Dreidimensionale entzündliche menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva

Zusammenfassung

Das Ziel des Protokolls ist eine entzündliche menschlichen Gingiva Modell in Vitrozu bauen. Dieses Gewebe Modell pflegt Co drei Arten von menschlichen Zellen, HaCaT Keratinozyten, gingival Fibroblasten und THP-1 Makrophagen, dreidimensionalen Bedingungen. Dieses Modell kann angewendet werden, für die Untersuchung von parodontaler Erkrankungen wie Gingivitis und Parodontitis.

Zusammenfassung

Parodontale Erkrankungen (z.B. Gingivitis, Parodontitis) sind die führenden Ursachen für Zahnverlust bei Erwachsenen. Entzündung im Zahnfleisch ist die grundlegende physiopathologie der Parodontalerkrankungen. Aktuelle experimentelle Modelle der Parodontalerkrankungen entstanden in verschiedenen Arten von Tieren. Die Physiopathologie von Tiermodellen ist jedoch anders als die des Menschen, macht es schwierig, zelluläre und molekulare Mechanismen zu analysieren und bewerten neue Medikamente für parodontale Erkrankungen. Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Rekonstruktion von entzündlichen Gewebe Entsprechungen des Zahnfleisches (iGTE) in Vitro. Wir erstellen zunächst menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva (GTE) durch die Verwendung von zwei Arten von menschlichen Zellen, einschließlich menschliche gingival Fibroblasten (HGF) und menschliche Haut epidermalen Keratinozyten (HaCaT), dreidimensionale Bedingungen. Wir erstellen eine Wunde Modell mithilfe eine Gewebe Puncher, ein Loch in der GTE Punsch. Nächste, menschliche THP-1 Monozyten mit Kollagen Gel gemischt werden in das Loch in der GTE injiziert. Durch Adimistration von 10 ng/mL Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) für 72 h, THP-1-Zellen unterschieden in Makrophagen in Form entzündlicher Herde in GTE (iGTE) (IGTE auch kann sein Stumilated mit 2 µg/mL von Lipopolysacchariden (LPS) für 48 h, Entzündung zu initiieren ). IGTE ist das erste in-vitro- Modell der entzündlichen Gingiva mit menschlichen Zellen mit einer dreidimensionalen Architektur. IGTE spiegelt die wichtigsten pathologische Veränderungen (Immunzellen Activition, intrazellulären Interaktionen zwischen Fibryoblasts, Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen) in parodontale Erkrankungen. GTE, Verwundeten GTE und iGTE dient als vielseitige Werkzeuge, um die Wundheilung zu studieren, Geweberegeneration, Entzündungen, Zell-Zell-Interaktion und Bildschirm mögliche Medikamente für parodontale Erkrankungen.

Einleitung

Parodontale Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Zahnverlust bei Erwachsenen. Gingivitis und Parodontitis sind die häufigsten parodontalen Erkrankungen. Die beiden präsentieren Biofilm-vermittelten akute oder chronische entzündliche Veränderungen im Zahnfleisch. Gingivitis ist geprägt von akuten Entzündungen, während Parodontitis in der Regel als chronische Entzündung präsentiert. Bei der histologischen Ebene ausgelöst bakterielle Komponenten die Aktivierung von Immunzellen, wie Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen und Mastzellen^1,2. Diese Immunzellen, vor allem Makrophagen, interagieren mit lokalen Zellen (einschließlich Zahnfleisch Epithelzellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Osteoblasten) wodurch entzündliche Läsionen im parodontalen Gewebe^3,4. Experimentelle Modelle der Parodontalerkrankungen wurden in verschiedene Arten von Tieren, wie Ratten, Hamster, Kaninchen, Frettchen, Eckzähne und Primaten. Die Physiopathologie von Tiermodellen ist jedoch anders als die des Menschen, macht es schwierig, zelluläre und molekulare Mechanismen zu analysieren und bewerten neue Medikamente von Parodontalerkrankungen⁵. Co-Kultur von parodontale Bakterien und menschlichen mündliche Epithelzellen Monolage wurde verwendet, zu untersuchen, den Mechanismus der parodontalen Infektionen⁶. Dennoch fehlt Monolayer-Kulturen der mündlichen Zellen die dreidimensionale (3D) zelluläre Architektur von intaktem Gewebe; Daher können nicht sie die in-vitro- Situation imitieren.

Hier sind 3D entzündliche menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva (iGTE) gegründet, um parodontale Erkrankungen in Vitrodarstellen. Das 3D-Modell der Parodontalerkrankungen nimmt eine Zwischenstellung zwischen Monolage Zellkulturen und Tiermodellen. Drei Arten von menschlichen Zellen, einschließlich HaCaT Keratinozyten, gingival Fibroblasten und Makrophagen THP-1, sind Co auf Kollagen Gel angebaut und durch entzündliche Initiatoren iGTE bauen stimuliert. IGTE simuliert eng die in-Vivo -Bedingungen der Zelldifferenzierung, Zell-Zell-Interaktion und Makrophagen Aktivierung im Zahnfleisch. Dieses Modell hat viele Einsatzmöglichkeiten für Drug screening und testen neue pharmakologische Ansätze bei parodontalen Erkrankungen sowie zur Analyse von zellulärer und molekularer Mechanismen in der Wundheilung, Entzündung und Regeneration des Gewebes.

Protokoll

Dieses Protokoll soll menschliche Gingiva-Äquivalente, gingival Wunde Modelle und Gingivitis-Modelle zu erstellen. Menschliche Haut epidermalen Keratinozyten (HaCaT) wurden freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Professor Norbert E. Fusenig Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Deutschland)⁷. Menschliche gingivale Fibroblasten (HGFs) waren von gingival Gewebe gemäß den zuvor veröffentlichten Protokolle⁸isoliert. Einwilligung war vorher, und die Studie wurde nach den Richtlinien der Ausschuss Ethik, die Nippon Dental University School of Life Dentistry in Tokio zugelassen (Zulassungsnummer: NDU-T2012-35). Protokoll-Schritte 1 – 3 sollte in einer Zelle Kultur Haube durchgeführt werden.

1. Vorbereitung des 3D menschliches Gewebe Äquivalente der Gingiva (GTE) (Abbildung 1A)

1. MEM-Alpha und 10 % Wiederaufbau Puffer Mix Kollagen Typ-A-Gel mit 10 % konzentriert (2,2 g Nahco3₃ und 4,47 g HEPES in 100 mL 0,05 N NaOH) in einem 15 mL steriles Röhrchen durch pipettieren. Halten Sie die gemischten Kollagen-Lösung auf Eis bis verwendet.
2. 24-Well-Kultur-Einsätze (Pore Größe 3,0 µm) in einer 24-Well-Platte zu platzieren.
3. HGFs von der Kultur-Oberfläche mit 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung entfernen. Aussetzen der Zellen in 10 mL Kulturmedium A (MEM-Alpha + 20 % FBS + 1 % GlutaMAX). Zählen der Zellen durch einen Bürker-Türk-Zelle-Zähler.
   1. Extrahieren Sie die gewünschte Menge an Zellen (1-5 X10⁵ Zellen/mL), dann 4 Minuten bei 190 X g zentrifugieren.
   2. Unterbrechen Sie die Zellen in der gemischten Kollagen-Lösung. Halten Sie die Mischung auf dem Eis erst im nächsten Schritt.
4. Fügen Sie 0,5 mL der Zelle-Kollagen-Mischung (0,5 – 2,5 x 10⁵ Zellen/gut) in der Kultur einfügen ohne Bläschen zu produzieren. Inkubieren Sie die Mischung für 10-30 min in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 ° C zu gerinnen die Mischung in ein Gel.
   Hinweis: Fügen Sie die Kollagen-Mischung in die Mitte der Kultur einfügen ungleiche Bildung von Kollagen Gel zu vermeiden.
5. Fügen Sie 1 mL Kulturmedium in den Brunnen und 0,5 mL in den Einsatz. Inkubation der Kultur-Platte für 24 h oder über Nacht in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 ° C.
6. Entfernen Sie HaCaT-Zellen von der Kultur-Oberfläche mit 0,25 % Trypsin-EDTA-Lösung. Die Zellen in 10 mL Medium B auszusetzen (DMEM + 10 % FBS + 1 % GlutaMAX) und die Zellen zu zählen. Extrakt die benötigte Menge von Zellen (1 – 5 x 10⁵ Zellen/mL) mit einer Pipette, Zentrifuge für 4 min bei 190 X g. auszusetzen, die Zellen in der mittleren B.
7. Entfernen Sie das Medium aus der Kultur-Einsätzen, die durch Absaugen die HGF-Kollagen-Mischung enthalten. 0,5 mL HaCaT Zellsuspension (0,5 – 2,5 x 10⁵ Zellen/Brunnen) auf der Oberseite der HGF-Kollagen-Mischung zugeben. Inkubation der Kulturen für 24 Stunden oder über Nacht.
   Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt sollte das Medium in der Kultur gut mittlere A, werden während des Mediums in der Kultur einfügen sollte mittlere B.
8. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit KSR Medium (Co Kulturmedium) (MEM-Alpha + 15 % Ko-Serum Ersatz + 1 % GlutaMAX) + 5 % FBS. Fügen Sie 1 mL Kulturmedium in die Kultur gut und 0,5 mL in der Kultur einfügen. Inkubation der Kulturen für 24 – 48 h.
9. Ersetzen Sie das Kulturmedium mit KSR Medium + 1 % FBS. Fügen Sie 1 mL in die Kultur gut und 0,5 mL in der Kultur einfügen. Inkubation der Kulturen für 24 Stunden oder über Nacht.
10. Ersetzen Sie das Kulturmedium in der Kultur gut mit 0,7 – 1 mL KSR Medium. Entfernen Sie das Medium vollständig aus dem Kultur einfügen (Kultur-Oberfläche sollte Luft ausgesetzt werden). 1 – 2 Wochen inkubieren Sie der Kulturen. Ändern Sie das Medium in der Kultur auch zwei Mal pro Woche.
    Hinweis: Lassen Sie nicht die mittlere Ebene steigen über der Kultur-Oberfläche (die oberste Schicht aus Keratinozyten). Immer halten Sie die Kultur Oberfläche trocken.

