un modello di infiammatorio gengiva umana in vitro. Questo modello di tessuto Co-coltiva tre tipi di cellule umane, keratinocytes di HaCaT, fibroblasti gengivali e macrofagi THP-1, in condizioni tridimensionali. Questo modello può essere applicato a indagare le malattie parodontali, quali gengivite e parodontite.

Abstract

Le malattie parodontali (come gengivite e parodontite) sono le principali cause di perdita dei denti negli adulti. L'infiammazione nella gengiva è fondamentale fisiopatologia delle malattie parodontali. Attuali modelli sperimentali di malattie parodontali sono stati stabiliti in vari tipi di animali. Tuttavia, la fisiopatologia dei modelli animali è diversa da quella degli esseri umani, rendendo difficile per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari e valutare nuovi farmaci per malattie parodontali. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la ricostruzione di equivalenti di tessuto infiammatorio umano della gengiva (iGTE) in vitro. Costruiamo prima equivalenti di tessuto umano della gengiva (GTE) utilizzando due tipi di cellule umane, tra cui fibroblasti gengivali umani (HGF) e cheratinociti epidermici della pelle umana (HaCaT), in condizioni tridimensionali. Creiamo un modello di ferita utilizzando un perforatore di tessuto per fare un buco nel GTE. Prossimi, umani monociti THP-1 mescolati con gel di collagene sono iniettati nel foro il GTE. Da adimistration di 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) per 72 h, cellule THP-1 differenziano nei macrofagi di focolai infiammatori forma in GTE (iGTE) (IGTE inoltre può essere stumilated con 2 µ g/mL di lipopolisaccaridi (LPS) per 48 h avviare l'infiammazione ). IGTE è il primo modello in vitro di gengiva infiammatoria utilizzando cellule umane con un'architettura tridimensionale. IGTE riflette le modifiche patologiche principali (activition immunociti, interazioni intracellulari tra fibryoblasts, cellule epiteliali, monociti e macrofagi) a malattie parodontali. GTE, GTE feriti e iGTE utilizzabile come versatile di strumenti per studiare la guarigione della ferita, rigenerazione tissutale, infiammazione, interazione cellula-cellula e potenziali farmaci schermo per malattie parodontali.

Introduzione

Le malattie parodontali sono la principale causa di perdita dei denti negli adulti. Gengivite e parodontite sono le più comuni malattie parodontali. Entrambi presenti alterazioni infiammatorie acute o croniche biofilm-mediata nella gengiva. Gengivite è caratterizzata da infiammazione acuta, considerando che la parodontite si presenta solitamente come l'infiammazione cronica. A livello istologico, componenti batteriche innescano l'attivazione di cellule immunitarie, come i macrofagi, linfociti, plasmacellule e mastociti^1,2. Queste cellule immuni, soprattutto macrofagi, interagiscono con le cellule locali (tra cui cellule epiteliali gingival, fibroblasti, cellule endoteliali e osteoblasti) con conseguente lesioni infiammatorie nel tessuto peridentale^3,4. Modelli sperimentali di malattie parodontali sono state stabilite in vari tipi di animali, come ratti, criceti, conigli, furetti, canini e primati. Tuttavia, la fisiopatologia dei modelli animali è diversa da quella degli esseri umani, rendendo difficile per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari e valutare nuovi farmaci di malattie parodontali⁵. Co-coltura di batteri parodontali e cellule epiteliali orali umane monostrato è stato utilizzato per studiare il meccanismo di infezioni parodontali⁶. Tuttavia, colture monostrato di cellule orali mancano l'architettura cellulare di tridimensionale (3D) di tessuto intatto; Pertanto, essi non può simulare la situazione in vitro .

Qui, gli equivalenti 3D infiammatoria del tessuto umano della gengiva (iGTE) sono istituiti per rappresentare malattie parodontali in vitro. Questo modello 3D delle malattie parodontali occupa una posizione intermedia tra colture delle cellule dello strato monomolecolare e modelli animali. Tre tipi di cellule umane, incluse HaCaT cheratinociti e fibroblasti gengivali macrofagi THP-1, sono co-coltivati su gel di collagene e stimolati dagli iniziatori infiammatori di costruire iGTE. IGTE simula molto attentamente le condizioni in vivo del differenziamento cellulare, l'interazione cellula-cellula e l'attivazione del macrofago nel gingiva. Questo modello ha molte possibili applicazioni per droga di screening e test di nuovi approcci farmacologici in malattie parodontali, nonché per l'analisi dei meccanismi cellulari e molecolari nella guarigione della ferita, infiammazione e rigenerazione dei tessuti.

Protocollo

Questo protocollo è progettato per creare equivalenti di tessuto gengivale umano, ferita gengivale modelli e modelli di gengivite. Pelle umana cheratinociti (HaCaT) sono state gentilmente concesse da professore Norbert E. Fusenig di Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Germania)⁷. Fibroblasti gengivali umani (HGFs) sono stati isolati dai tessuti gengivali secondo i protocolli precedentemente pubblicati⁸. Il consenso informato è stato ottenuto in anticipo, e lo studio è stato approvato secondo le linee guida fissano dal comitato etico, la Nippon Dental University School of Life Dentistry presso Tokyo (numero di autorizzazione: NDU-T2012-35). Procedura di protocollo 1 – 3 deve essere eseguita in una cappa di cultura cellulare.

1. preparazione del tessuto umano 3D equivalenti di gengiva (GTE) (Figura 1A)

1. Mix del collagene tipo I-A gel con 10% concentrato MEM-alfa e buffer di ricostruzione di 10% (2,2 g di NaHCO₃ e 4,47 HEPES in 100 mL di 0.05 N NaOH) in una provetta sterile da 15 mL di pipettaggio. Mantenere la soluzione mista collagene su ghiaccio fino a quando non utilizzato.
2. Inserire inserti cultura 24 pozzetti (poro dimensione 3.0 µm) in una piastra a 24 pozzetti.
3. Rimuovere HGFs dalla superficie di cultura utilizzando 0,25% soluzione di tripsina-EDTA. Sospendere le cellule in 10 mL di medium di coltura A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Contare le celle di un contatore di cellule Bürker-Türk.
   1. Estrarre la quantità desiderata di celle (1-5 x10⁵ cellule/mL), quindi centrifugare per 4 min a 190 x g.
   2. Sospendere le cellule nella soluzione mista del collagene. Mantenere la miscela su ghiaccio fino al passaggio successivo.
4. Aggiungere 0,5 mL della miscela delle cellule-collagene (0,5-2,5 x 10⁵ cellule/pozzetto) nell'inserto cultura senza produrre eventuali bolle. Incubare la miscela per 10-30 min in atmosfera umidificata con 5% CO₂ a 37 ° C per far coagulare la miscela in un gel.
   Nota: Aggiungere il composto di collagene al centro dell'inserto cultura per evitare disparità formazione di gel di collagene.
5. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura nel pozzo e 0,5 mL nell'inserto. Incubare la piastra di coltura per 24 ore o durante la notte in atmosfera umidificata con 5% CO₂ a 37 ° C.
6. Rimuovere le cellule HaCaT dalla superficie di cultura utilizzando 0,25% soluzione di tripsina-EDTA. Sospendere le cellule in 10 mL di medium B (DMEM 10% FBS + 1% GlutaMAX) e contare le celle. Estratto la quantità necessaria di celle (1 – 5 x 10⁵ cellule/mL) con una pipetta, centrifugare per 4 min x 190 g. sospendere le cellule in media B.
7. Rimuovere il supporto dagli inserti di cultura, che contengono la miscela di HGF-collagene, dall'aspirazione. Aggiungere 0,5 mL della sospensione di cellule HaCaT (0,5-2,5 x 10⁵ cellule/pozzetto) nella parte superiore la miscela di HGF-collagene. Incubare le colture per 24 ore o durante la notte.
   Nota: A questo punto del tempo, il mezzo nella cultura ben dovrebbe essere A medio, mentre il mezzo nell'inserto cultura dovrebbe essere medio B.
8. Sostituire il terreno di coltura con il mezzo di KSR (co-coltura) (MEM-alfa + 15% sostituzione di KnockOut del siero + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura nella cultura ben e 0,5 mL nell'inserto cultura. Incubare le colture per 24 – 48 h.
9. Sostituire il terreno di coltura con KSR medium + 1% FBS. Aggiungere 1 mL nella cultura ben e 0,5 mL nell'inserto cultura. Incubare le colture per 24 ore o durante la notte.
10. Sostituire il terreno di coltura nella cultura bene con 0,7 – 1 mL di terreno di KSR. Rimuovere completamente il mezzo dall'inserto di cultura (la superficie di cultura dovrebbe essere esposto all'aria). Incubare le colture per 1 – 2 settimane. Modificare il mezzo nella cultura ben due volte alla settimana.
    Nota: Non lasciare che l'innalzamento del livello medio sopra la superficie di cultura (lo strato superiore è composto da cheratinociti). Tenere sempre asciutta la superficie di cultura.

