JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol amacı bir enflamatuar insan jinjiva modeli içinde vitrooluşturmaktır. Bu doku model insan hücreleri, HaCaT keratinositler, dişeti fibroblastlar ve THP-1 makrofajlar, üç boyutlu koşullar altında üç tür ortak yetiştirerek. Dişeti iltihabı ve periodontitis gibi periodontal hastalıkların araştırılması için bu modeli uygulayabilirsiniz.

Özet

Periodontal (dişeti iltihabı ve periodontitis gibi) Yetişkin diş kaybına önde gelen nedenleri hastalıklardır. Periodontal hastalıkların temel Fizyopatoloji jinjiva içinde iltihabıdır. Geçerli modeller periodontal hastalıkların hayvan türleri içinde kurulmuştur. Ancak, hayvan modelleri Fizyopatoloji insanların, hücresel ve moleküler mekanizmaları analiz etmek ve periodontal hastalıklar için yeni ilaçların değerlendirmek üzere farklıdır. Burada, jinjiva (iGTE) vitroinsan inflamatuar doku karşılıkları yeniden inşa için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. İlk insan dokusu karşılıkları jinjiva (GTE) insan hücreleri, insan dişeti fibroblastlar (HGF) ve insan derisi epidermal keratinositler (HaCaT), üç boyutlu koşullar altında da dahil olmak üzere iki tür kullanarak oluşturmak. Biz bir yara modeli GTE içinde bir delik açacak bir doku zımba kullanarak oluşturun. Kollajen jel ile karışık sonraki, insan THP-1 monosit GTE delik içine enjekte edilir. Tarafından adimistration 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) için 72 h THP-1 hücreleri ayrıştırılan GTE (iGTE) formu inflamatuar foci için makrofajlar içine (IGTE da-ebilmek var olmak stumilated ile 2 µg/mL lipopolisakkaritler (LPS) inflamasyonu başlatmak 48 saat ). IGTE inflamatuar jinjiva insan hücreleri ile üç boyutlu bir mimarisi kullanarak ilk vitro modeldir. IGTE periodontal hastalıklarda önemli patolojik değişiklikler (immunocytes hareket, fibryoblasts, epitel hücreleri, monosit ve makrofajlar arasında hücre içi etkileşimleri) yansıtır. GTE, yaralı GTE ve iGTE yara iyileşmesi çalışmaya çok yönlü araçlar, doku yenilenmesi, iltihap, hücre-hücre etkileşim ve ekran potansiyel ilaç periodontal hastalıklar için kullanılabilir.

Giriş

Yetişkin diş kaybına önde gelen nedenidir periodontal hastalıklardır. Dişeti iltihabı ve periodontitis en yaygın periodontal hastalıklardır. Her iki mevcut biyofilm aracılı akut veya kronik inflamatuar değişiklikler jinjiva. Periodontitis genellikle kronik inflamasyon sunar, ancak dişeti iltihabı akut iltihabı ile karakterizedir. Histolojik düzeyde, örneğin makrofajlar, lenfositler, plazma hücreleri ve mast hücreleri1,2bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu bakteriyel bileşenleri tetikler. Bu bağışıklık hücreleri, özellikle makrofajlar, (dişeti epitel hücreleri, fibroblastlar, endotel hücreleri ve dokusunu da dahil olmak üzere) yerel hücreleri ile etkileşim periodontal doku3,4inflamatuar lezyonlar sonuçlanan. Periodontal hastalıkların deneysel modeller, fare gibi hayvanlar çeşitli kurulmuştur hamster, tavşan, yaban gelinciği, köpek dişleri ve primatlar. Ancak, hayvan modelleri Fizyopatoloji insanların, hücresel ve moleküler mekanizmaları analiz etmek ve periodontal hastalıklar5yeni ilaçların değerlendirmek üzere farklıdır. Periodontal bakteri ve monolayer insan sözlü epitel hücreleri co ekimi periodontal hastalık6mekanizmasının araştırmak için kullanılmıştır. Yine de, sözlü hücre kültürleri monolayer üç boyutlu (3D) hücresel mimarisi sağlam doku eksikliği; Bu nedenle, vitro durumu taklit edemez.

Burada, jinjiva (iGTE) 3D inflamatuar insan dokusu karşılıkları periodontal hastalıklar vitrotemsil etmek üzere oluşturulur. Bu 3D model periodontal hastalıkların monolayer hücre kültürleri ve hayvan modelleri arasında orta bir konuma sahiptir. İnsan hücreleri HaCaT keratinositler, dişeti fibroblastlar ve THP-1 makrofajlar, dahil olmak üzere, üç tür ortak kollajen jel üzerinde ekili ve iGTE oluşturmak için inflamatuar başlatıcıları tarafından uyarılmış. IGTE yakından hücre farklılaşması, hücre-hücre etkileşim ve makrofaj etkinleştirme jinjiva ' vivo şartları simüle. Bu model birçok olası uygulama tarama ve yeni farmakolojik yaklaşımlar periodontal hastalıklarda test ilaç için hem de hücresel ve moleküler mekanizmaları yara iyileşmesi, inflamasyon ve doku rejenerasyonu analiz etmek için vardır.