2. Vorbereitung des Verwundeten GTE (Abbildung 1 b)

1. Bereiten Sie eine 1 – 3 mm Durchmesser Gewebe Puncher. Mit einem Autoklaven bei 121 ° C für 20 min zu sterilisieren.
2. Der Gewebe-Puncher senkrecht in GTE über 300 µm Tiefe schieben, und ein Loch in das Gewebe um eine Wunde zu simulieren.
3. Verwenden Sie in diesem Schritt die Verwundeten GTE für die Untersuchung von Wunde heilen und Geweberegeneration. Alternativ zu beheben GTE mit 10 % Formalin neutraler Pufferlösung histologische Analysen durchzuführen.

3. Vorbereitung des entzündlichen GTE (iGTE) (Abbildung 1 b)

1. THP-1-Zellen nach dem vorherigen Bericht⁹zu kultivieren.
2. Mix Kollagen Typ-A-Gel mit 10 % konzentriert RPMI 1640, 10 % Wiederaufbau Puffer (2,2 g Nahco3₃ und 4,47 g HEPES in 100 mL 0,05 N NaOH) und 10 ng/mL PMA. Halten Sie die gemischten Kollagen-Lösung auf dem Eis bis zur Verwendung.
3. Anzahl 1 – 2 x 10⁶ THP-1 Zellen und Zentrifuge für 4 min bei 190 X g. aussetzen der Zellen in 1 mL der Lösung gemischt Kollagen. Halten Sie die Mischung auf dem Eis erst im nächsten Schritt.
4. Fügen Sie 10 – 30 µL THP-1-Kollagen Mischung in den verletzten Bereich der GTE. Ersetzen Sie das Kulturmedium 0,7 – 1 mL KSR 10 ng/mL von PMA-haltigem Medium.
5. Inkubieren Sie die Mischung in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 ° C für 72 h.
6. Verwenden Sie das Modell für die Untersuchung von Gingivitis oder Parodontitis (z. B. hinzufügen potenzielle entzündungshemmendes Medikament iGTE zu sehen, seine Auswirkungen auf die Cytokine Release¹⁰). Alternativ lassen Sie 72 h PMA-Behandlung Weg, fügen Sie 2 µg/mL LPs in die Kultur hinzu und inkubieren Sie das Gewebe in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO₂ bei 37 ° C für 48 h^11,12.

4. Fixierung und ganze montieren Immunostaining GTE und iGTE Kulturen

1. Fixierung der Kulturen.
   1. Entfernen Sie das Kulturmedium aus 24-Well-Platte. Waschen Sie das Gewebe 2 Mal mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   2. Die Kultur gut 1 mL 10 % Formalin neutraler Pufferlösung, die Einlage und 1 mL hinzufügen. Lassen Sie die 24-Well-Platte über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C.
   3. Entfernen Sie die 10 % Formalin neutraler Pufferlösung am folgenden Tag.
   4. Waschen Sie für ganze Berg Immunostaining Gewebe 3-4 Mal mit PBS nach der Fixierung.
   5. Gehen Sie für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung und regelmäßige Immunostaining mit Austrocknung, Paraffin einbetten und schneiden.
      Hinweis: Für ganze Berg Immunostaining kann dieser Schritt entfallen.
2. Ganzen Berg immunostaining
   Hinweis: Dieses Protokoll wurde von der Referenz 13 geändert.
   1. Waschen Sie das Gewebe 3 X in PBS 0,5 – 1 % Triton, 10-30 min jedes Mal.
   2. Inkubieren Sie das Gewebe zweimal für 30 min in blocking-Puffer (PBS 1 % Triton + 10 % BSA), bei Raumtemperatur.
   3. Waschen Sie das Gewebe 2 × in blockierende Puffer, 5 – 10 Minuten jedes Mal.
   4. Fügen Sie 50 µL Primärantikörper Lösung am erforderlichen Verdünnung/Konzentration auf die Einsätze. Verwenden Sie eine dünne Kunststoff Frischhaltefolie wickeln die Einsätze um Austrocknung des Gewebes zu vermeiden.
   5. Inkubieren Sie das Gewebe für 1 bis 2 Tage bei 4 ° c
   6. Waschen Sie das Gewebe 3 Mal für 30 min in PBS 1 % Triton + 10 % BSA. Waschen wieder 3 Mal für 5 min in PBS 1 % Triton.
   7. Fügen Sie 50 µL Sekundärantikörper in blocking-Puffer (PBS 1 % Triton + 10 % BSA) und 5 µL Hoechst 33342 Lösung (NucBlue Live Cell Fleck) für jeden Einsatz. Verwenden Sie eine dünne Kunststoff Frischhaltefolie wickeln die Einsätze um Austrocknung des Gewebes zu vermeiden.
   8. 1 bis 2 Tage bei 4 ° c inkubieren Wickeln Sie die 24-Well-Platte in einem feuchten Papiertuch, und steckte sie dann in ein Kunststoff-Pack im gesamten Inkubation verwendet werden.
   9. Waschen Sie das Gewebe 3 Mal für 10 min in PBS 1 % triton
   10. Verwenden einer spitzen Nadel, schneiden Sie die Membran von der Kultur einfügen, um das Gewebe zu erhalten. Platzieren Sie die Membran auf einer Folie.
       Hinweis: Das Gewebe sollte auf der Membran.
   11. Fügen Sie 2 – 3 Tropfen Fluoreszenz Mount Medium. Decken Sie das Gewebe mit einem Deckglas und Speicher bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Analyse.
   12. Zeigen Sie Gewebe mit einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskopie (LSM an).

Ergebnisse

HaCaT-Zellen angezeigt typische Keratinozyten Morphologie unter Phasenkontrast-mikroskopische Beobachtung (Abbildung 2A). Scanner Elektron mikroskopische (SEM) Bilder zeigten, dass viele Mikrovilli HaCaT Zelloberflächen abgedeckt wurden. Interzelluläre Verbindungen zwischen HaCaT-Zellen wurden durch Membranverfahren (Abb. 2 b) vermittelt. HaCaT-Zellen ausgedrückt gingivalen Epithel Marker K8/18¹⁴, darau...

Diskussion

Dieses Protokoll basiert auf Methoden der Schaffung von Gingiva-äquivalente und Subkutane Fettgewebe Äquivalente von vorherigen Berichte^8,21,22beschrieben. Obwohl dies eine einfache und einfache Methode, erfordern einige Schritte besondere Aufmerksamkeit. Beispielsweise sollte die Kollagen-Mischung auf dem Eis bis zur Verwendung, Gelbildung in der Lösung zu vermeiden gehalten werden. Wenn die Kollagen-Mischung in das Kultur e...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen type I-A	Nitta Gelatin Inc		For making dermis of GTE
MEM-alpha	Thermo Fisher Scientific	11900073	Cell culture medium
Cell Culture Insert (for 24-well plate), pore size 3.0 μm	Corning, Inc.	353096	For tissue culture
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Cell culture reagent
DMEM	Thermo Fisher Scientific	31600034	Cell culture medium
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Cell culture reagent
Tissue puncher	Shibata system service co., LTD	SP-703	For punching holes in GTE
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	31800022	Cell culture medium
BSA	Sigma-Aldrich	A3294	For immunostaining
Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)	Thermo Fisher Scientific	R37605	For labeling nuclei
Fluorescence mount medium	Dako		For mounting samples after immunostaining
Anti-Cytokeratin 8+18 antibody [5D3]	abcam	ab17139	For identifying epithelium
Scaning electron microscope	Hitachi, Ltd.	HITACHI S-4000	For observing samples' surface topography and composition
Confocal laser scanning microscopy	LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.	LSM 700	For observing samples' immunofluorescence staining
Anti-Cytokeratin 19 antibody	abcam	ab52625	For identifying epithelium
Anti-vimentin antibody	abcam	ab92547	For identifying fibroblasts and activated macrophages
Anti-TE-7 antibody	Millipore	CBL271	For identifying fibroblasts in the dermis
Anti-CD68 antibody	Sigma-Aldrich	SAB2700244	For identifying macrophages
Human CD14 Antibody	R&D Systems	MAB3832-SP	For identifying macrophages
Alexa Fluor 594-conjugated secondary goat anti-rabbit antibody	Thermo Fisher Scientific	A11012	For immunofluorescence staining
Alexa Fluor 488-conjugated secondary goat anti-mouse antibody	Thermo Fisher Scientific	A11001	For immunofluorescence staining
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Fisher Scientific		For observing the sample's immunofluorescence staining
THP-1 cells	Riken BRC cell bank	RCB1189	For making iGTE
PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)	Sigma-Aldrich	P8139	For differentiatting THP-1 cells