2. preparazione del GTE feriti (Figura 1B)

1. Preparare un perforatore di tessuto del diametro 1 – 3 mm. Sterilizzare con autoclave a 121 ° C per 20 min.
2. Spingere il puncher tessuto perpendicolarmente in GTE circa 300 µm profonda e fare un buco nel tessuto per simulare una ferita.
3. A questo punto, è possibile utilizzare il GTE feriti per indagare la rigenerazione di tessuto e di guarigione della ferita. In alternativa, Difficoltà GTE utilizzando soluzione tampone neutro di formalina al 10% per eseguire l'analisi istologica.

3. preparazione del GTE infiammatorie (iGTE) (Figura 1B)

1. Coltivare le cellule THP-1 secondo la precedente relazione⁹.
2. Mix del collagene tipo I-A gel con 10% concentrato RPMI 1640, buffer di ricostruzione del 10% (2,2 g di NaHCO₃ e 4,47 HEPES in 100 mL di 0.05 N NaOH) e 10 ng/mL PMA. Mantenere la soluzione mista collagene su ghiaccio fino all'utilizzo.
3. Conteggio 1 – 2 x 10⁶ THP-1 cellule e centrifugare per 4 min x 190 g. sospendere le cellule in 1 mL della soluzione mista di collagene. Mantenere la miscela su ghiaccio fino al passaggio successivo.
4. Aggiungere 10 – 30 µ l THP-1-collagene miscela nell'area ferito del GTE. Sostituire il terreno di coltura a 0,7 – 1 mL di terreno di KSR contenente 10 ng/mL di PMA.
5. Incubare la miscela in atmosfera umidificata con 5% CO₂ a 37 ° C per 72 h.
6. Utilizzare il modello per lo studio di gengivite o parodontite (ad esempio, aggiungere potenziale farmaco antinfiammatorio a iGTE per vedere i suoi effetti sul rilascio di citochina¹⁰). In alternativa, omettere 72h PMA-trattamento, aggiungere 2 µ g/mL di LPS nella cultura e incubare il tessuto in atmosfera umidificata con 5% CO₂ a 37 ° C per 48 h^11,12.