Protokol

Bu iletişim kuralı insan dişeti dokusu karşılıkları, diş eti yara modelleri ve gingivitis modelleri oluşturmak için tasarlanmıştır. İnsan derisi epidermal keratinositler (HaCaT) tür Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Almanya)7Profesör Norbert E. Fusenig temin edilmiştir. İnsan dişeti fibroblastlar (HGFs) daha önce yayımlanan protokolleri8göre dişeti dokuları yalıtılmış. Aydınlatılmış onam önceden elde ve çalışma Etik Komitesi, Nippon diş Üniversitesi School of hayat diş hekimliği Tokyo tarafından belirlenen esaslarına göre kabul edildi (yetki numarası: NDU-T2012-35). Protokol 1-3 adımları bir hücre kültür mahallede yapılmalıdır.

1. hazırlanması jinjiva (GTE) (şekil 1A) 3D insan dokusu karşılıkları

  1. Mix kollajen tipi ı-A jel % 10 ile konsantre MEM-Alfa ve % 10 imar arabellek (2,2 g NaHCO3 ve 100 ml 0,05 4,47 g HEPES N NaOH) pipetting tarafından bir 15 mL steril tüp. Karışık kollajen çözüm kullanana kadar buz üzerinde tutun.
  2. 24-şey kültür ekler (gözenek boyutu 3.0 µm) 24-şey plaka yerleştirin.
  3. HGFs % 0.25 tripsin-EDTA çözüm kullanarak kültür yüzeyden kaldırın. Kültür orta A 10 mL hücrelerde askıya alma (MEM-Alfa + %20 FBS + %1 GlutaMAX). Hücreleri tarafından Bürker-Türk hücre sayaç sayar.
    1. Hücre (1-5 x105 hücre/mL) istenen miktar ayıklamak sonra 190 x g de 4 dk santrifüj kapasitesi.
    2. Karışık kollajen çözüm hücrelerde askıya alma. Buz üzerinde karışımı sonraki adım kadar tutun.
  4. Hücre-kollajen karışımı (0.5-2.5 x 105 hücreleri/de) 0.5 mL herhangi bir kabarcıklar üretmeden kültür sokmak içine ekleyin. 10 – 30 dk % 5 CO2 37 ° C'de karışımı bir jel koagüle oksijen bir ortamda karışımı kuluçkaya.
    Not: eşit olmayan kollajen jel oluşumunu önlemek için kültür ekleme merkezi haline kollajen karışımı ekleyin.
  5. 1 mL kültür ortamının iyi ve 0.5 mL eklemek içine içine ekleyin. Kültür plaka 24 h için kuluçkaya veya bir oksijen bir atmosferde 37 ° C'de % 5 CO2 gece
  6. HaCaT hücre kültür yüzeyden %0.25 tripsin-EDTA çözeltisi kullanarak kaldırma. 10 mL orta B hücreleri askıya alma (DMEM + %10 FBS + %1 GlutaMAX) ve hücreleri saymak. Özü hücreleri (105 hücre/mL x 1 – 5) bir pipet, 190 x g., 4 dk santrifüj ile gerekli miktar askıya orta b hücreleri
  7. Orta aspirasyon tarafından HGF-kollajen karışımı içeren kültür ekler kaldırın. 0.5 mL HaCaT hücre süspansiyon (0.5-2.5 x 105 hücreleri/de) üst kısmında HGF-kollajen karışımı ekleyin. 24 saat veya gece boyunca kültürler kuluçkaya.
    Not: Kültür eklemek içinde orta orta B. gerekirken bu zaman noktada orta kültür de orta A, olmalıdır
  8. KSR orta (ortak kültür orta) ile Kültür orta yerine (MEM-Alfa + %15 nakavt Serum değiştirme + %1 GlutaMAX) + % 5 FBS. Kültür ortamının 1 mL de ve kültür Ekle içine 0.5 mL kültürün içine ekleyin. 24-48 h için kültürler kuluçkaya.
  9. Kültür orta yerine KSR orta + % 1 ile FBS. İyi kültür içine 1 mL ve kültür Ekle içine 0.5 mL ekleyin. 24 saat veya gece boyunca kültürler kuluçkaya.
  10. Kültür Kültür orta de 0.7-1 ile yerine mL KSR orta. Orta tamamen (kültür yüzey havaya maruz) kültür Ekle Kaldır. Kültürler için 1 – 2 hafta kuluçkaya. Haftada iki kez de kültür orta değiştirin.
    Not: Orta seviye Yükselişi (üst katman keratinositler oluşan) kültür yüzey üzerinde izin vermeyin. Her zaman kültür yüzey kuru tutun.

2. yaralı GTE (şekil 1B) hazırlanması

  1. 1-3 mm çap doku zımba hazırlayın. 20 dk için 121 ° C'de bir otoklav ile sterilize.
  2. Doku zımba dik GTE 300 µm hakkında derin bas. ve doku bir yara benzetimini yapmak için bir delik yumruk.
  3. Bu adımda, yaralı GTE yara iyileşmesi ve doku rejenerasyonu soruşturma için kullanın. Alternatif olarak, histolojik Çözümlemeyi gerçekleştirmek için % 10 formalin tarafsız tampon çözüm kullanarak GTE düzeltmek.

3. inflamatuar GTE (iGTE) (şekil 1B) hazırlanması

  1. THP-1 hücreleri önceki rapor9göre yetiştirmek.
  2. Mix kollajen tipi ı-A jel % 10 ile konsantre RPMI 1640, % 10 imar arabellek (2,2 g NaHCO3 ve 100 ml 0,05 4,47 g HEPES N NaOH) ve 10 ng/mL PMA. Karışık kollajen çözüm buz üzerinde kullanımda kadar devam.
  3. Sayısı 1-2 x 106 THP-1 hücreleri ve 190 x g., 4 dk santrifüj 1 mL karışık kollajen çözeltisi hücrelerde askıya alma. Buz üzerinde karışımı sonraki adım kadar tutun.
  4. 10-30 µL THP-1-kollajen karışımı GTE yaralı bölgeye ekleyin. 0.7-1 Kültür ortamına yerine mL KSR orta PMA 10 ng/mL içeren.
  5. 72 h 37 ° C'de % 5 CO2 ile oksijen bir ortamda karışımı kuluçkaya.
  6. Dişeti iltihabı veya periodontal hastalık araştırma modeli kullanın (örneğin, potansiyel anti-inflamatuar ilaç iGTE sitokin yayın10üzerindeki etkilerini görmek için ekleyin). Alternatif olarak, 72 h PMA-tedavi atlarsanız, 2 µg/mL LPS kültür içine ekleyin ve doku oksijen bir atmosferde % 5 CO2 48 h11,1237 ° C'de kuluçkaya.

4. fiksasyon ve GTE ve iGTE bütün Mount Immunostaining kültürler

  1. Fiksasyon kültürlerin.
    1. Kültür orta 24-şey plaka kaldırın. Doku 2 kez fosfat tamponlu tuz (PBS) ile yıkayın.
    2. 1 mL % 10 formalin tarafsız tampon çözeltisi için INSERT ve 1 mL de kültür için ekleyin. 24-şey plaka gece 4 ° C'de bir buzdolabında bırakın.
    3. % 10 formalin tarafsız tampon çözüm ertesi gün kaldırın.
    4. Bütün Dağı immunostaining için 3 - 4 kez PBS ile doku fiksasyon sonra yıkayın.
    5. Hematoksilen Eozin (H & E) Boyama ve düzenli immunostaining için dehidratasyon, parafin gömme ve kesit ile devam edin.
      Not: Bütün Dağı immunostaining için bu adımı ihmal edilebilir.
  2. Bütün Dağı immunostaining
    Not: Bu protokol başvurusu 13 bir değişiklik yapıldı.
    1. Doku 3 yıkama PBS 0.5-1 x % Triton, 10-30 dakika her zaman.
    2. Belgili tanımlık doku 30 dk içinde engelleme arabellek için iki kez kuluçkaya (PBS %1 Triton + % 10 BSA), oda sıcaklığında.
    3. Doku 2 × engelleme arabellekte, 5-10 dk her zaman yıkama.
    4. Birincil antikor çözüm 50 µL gerekli seyreltme/toplama Ekle için ekler. Bir ince plastik sarılmak film doku kurutma önlemek için ekler sarmak için kullanın.
    5. 1-2 gün 4 ° C'de doku kuluçkaya
    6. Dokular yıkama 3 kez, 30 dk içinde PBS için % 1 Triton + % 10 BSA. Tekrar 3 kez, 5 dakika içinde PBS için % 1 yıkama Triton.
    7. İkincil antikor 50 µL engelleme arabellekte ekleyin (PBS %1 Triton + % 10 BSA) ve 5 µL Höchst 33342 çözüm (NucBlue canlı hücre leke) her ekleme. Bir ince plastik sarılmak film doku kurutma önlemek için ekler sarmak için kullanın.
    8. 1-2 gün 4 ° C'de kuluçkaya 24-şey plaka bir ıslak kağıt havlu sarın ve daha sonra kuluçka kullanılacak plastik bir paket içine koydu.
    9. Dokular için PBS % 1 triton 10 min 3 kez, yıkama
    10. Keskin iğne doku almak için kültür Ekle membran kesmek için kullanın. Membran bir slayt üzerine yerleştirin.
      Not: Doku membran üzerinde olmalıdır.
    11. Floresans Dağı orta 2-3 damla ekleyin. Bir cam ve karanlıkta 4 ° C'de mağaza ile doku analizi kadar kapsar.
    12. Doku mikroskobu (LSM) tarama confocal lazer ile görüntüleyin.

Sonuçlar

HaCaT hücreler tipik keratinosit Morfoloji faz kontrast mikroskobik gözlem (şekil 2A) altında görüntülenir. Tarayıcı elektron mikroskobik (SEM) görüntüleri HaCaT hücre yüzeyler tarafından birçok microvilli kaplıydı gösterdi. Hücreler arası bağlantıları HaCaT hücreleri arasındaki membran işlemler (şekil 2B) tarafından aracılık. HaCaT hücreleri HaCaT hücreleri jinjiva imar (şek...

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı dişeti doku eşdeğerleri ve deri altı yağ dokusu eşdeğerleri önceki raporlar8,21,22tarafından açıklanan oluşturma yöntemleri temel alır. Bu basit ve kolay bir yöntem olmasına rağmen bazı adımlar özel dikkat gerektirir. Örneğin, kollajen karışımı buz üstünde jel oluşumu çözüm önlemek için kullanım kadar tutulmalıdır. Kollajen karışımı içine kültür ekleme eklerken, ç...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Teşekkürler

Bu eser kısmen bilim promosyon (JSP'ler) Grant-in-Aid için bilimsel araştırmalar (26861689 ve 17 K 11813) Japonya Derneği tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Bay Nathaniel Green proofreading için teşekkür etmek istiyorum.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Collagen type I-ANitta Gelatin IncFor making dermis of GTE
MEM-alphaThermo Fisher Scientific11900073Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μmCorning, Inc.353096For tissue culture
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Cell culture reagent
DMEMThermo Fisher Scientific31600034Cell culture medium
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828028Cell culture reagent
Tissue puncherShibata system service co., LTDSP-703For punching holes in GTE
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific31800022Cell culture medium
BSASigma-AldrichA3294For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)Thermo Fisher ScientificR37605For labeling nuclei
Fluorescence mount mediumDakoFor mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3]abcamab17139For identifying epithelium
Scaning electron microscopeHitachi, Ltd.HITACHI S-4000For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopyLSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.LSM 700For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibodyabcamab52625For identifying epithelium
Anti-vimentin antibodyabcamab92547For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibodyMilliporeCBL271For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibodySigma-AldrichSAB2700244For identifying macrophages
Human CD14 AntibodyR&D SystemsMAB3832-SPFor identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibodyThermo Fisher ScientificA11012For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibodyThermo Fisher ScientificA11001For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging SystemThermo Fisher ScientificFor observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cellsRiken BRC cell bankRCB1189For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)Sigma-AldrichP8139For differentiatting THP-1 cells

Referanslar

  1. Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease. Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).
  2. Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage. Frontiers in Immunology. 3, 118 (2012).
  3. Koh, T. J., DiPietro, L. A. Inflammation and wound healing: The role of the macrophage. Expert reviews in molecular medicine. 13, e23 (2011).
  4. Mescher, A. L. Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration. Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).
  5. Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. Experimental Animal Models in Periodontology: A Review. The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).
  6. Han, Y. W., et al. Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells. Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).
  7. Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
  8. Xiao, L., Miwa, N. Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment. Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).
  9. Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  10. Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease. J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).
  11. Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  12. Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages. BMC Immunol. 8, 1 (2007).
  13. Shetty, S., Gokul, S. Keratinization and its disorders. Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).
  14. Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study. J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).
  15. Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease. J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).
  16. Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).
  17. Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).
  18. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  19. Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. Vimentin is secreted by activated macrophages. Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).
  20. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system. Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).
  21. Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent. Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 134boyutlu k lt rjinjiva e de erleriinsan di eti fibroblastlarHaCaT h creleriTHP 1 h crelermakrofajlardoku M hendisli iinflamatuar doku modelgingivitisperiodontitisyara iyile mesidoku yeniden olu turma i lemi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır