JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Цель Протокола заключается в создании модели воспалительных человеческой десны в пробирке. Эта модель ткани совместно культивируют три типа клеток человека, HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофагов, трехмерные условиях. Эта модель может применяться для расследования периодонтальных заболеваний, таких как гингивит и пародонтит.

Аннотация

Болезни пародонта (таких как гингивит и пародонтит) являются ведущими причинами потери зубов у взрослых. Воспаление десен является основополагающим физиопатологические заболеваний пародонта. Текущие экспериментальные модели заболеваний пародонта были установлены в различных видов животных. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств для заболеваний пародонта. Здесь мы представляем подробный протокол для реконструкции воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) в пробирке. Мы сначала построить эквиваленты человеческих тканей десны (ГТД), используя два типа клеток человека, включая десневой фибробластов (HGF) и эпидермальных кератиноцитов человеческой кожи (HaCaT), трехмерные условиях. Мы создаем модель раны с помощью ткани дырокол пробивать отверстие в GTE. Далее, человека THP-1 моноцитов, смешанного с коллагеном гель вводят в отверстие в GTE. По adimistration 10 нг/мл phorbol 12-миристат 13-ацетата (PMA) за 72 ч, THP-1 клетки дифференцированной в макрофагов в форме воспалительных очагов в GTE (iGTE) (IGTE также может быть stumilated с 2 мкг/мл липополисахаридов (LPS) для 48 h инициировать воспаление ). IGTE-первый в vitro модель воспалительных десны с использованием клеток человека с трехмерной архитектурой. IGTE отражает основные патологические изменения (immunocytes деятельность, внутриклеточных взаимодействий между fibryoblasts, эпителиальные клетки, моноциты и макрофаги) в заболеваний пародонта. GTE, раненых GTE и iGTE могут использоваться в качестве универсальных инструментов для изучения заживление ран, регенерации тканей, воспаление, ячейке взаимодействия и экран потенциальных лекарственных средств для заболеваний пародонта.

Введение

Болезни пародонта являются основной причиной потери зубов у взрослых. Гингивит и пародонтит являются наиболее распространенных заболеваний пародонта. Оба представляют биопленки опосредованной острые или хронические воспалительные изменения в десны. Гингивит характеризуется острого воспаления, тогда как периодонтит обычно представляет как хроническое воспаление. На уровне гистологические бактериальных компоненты запуска активации иммунных клеток, таких как макрофагов, лимфоцитов, плазматические клетки и тучные клетки1,2. Эти клетки иммунной системы, особенно макрофаги, взаимодействуют с местными клеток (включая десневой эпителиальных клеток, фибробластов, эндотелиальных клеток и остеобласты) результате воспалительных поражений тканей пародонта3,4. Были созданы экспериментальные модели заболеваний пародонта в различных видов животных, таких как крысы, хомячки, кролики, хорьки, клыки и приматов. Однако физиопатологические животных моделей отличается от людей, что делает его трудным для молекулярных и клеточных механизмов анализа и оценки новых лекарств заболеваний пародонта5. Совместное выращивание периодонтальной бактерий и монослоя человека устной эпителиальных клеток был использован для изучения механизма пародонта инфекции6. Тем не менее однослойная культур устные клеток не хватает трехмерной (3D) сотовой архитектуры неповрежденной ткани; Таким образом они не могут имитировать ситуации в пробирке .

Здесь 3D воспалительных тканей человека эквиваленты десны (iGTE) созданы для представления заболеваний пародонта в пробирке. Эта 3D модель заболеваний пародонта занимает промежуточное положение между монослоя клеточных культур и животных моделей. Три типа клеток человека, включая HaCaT кератиноцитов, десневые фибробластов и THP-1 макрофаги, совместно культивируемых на гель коллагена и стимулируется воспалительных инициаторов построить iGTE. IGTE тесно имитирует условия в vivo дифференцировки клеток, клеток взаимодействия и активация макрофагов в десны. Эта модель имеет множество возможных применений для наркотиков скрининг и тестирование новых фармакологических подходов в заболеваниях пародонта, а также для анализа молекулярных и клеточных механизмов в заживление ран, воспаления и регенерации тканей.

протокол

Этот протокол предназначен для создания человека десневой ткани эквиваленты, гингивального заживления и гингивит моделей. Кожа человека эпидермальных кератиноцитов (HaCaT) были любезно предоставил от профессор Норберт Fusenig E. Deutsches Krebsforschungszentrum (Хайдельберг, Германия)7. Десневой фибробластов (HGFs) были изолированы от десневой ткани согласно ранее опубликованные протоколы8. Информированное согласие было получено заранее, и исследования был утвержден в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по вопросам этики, Nippon стоматологический университет Школа жизни стоматологии в Токио (номер авторизации: НДУ-T2012-35). Протокол шаги 1-3 должны выполняться в капот культуры клеток.