4. fissazione e Immunostaining di montare tutta del GTE e iGTE culture

1. Fissazione delle culture.
   1. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 24 pozzetti. Lavare i tessuti 2 volte con tamponato fosfato salino (PBS).
   2. Aggiungere 1 mL di soluzione di tampone neutro di formalina al 10% per l'inserto e 1 mL alla cultura bene. Lasciare la piastra a 24 pozzetti in frigorifero a 4 ° C durante la notte.
   3. Rimuovere la soluzione di tampone neutro di formalina 10% il giorno seguente.
   4. Per l'intero Monte immunocolorazione, lavare i tessuti 3 - 4 volte con PBS dopo la fissazione.
   5. Per ematossilina ed eosina (H & E) e immunostaining regolari, procedere con disidratazione, inclusione in paraffina e sezionamento.
      Nota: Per l'intero Monte immunocolorazione, questo passaggio può essere omesso.
2. Tutta Monte immunostaining
   Nota: Questo protocollo è stato modificato da quella di riferimento 13.
   1. Lavare i tessuti 3 x in PBS 0.5 – 1% Triton, 10 – 30 min ogni volta.
   2. Incubare i tessuti due volte per 30 min in tampone bloccante (PBS 1% Triton + 10% BSA), a temperatura ambiente.
   3. Lavare i tessuti 2 × in tampone bloccante, 5 – 10 minuti ogni volta.
   4. Aggiungere 50 µ l di soluzione di anticorpo primario alla diluizione/concentrazione necessaria agli inserti. Utilizzare una sottile pellicola di plastica per avvolgere gli inserti per evitare disidratazione del tessuto.
   5. Incubare il tessuto per 1 o 2 giorni a 4 ° C.
   6. Lavare i tessuti 3 volte, per 30 min in PBS 1% Triton + 10% BSA. Lavare nuovamente 3 volte, per 5 min in PBS 1% Triton.
   7. Aggiungere 50 µ l di anticorpo secondario in tampone bloccante (PBS 1% Triton + 10% BSA) e 5 µ l di soluzione di Hoechst 33342 (macchia di NucBlue Live Cell) per ogni inserimento. Utilizzare una sottile pellicola di plastica per avvolgere gli inserti per evitare disidratazione del tessuto.
   8. Incubare per 1-2 giorni a 4 ° C. Avvolgere la piastra a 24 pozzetti in un tovagliolo di carta bagnato e poi metterlo in un pacchetto di plastica da utilizzare durante l'incubazione.
   9. Lavare i tessuti 3 volte, per 10 min in triton 1% PBS
   10. Usare un ago affilato per tagliare la membrana dell'inserto cultura per ottenere il tessuto. Posizionare la membrana in una diapositiva.
       Nota: Il tessuto dovrebbe essere sulla membrana.
   11. Aggiungere 2 – 3 gocce di mezzo di montaggio di fluorescenza. Coprire il tessuto con una copertura in vetro e conservare a 4 ° C al buio fino all'analisi.
   12. Mostra tessuti con un laser confocale microscopia (LSM).

Risultati

Le cellule HaCaT visualizzato morfologia tipica del keratinocyte sotto osservazione al microscopio di contrasto di fase (Figura 2A). Immagini di scanner elettrone microscopiche (SEM) ha mostrato che le superfici delle cellule HaCaT erano coperti da molti microvilli. Intercellulare connessioni tra le cellule HaCaT sono state mediate da processi a membrana (Figura 2B). Le cellule HaCaT espresso epitelio gingival marcatore K8/18

Discussione

Questo protocollo è basato su metodi di creazione di tessuto gengivale equivalenti ed equivalenti di tessuto adiposo sottocutanei descritti da precedenti rapporti^8,21,22. Anche se si tratta di un metodo semplice e facile, alcuni passaggi richiedono particolare attenzione. Ad esempio, la miscela di collagene dovrebbe essere tenuta su ghiaccio fino all'utilizzo per evitare la formazione di un gel nella soluzione. Quando si aggiun...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen type I-A	Nitta Gelatin Inc		For making dermis of GTE
MEM-alpha	Thermo Fisher Scientific	11900073	Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm	Corning, Inc.	353096	For tissue culture
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Cell culture reagent
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31600034	Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Cell culture reagent
Tissue puncher	Shibata system service co., LTD	SP-703	For punching holes in GTE
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	31800022	Cell culture medium
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)	Thermo Fisher Scientific	R37605	For labeling nuclei
Fluorescence mount medium	Dako		For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3]	abcam	ab17139	For identifying epithelium
Scaning electron microscope	Hitachi, Ltd.	HITACHI S-4000	For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy	LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.	LSM 700	For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody	abcam	ab52625	For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody	abcam	ab92547	For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody	Millipore	CBL271	For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody	Sigma-Aldrich	SAB2700244	For identifying macrophages
Human CD14 Antibody	R&D Systems	MAB3832-SP	For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody	Thermo Fisher Scientific	A11012	For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11001	For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific		For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells	Riken BRC cell bank	RCB1189	For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)	Sigma-Aldrich	P8139	For differentiatting THP-1 cells