3 차원 선 동적인 인간 조직 Gingiva 등가물

요약

프로토콜의 목적은 염증 인간의 gingiva 모델 시험관을 구축 하는 것입니다. 이 조직 모델 공동 세 가지 유형의 인간 세포, HaCaT keratinocytes, gingival fibroblasts 및 THP 1 대 식 세포, 3 차원 조건 하에서 양성. 치은 염 및 치 주 염 등 치 주 질환을 조사 하는 것이 모델을 적용할 수 있습니다.

초록

치 주 질환 (치은 염 등 치 주 염)는 성인에서 치아 손실의 주요 원인. Gingiva에 염증 치 주 질환의 근본적인 physiopathology입니다. 치 주 질환의 현재 실험 모델 동물의 다양 한 종류에 설립 되었습니다. 그러나, 동물 모델의 physiopathology는 인간의 세포 및 분자 메커니즘을 분석 하 고 치 주 질환에 대 한 새로운 의약품을 평가 하기가 어렵습니다 다릅니다. 여기, 우리 인간의 염증 성 조직 등가물 gingiva (iGTE) 체 외에서의 재구성에 대 한 자세한 프로토콜 제시. 우리는 먼저 인간의 gingival 섬유 아 세포 (HGF) 등 3 차원 조건 하에서 인간의 피부 상피 keratinocytes (HaCaT), 인간 세포의 두 종류를 이용 하 여 gingiva (GTE)의 인간의 조직에 해당 빌드. 우리는 GTE에 구멍을 펀치 조직 주먹을 사용 하 여 상처 모델을 만듭니다. 다음, 인간의 THP 1 monocytes 콜라겐 젤과 혼합는 GTE에 구멍에 주입 됩니다. 10 ng/mL phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 72 h에 대 한 adimistration에 의해 THP-1 셀 GTE (iGTE)에서 양식 염증 foci 하 대 식 세포로 분화 (IGTE 또한 일 수 있다 stumilated lipopolysaccharides (LPS)의 2 µ g/mL와 염증을 시작 하 48 h에 대 한 ). IGTE 3 차원 구조와 인간 세포를 사용 하 여 염증 gingiva의 첫 번째 시험관에 모델입니다. IGTE 치 주 질환에 주요 학적 변화 (immunocytes activition, fibryoblasts, 상피 세포, monocytes 그리고 대 식 세포 중에서 세포 상호 작용)을 반영 한다. 치 주 질환에 대 한 상처 치유 공부를 다양 한 도구, 조직 재생, 염증, 세포 세포 상호 작용, 및 화면 잠재적인 약으로 GTE, 부상된 GTE, 및 iGTE을 사용할 수 있습니다.

서문

치 주 질환 성인에서 치아 손실의 주요 원인입니다. 치은 염 및 치 주 염 가장 일반적인 치 주 질병이 있습니다. 둘 다 gingiva에 biofilm 중재 급성 또는 만성 염증 성 변화를 제시. 치은 염 치 주 염이 만성 염증으로 일반적으로 선물 하는 반면 급성 염증, 특징 이다. 조직학 수준에 세균성 구성 요소는 대 식 세포, 림프 톨, 플라스마 세포, 돛대 세포^1,2등 면역 세포의 활성화를 트리거합니다. 이러한 면역 세포 특히 대 식 세포, 지방 세포 (gingival 상피 세포, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 및 osteoblasts 포함)와 상호 작용 결과로 치 주 조직^3,4에 염증 성 병 변. 치 주 질환의 실험 모델 동물, 쥐, 등의 다양 한 종류에서 설립 되어 햄스터, 토끼, 흰 족제비, 개, 그리고 대주교. 그러나, 동물 모델의 physiopathology는 인간의 세포 및 분자 메커니즘을 분석 하 고 치 주 질환⁵의 새로운 의약품을 평가 하기가 어렵습니다 다릅니다. 치 주 박테리아와 단층 인간 구강 상피 세포의 공동 경작은 치 주 감염⁶의 메커니즘을 조사 하기 위해 사용 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 구강 세포의 단층 문화 부족 그대로 조직;의 3 차원 (3D) 셀룰러 아키텍처 따라서, 그들은 체 외에 상황을 모방 수 없습니다.

여기, 3D 염증 인간의 조직 등가물 gingiva (iGTE)의 생체 외에서치 주 질환을 대표 설정 됩니다. 치 주 질환의이 3D 모델 단층 세포 배양 및 동물 모델 사이의 중간 위치를 차지 하고있다. 세 가지 유형의 HaCaT keratinocytes, gingival fibroblasts 및 THP-1 세포를 포함 하 여 인간 셀 공동 콜라겐 젤에 재배 있으며 iGTE 구축 염증 초기자에 의해 자극. IGTE는 밀접 하 게 세포 분화, 세포 세포 상호 작용 및 gingiva에 대 식 세포 활성화의 비보에 조건을 시뮬레이션합니다. 이 모델은 마약 검사 및 치 주 질환, 새로운 약리학 접근을 테스트 뿐만 아니라 상처 치유, 염증, 및 조직 재생에 세포질이 고 분자 메커니즘 분석을 위한 많은 가능한 응용.

프로토콜

이 프로토콜은 인간의 gingival 조직 등가물, gingival 상처 모델 및 치은 염 모델을 만들 하도록 설계 되었습니다. 인간의 피부 상피 keratinocytes (HaCaT) 교수 노 버트 E. Fusenig 독일 Krebsforschungszentrum (하이 델 베르크, 독일)⁷의에서 친절 하 게 제공 되었다. 인간의 gingival 섬유 아 세포 (HGFs)⁸이전 게시 된 프로토콜 따라 gingival 조직에서 분리 했다. 미리 동의 얻어와 연구 윤리 위원회는 일본 치과 대학 학교 생활 치과의 도쿄에서 설정한 지침에 따라 승인 (승인 번호: NDU-T2012-35). 1-3 단계 프로토콜 셀 문화 후드에서 수행 되어야 합니다.

1. 3D 인체 조직 등가물 Gingiva (GTE) (그림 1A)의 준비

1. 10% 혼합 콜라겐 타입-A의 젤 집중 MEM-알파와 10% 재건 버퍼 (2.2 g NaHCO₃ 및 4.47 g HEPES 100 ml 0.05 N NaOH) pipetting으로 15 mL 무 균 튜브에. 사용 될 때까지 얼음에 혼합된 콜라겐 솔루션을 유지.
2. 24 잘 문화 삽입 (기 공 크기 3.0 µ m) 24-잘 접시에 놓습니다.
3. 0.25% trypsin EDTA 용액을 사용 하 여 문화 표면에서 HGFs를 제거 합니다. 10 ml 문화 매체 A의 세포를 중단 (MEM-알파 + 20 %FBS + 1 %GlutaMAX). Bürker-터크 셀 카운터로 셀을 계산.
   1. 셀 (1-5 x10⁵ 셀/mL), 원하는 수량을 추출 후 4 분 190 x g에서 원심.
   2. 혼합된 콜라겐 솔루션에 셀을 일시 중단 합니다. 다음 단계까지 얼음에 혼합물을 유지.
4. 모든 거품을 생산 하지 않고 문화 삽입으로 셀 콜라겐 혼합 (0.5-2.5 x 10⁵ 셀/잘) 0.5 mL를 추가 합니다. 젤에 혼합물을 응고를 37 ° C에서 5% CO₂ 습도 분위기에서 10-30 분을 위한 혼합물을 품 어.
   참고:의 문화 삽입 되지 않도록 불평등 콜라겐 젤을 중심으로 콜라겐 혼합물을 추가 합니다.
5. 잘 삽입으로 0.5 mL으로 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다. 24 h에 대 한 문화 접시를 품 어 또는 37 ° c.에 5% CO₂ 습도 분위기에서 하룻밤
6. 0.25% trypsin EDTA 용액을 사용 하 여 문화 표면에서 HaCaT 세포를 제거 합니다. 10 ml 매체 B의 셀을 일시 중단 (DMEM + 10 %FBS + 1 %GlutaMAX) 셀을 카운트. 추출 셀 (1-5 x⁵ 셀/10ml) 피 펫, 190 x g.에서 4 분에 대 한 원심 분리기의 필요한 수량 중단 중간 b 세포
7. 열망 하 여 HGF 콜라겐 혼합물을 포함 하는 문화 삽입에서 매체를 제거 합니다. HGF 콜라겐 혼합 상단 HaCaT 세포 현 탁 액 (0.5-2.5 x 10⁵ 셀/잘) 0.5 mL를 추가 합니다. 24 시간 또는 하룻밤에 대 한 문화를 품 어.
   참고:이 시간이 시점에서 문화에 매체 잘 해야 중간 A 문화 삽입에 중간 중간 B. 해야 하는 동안
8. KSR 매체 (공동 문화 매체)와 문화 매체를 대체 (메모리 알파 + 15% 녹아웃 혈 청 교체 + 1 %GlutaMAX) + 5 %FBS. 잘 하 고 문화 삽입으로 0.5 mL 문화에 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다. 24-48 h에 대 한 문화를 품 어.
9. KSR 매체 + 1% 문화 매체를 대체 FBS. 잘 문화에 1 mL 및 문화 삽입으로 0.5 mL를 추가 합니다. 24 시간 또는 하룻밤에 대 한 문화를 품 어.
10. 문화에서 문화 매체 0.7-1 잘 바꿉니다 mL KSR 매체. (문화 표면 공기에 노출 한다) 문화 삽입에서 매체를 완전히 제거 합니다. 1-2 주에 대 한 문화를 품 어. 일주일에 2 번 잘 문화에서 매체를 변경 합니다.
    참고: (상위 레이어 구성 keratinocytes) 문화 표면 위의 중간 수준 상승을 못하게 합니다. 항상 문화 표면 건조 유지.

2. 부상된 GTE (그림 1B)의 준비

1. 1-3 m m 직경 조직 주먹을 준비 합니다. 20 분 동안 121 ° C에 압력솥으로 소독.
2. 밀어 조직 주먹 수직 GTE 300 µ m 깊이 대 한 그리고 상처를 시뮬레이션 하기 위해 조직에 구멍을 펀치.
3. 이 단계에서 부상된 GTE를 사용 하 여 상처 치유 및 조직 재생을 조사. 또는, GTE 조직학 분석을 수행 하기 위해 10% 포 르 말린 중립 버퍼 솔루션을 사용 하 여 수정 합니다.

3. 염증 GTE (iGTE) (그림 1B)의 준비

1. 이전 보고서⁹에 따르면 THP-1 세포 배양.
2. 10% 혼합 콜라겐 타입-A의 젤 집중 RPMI 1640, 10% 재건 버퍼 (2.2 g NaHCO₃ 및 4.47 g HEPES 100 ml 0.05 N NaOH)과 10 ng/mL PMA. 사용까지 얼음에 혼합된 콜라겐 솔루션을 유지.
3. 수 1-2 x 10⁶ THP-1 세포와 190 x g.에서 4 분 동안 원심 분리기 혼합된 콜라겐 솔루션의 1 mL에 셀을 일시 중단 합니다. 다음 단계까지 얼음에 혼합물을 유지.
4. GTE의 부상된 지역으로 10-30 µ L THP-1-콜라겐 혼합물을 추가 합니다. 0.7-1 문화 매체를 대체 PMA의 10 ng/mL를 포함 하는 mL KSR 매체.
5. 5% CO₂ 72 h에 대 한 37 ° C에서 습도 분위기에서 혼합물을 품 어.
6. 치은 염 이나 치 주 질환 조사에 대 한 모델을 사용 하 여 (예를 들어 추가 잠재적인 항 염증 제 약 cytokine 릴리스¹⁰에 그것의 효과 볼 수 iGTE). 또는, 72 h PMA 처리를 생략 2 µ g/mL LPS의 문화에 추가 하 고 조직 5% CO₂ 48 h^11,1237 ° C에서 습도 분위기에서 품 어.

4. 고정 및 전체 마운트 Immunostaining GTE와 iGTE의 문화

1. 문화는 고정
   1. 24-잘 접시에서 문화 매체를 제거 합니다. 워시 버퍼 인산 염 (PBS)와 2 회 조직.
   2. 문화를 잘 10% 포 르 말린 중립 버퍼 솔루션 삽입 하 고 1 mL의 1 mL를 추가 합니다. 하룻밤 냉장고에서 4 ° C에 24-잘 접시를 남겨 주세요.
   3. 다음 날 10% 포 르 말린 중립 버퍼 솔루션을 제거 합니다.
   4. 전체 산 immunostaining에 대 한 고정 후 PBS로 3-4 회 조직을 씻어.
   5. 되며 오신 (H & E) 얼룩 및 일반 immunostaining, 탈수, 파라핀 포함, 및 단면 진행.
      참고: 전체 산 immunostaining에 대 한이 단계를 생략할 수 있습니다.
2. 전체 마운트 immunostaining
   참고:이 프로토콜 참조 13에서에서 수정 되었습니다.
   1. 3 조직 세척 PBS 0.5-1에서에서 x % 트리톤, 10-30 분 각 시간.
   2. 블로킹 버퍼에서 30 분 동안 두 번 조직을 품 어 (PBS 1% 트라이 톤 + 10 %BSA), 실내 온도에.
   3. 블로킹 버퍼, 5-10 분 때마다 조직 2 ×를 씻어.
   4. 삽입에 필요한 희석/농도에서 1 차적인 항 체 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다. 얇은 플라스틱 집착 영화를 사용 하 여 조직에 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 삽입 하.
   5. 4 ° c.에 1 ~ 2 일에 대 한 조직을 품 어
   6. 씻어 조직 3 번, PBS에서 30 분 1% 트라이 톤 + 10 %BSA. 씻어 PBS에서 5 분, 3 번 다시 1% 트라이 톤.
   7. 블로킹 버퍼에 이차 항 체의 50 µ L를 추가 (PBS 1% 트라이 톤 + 10 %BSA) 및 각 삽입을 Hoechst 33342 솔루션 (NucBlue 라이브 셀 얼룩)의 5 µ L. 얇은 플라스틱 집착 영화를 사용 하 여 조직에 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 삽입 하.
   8. 4 ° c.에 1 ~ 2 일 동안 품 어 젖은 종이 타월에 24-잘 접시를 포장 하 고 보육 전반에 걸쳐 사용을 비닐 팩에 넣어.
   9. PBS 1% 트라이 톤에서 10 분 조직 3 번 씻어
   10. 날카로운 바늘을 사용 하 여 얻을 조직 문화 삽입의 막 잘라. 장소는 슬라이드에 막입니다.
       참고: 조직 막에 있어야 한다.
   11. 형광 마운트 매체의 2-3 방울을 추가 합니다. 커버 글라스와 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 조직 분석까지 커버.
   12. Confocal 레이저 스캐닝 현미경 (LSM) 조직 보기

결과

HaCaT 세포 단계 대조 현미경 관찰 (그림 2A)에서 전형적인 keratinocyte 형태 표시. 전자 현미경 (SEM) 이미지 스캐너 HaCaT 세포 표면 많은 microvilli에 의해 덮여 있었다 보였다. HaCaT 세포 사이의 세포 연결 막 프로세스 (그림 2B)에 의해 중재 했다. HaCaT 세포 gingival 상피 마커 K8/18¹⁴, HaCaT 세포 적합 gingiva 재건 (

토론

이 프로토콜 gingival 조직 등가물 및 이전 보고서^8,,2122에 의해 설명 된 피하 지방 조직 등가물을 만드는 방법을 기반으로 합니다. 이 간단 하 고 쉬운 방법 이지만, 일부 단계 특별 한 주의가 필요 합니다. 예를 들어 콜라겐 혼합 솔루션에서 젤 형성을 피하기 위해 사용 될 때까지 얼음에 유지 되어야 한다. 문화 삽입으로 콜라겐 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen type I-A	Nitta Gelatin Inc		For making dermis of GTE
MEM-alpha	Thermo Fisher Scientific	11900073	Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm	Corning, Inc.	353096	For tissue culture
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Cell culture reagent
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31600034	Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Cell culture reagent
Tissue puncher	Shibata system service co., LTD	SP-703	For punching holes in GTE
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	31800022	Cell culture medium
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)	Thermo Fisher Scientific	R37605	For labeling nuclei
Fluorescence mount medium	Dako		For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3]	abcam	ab17139	For identifying epithelium
Scaning electron microscope	Hitachi, Ltd.	HITACHI S-4000	For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy	LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.	LSM 700	For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody	abcam	ab52625	For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody	abcam	ab92547	For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody	Millipore	CBL271	For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody	Sigma-Aldrich	SAB2700244	For identifying macrophages
Human CD14 Antibody	R&D Systems	MAB3832-SP	For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody	Thermo Fisher Scientific	A11012	For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11001	For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific		For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells	Riken BRC cell bank	RCB1189	For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)	Sigma-Aldrich	P8139	For differentiatting THP-1 cells