1. Подготовка эквиваленты 3D человеческих тканей десны (ГТЭ) (рис. 1A)

  1. Mix коллаген типа-А гель с 10% сосредоточены MEM-альфа и 10% восстановления буфера (2,2 g NaHCO3 и 4.47 g HEPES в 100 мл 0,05 N NaOH) в 15 мл стерильной пробирке, закупорить. Держите смешанных коллагена раствор на льду до тех пор, пока используется.
  2. Место вставки 24-ну культуры (поры размер 3,0 мкм) в 24-ну плиту.
  3. Удаление HGFs из культуры поверхности с помощью 0,25% раствор трипсина ЭДТА. Приостановить клетки в 10 мл питательной среды A (MEM-Альфа + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Подсчет ячеек с счетчик клеток Bürker-Тюрк.
    1. Извлечь желаемое количество клеток (1-5 x105 клеток/мл), а затем центрифуги для 4 мин на 190 x g.
    2. Приостановите клетки в смешанной коллагена раствор. Оставьте смесь на льду до следующего шага.
  4. Добавьте 0,5 мл смеси клетки коллаген (0,5 – 2,5 x 105 клеток/а) в культуре вставляют без каких-либо пузырей. Инкубируйте смесь для 10 – 30 мин в атмосфере увлажненный с 5% CO2 при 37 ° C для коагуляции смесь в гель.
    Примечание: Добавьте смесь коллагена в центр культуры Вставка, чтобы избежать неравные формирования коллагена геля.
  5. Добавьте 1 мл питательной среды в колодец и 0,5 мл в insert. Инкубировать культуры пластина для 24 час или ночь в атмосфере увлажненный с 5% CO2 при 37 ° C.
  6. Удалите HaCaT клетки с поверхности культуры, 0,25% раствором трипсина ЭДТА. Приостановить клетки в 10 мл среды B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) и подсчитать количество ячеек. Экстракт необходимое количество клеток (1 – 5 x 105 клеток/мл) с пипеткой, центрифуги для 4 мин на 190 x g. приостановить клетки в средних б.
  7. Удалите носитель из культуры вставок, которые содержат HGF-коллаген смесь, стремлением. Добавьте 0,5 мл суспензии клеток HaCaT (0,5 – 2,5 x 105 клеток/хорошо) на вершине HGF-коллаген смесь. Инкубируйте культур для 24 h или на ночь.
    Примечание: В этот момент времени, среднего в культуре также должно быть среднего A, в то время как среднего в культуре вставки должен быть средний б.
  8. Замените KSR среднего (сопредседатель культуры среднего) питательной среды (MEM-альфа + 15% нокаутом сыворотки замена + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Добавьте 1 мл питательной среды в культуру, хорошо и 0,5 мл в культуре вставки. Инкубируйте культур за 24-48 ч.
  9. Заменить питательной среды KSR средний + 1% FBS. Добавьте 1 мл в культуру хорошо и 0,5 мл в культуре вставки. Инкубируйте культур для 24 h или на ночь.
  10. Заменить питательной среды в культуре с 0,7-1 мл KSR среднего. Полностью удалите носитель из вставки культура (культура поверхности должны подвергаться воздействию воздуха). Инкубируйте культур для 1 – 2 недели. Изменение среднего в культуре также два раза в неделю.
    Примечание: Не позволяйте среднего уровня подняться выше поверхности культуры (верхний слой состоит из кератиноцитов). Всегда держите культуры поверхность сухой.

2. Подготовка раненых GTE (рис. 1B)

  1. Подготовьте панчер ткани диаметром 1-3 мм. Стерилизуйте его с автоклаве при температуре 121 ° C 20 мин.
  2. Вставьте ткани панчер перпендикулярно в GTE о 300 мкм глубокой и пробить дыру в ткани, чтобы имитировать рану.
  3. На этом шаге используйте раненых GTE для расследования рану заживления и регенерации тканей. Кроме того исправьте ГТД с использованием 10% формалине нейтрального буферного раствора для выполнения гистологический анализ.

3. Подготовка воспалительных GTE (iGTE) (рис. 1B)

  1. Культивируйте клетки THP-1 по данным предыдущего доклада9.
  2. Mix коллаген типа-А гель с 10% сосредоточены RPMI 1640, 10% восстановления буфера (2,2 g NaHCO3 и 4.47 g HEPES в 100 мл 0,05 N NaOH) и 10 нг/мл PMA. Держите смешанных коллагена раствор на льду до использования.
  3. Фото 1 – 2 х 106 THP-1 клетки и центрифуги для 4 мин на 190 x g. приостановить клеток в 1 мл раствора смешанного коллагена. Оставьте смесь на льду до следующего шага.
  4. Добавьте 10 – 30 мкл THP-1-коллаген смесь в область раненых ГТД. Заменить питательной среды на 0,7-1 мл KSR носитель, содержащий 10 нг/мл PMA.
  5. Инкубируйте смесь в атмосфере увлажненный с 5% CO2 при 37 ° C за 72 ч.
  6. Использовать модель для изучения гингивита и периодонтита (например, добавить потенциальных противовоспалительные медицины в iGTE, чтобы увидеть его влияние на cytokine выпуске10). Можно также опустить 72 h PMA-лечение, добавить 2 мкг/мл LPS в культуру и инкубировать ткани в атмосфере увлажненный с 5% CO2 при 37 ° C для 48 h11,12.

4. Фиксация и весь Маунт иммуноокрашивания GTE и iGTE культур

  1. Фиксация культур.
    1. Удалите средство культуры с 24-ну пластины. Вымойте тканей 2 раза с-фосфатный буфер (PBS).
    2. Хорошо добавьте 1 мл нейтрального буферного раствора формалина 10% для вставки и 1 мл в культуре. Оставьте 24-ну пластины в холодильнике при температуре 4 ° C на ночь.
    3. Удалите следующий день нейтрального буферного раствора формалина 10%.
    4. Для всей горе иммуноокрашивания мыть ткани 3 - 4 раза с PBS после фиксации.
    5. Гематоксилином и эозином (H & E) и регулярные иммуноокрашивания приступайте к дегидратации, внедрение парафин и секционирование.
      Примечание: Для вся гора иммуноокрашивания, этот шаг может быть опущен.
  2. Вся гора иммуноокрашивания
    Примечание: Этот протокол был изменен от того, в справочнике 13.
    1. Вымойте тканей 3 x в PBS 0,5 – 1% Тритон, 10 – 30 минут каждый раз.
    2. Инкубировать тканей дважды на 30 мин в блокирующем буфере (PBS 1% тритон + 10% BSA), при комнатной температуре.
    3. Вымойте тканей 2 × в блокирующем буфере, 5-10 минут каждый раз.
    4. Добавьте 50 мкл раствора первичного антитела в требуемой концентрации разбавления/вставки. Используйте тонкий пластиковый цепляться пленки обернуть вставки, чтобы избежать высыхания ткани.
    5. Инкубировать ткани для 1-2 дней при 4 ° C.
    6. Вымойте тканей 3 раза, за 30 мин в PBS 1% тритон + 10% BSA. Мойте снова 3 раза, за 5 мин в PBS 1% тритон.
    7. Добавьте 50 мкл вторичного антитела в блокирующем буфере (PBS 1% тритон + 10% BSA) и 5 мкл раствора Hoechst 33342 (клетки живут NucBlue пятно) для каждой вставки. Используйте тонкий пластиковый цепляться пленки обернуть вставки, чтобы избежать высыхания ткани.
    8. Инкубировать в течение 1-2 дней при 4 ° C. Оберните 24-ну пластины влажной салфеткой, а затем положить его в пластиковый пакет, чтобы использоваться на протяжении всего инкубационного.
    9. Вымойте тканей 3 раза, для 10 минут в PBS 1% тритон
    10. Используйте острые иглы вырезать мембраны культуры вставка для получения ткани. Место мембраны на слайд.
      Примечание: Ткани должна быть на мембране.
    11. Добавьте 2-3 капли флуоресценции горе среды. Покрытие ткани с покровным стеклом и хранить при 4 ° C в темноте до анализа.
    12. Просмотр тканей с Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (МИС).

Результаты

HaCaT ячеек типичные кератиноцитов морфология при фазово контрастной микроскопические наблюдения (рис. 2A). Сканер электрона микроскопических изображений (SEM) показал, что HaCaT клеток поверхности были охвачены многие микроворсинки. Межклеточные соединени?...

Обсуждение

Этот протокол основан на методы создания эквиваленты десневой ткани и подкожно-жировой эквиваленты, описанные в предыдущих докладах8,21,22. Хотя это простой и легкий метод, некоторые шаги требуют особого внимания. К примеру коллаген смес...

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана в части японского общества для поощрения науки (JSP) субсидий для научных исследований (26861689 и 17 K 11813). Авторы хотели бы поблагодарить г-н Натаниел Грин для корректуры.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagen type I-ANitta Gelatin IncFor making dermis of GTE
MEM-alphaThermo Fisher Scientific11900073Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μmCorning, Inc.353096For tissue culture
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Cell culture reagent
DMEMThermo Fisher Scientific31600034Cell culture medium
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Cell culture reagent
Tissue puncherShibata system service co., LTDSP-703For punching holes in GTE
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific31800022Cell culture medium
BSASigma-AldrichA3294For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)Thermo Fisher ScientificR37605For labeling nuclei
Fluorescence mount mediumDakoFor mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3]abcamab17139For identifying epithelium
Scaning electron microscopeHitachi, Ltd.HITACHI S-4000For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopyLSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.LSM 700For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibodyabcamab52625For identifying epithelium
Anti-vimentin antibodyabcamab92547For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibodyMilliporeCBL271For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibodySigma-AldrichSAB2700244For identifying macrophages
Human CD14 AntibodyR&D SystemsMAB3832-SPFor identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibodyThermo Fisher ScientificA11012For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibodyThermo Fisher ScientificA11001For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging SystemThermo Fisher ScientificFor observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cellsRiken BRC cell bankRCB1189For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)Sigma-AldrichP8139For differentiatting THP-1 cells

Ссылки

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
  13. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
  14. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
  15. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
  16. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
  17. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
  18. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  19. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
  20. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

134HaCaTTHP 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены