Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Resumen

Aquí, presentamos dos protocolos para la medición de mitocondrial Ca^{2 +} afluencia en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Para mitocondrias aisladas, detallamos una placa base de lector Ca^{2 +} importación de ensayo utilizando el Ca^{2 +} sensible tinte verde-5N de calcio. Para las células cultivadas, se describe un método de microscopia confocal con el Ca^{2 +} tinte Rhod-2/AM.

Resumen

CA^{2 +} por las mitocondrias es una función crítica, regulación de procesos fisiológicos y patofisiológicos en un amplio espectro de células. La capacidad para medir con precisión el influjo y eflujo de Ca^{2 +} de las mitocondrias es importante para determinar el papel de mitocondrial Ca^{2 +} en estos procesos. En este informe, presentamos dos métodos para la medición de mitocondrial Ca^{2 +} manejo en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Primero detallamos una placa lector plataforma para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorción utilizando el Ca^{2 +} tinte sensible calcio verde-5N. El formato de placa base de lector evita la necesidad de equipos especializados, y el tinte verde-5N de calcio es ideal para la medición de Ca^{2 +} de las mitocondrias del tejido aislado. Para nuestra aplicación, describimos la medida capta el Ca^{2 +} mitocondrial en mitocondrias aisladas de tejido de corazón de ratón; sin embargo, este procedimiento puede aplicarse para medir mitocondrial absorción de Ca^{2 +} en la mitocondria aislada de otros tejidos como hígado, músculo esquelético y cerebro. En segundo lugar, describimos un análisis basado en la microscopía confocal para medición de mitocondrial Ca^{2 +} en células permeabilized con el Ca^{2 +} sensible tinte Rhod-2/AM y proyección de imagen usando microscopía de escaneo láser 2 dimensiones. Este protocolo de permeabilización elimina la contaminación citosólica de tinte, que permiten grabación específica de cambios mitocondriales Ca^{2 +}. Por otra parte, microscopía de escaneo láser permite velocidades de fotogramas alta capturar cambios rápidos de mitocondrial Ca^{2 +} en respuesta a diferentes drogas o reactivos aplicados en la solución externa. Este protocolo se puede aplicar para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorción en muchos tipos de células incluyendo células primarias como las neuronas y miocitos cardiacos y líneas celulares inmortalizadas.

Introducción

Las mitocondrias son sitios críticos de almacenamiento de Ca^{2 +} intracelular y la señalización. Décadas de investigación han demostrado que las mitocondrias tienen la capacidad de importar y el secuestro de Ca^{2 + 1,2}. Las mitocondrias, sin embargo, no son meramente pasivos sitios de almacenamiento de Ca^{2 +} . CA^{2 +} en el compartimiento mitocondrial realiza funciones de señalización fundamentales incluyendo la regulación de la producción metabólica y la activación de las vías de muerte celular mitocondrial mediado, que ha sido previamente revisado³. Para la regulación metabólica, Ca^{2 +} aumenta la actividad de Deshidrogenasas matriz localizada tres del ciclo del ácido tricarboxílico, así como complejos de la cadena respiratoria, para aumentar la producción de energía mitocondrial^4,5 . Con sobrecarga de Ca^{2 +} mitocondrial y altera mitocondrial Ca^{2 +} manejo, Ca^{2 +} activa transición de permeabilidad mitocondrial poro abierto (MPTP), llevando a permeabilización de la membrana interna mitocondrial, pérdida potencial de la membrana, la disfunción mitocondrial, inflamación, ruptura y en última instancia, la célula muerte^6,7,8,9. Por lo tanto, Ca^{2 +} señalización mitocondrial impacta directamente la vida celular y vías de la muerte a través de control metabólico y eje de MPTP a la muerte.

En los últimos años, allí ha sido expandiendo rápidamente interés en el estudio de Ca^{2 +} dinámica mitocondrial debido en gran parte a la identificación de los componentes moleculares de la Ca^{2 +} uniporter mitocondrial complejo, un interior mitocondrial importación de transportador de membrana que es un modo primario de Ca^{2 +} en la matriz mitocondrial ^10,11,12. Identificación de estas subunidades estructurales y reguladoras de la uniporter ha traído la posibilidad de apuntar genético mitocondrial Ca^{2 +} afluencia para modulan la función mitocondrial y la disfunción y facilitó el estudio de la contribución de la uniporter complejo mitocondrial Ca^{2 +} afluencia a enfermedad^13,14,15. De hecho, Ca^{2 +} señalización mitocondrial se ha implicado en las patologías de una gran variedad de enfermedades que van desde la enfermedad cardiaca y neurodegeneración, cáncer^{16,17,18, 19,20}.

Dada la importancia fundamental de mitocondrial Ca^{2 +} en el metabolismo y muerte celular y combinado con el amplio alcance de los sistemas biológicos Ca^{2 +} señalización mitocondrial impactos, métodos para evaluar la Ca mitocondrial^{2 +} afluencia son de gran interés. No en vano, se han desarrollado una variedad de técnicas y herramientas para medir mitocondrial Ca^{2 +} . Estos incluyen métodos que utilizan herramientas tales como fluorescente Ca^{2 +}-tintes sensibles^21,22 y genéticamente codificado Ca^{2 +} sensores orientados a la mitocondria, como el cameleon y aequorin^{23, 24}. El objetivo de este artículo es destacar diferentes métodos y sistemas de modelo en el que se puede medir la absorción de Ca^{2 +} mitocondrial. Presentamos dos métodos experimentales para evaluar mitocondrial Ca^{2 +} afluencia capacidad. Utilizando mitocondrias cardiacas como ejemplo, detallamos una placa lector plataforma para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorción utilizando el Ca^{2 +} sensible tinte verde-5N de calcio que es ideal para las mitocondrias aisladas de tejidos¹⁴ . Uso de las células 3T3 NIH cultivadas, también Describimos un análisis de basado en la proyección de imagen de microscopía confocal para medición de mitocondrial Ca^{2 +} en células permeabilized con el Ca^{2 +} sensible tinte Rhod-2/AM²⁵.

Protocolo

Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de Emory.

Nota: La primera parte es el procedimiento experimental para medir mitocondrial Ca^{2 +} entrada en la mitocondria cardiaca aislada usando un lector de placas.

1. los reactivos y soluciones

1. Tomar 500 mL de buffer EGTA MS para aislamiento mitocondrial: manitol de 225 mM, 75 mM sacarosa, ácido-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido de 5 mM 4 (HEPES), 1 mM el glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-ácido tetraacético (EGTA), pH ajustado a 7,4 con KOH. Esterilizar con filtro 0,22 μm y almacenar a 4 ° C. Asegúrese de que el buffer EGTA MS es previamente enfriado a 4 ° C antes de usar.
2. Preparar 100 mL de solución de KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES 1 m m KH₂PO₄, 2 mM de MgCl₂, 40 μM EGTA y pH ajustado a 7.2 con KOH. Almacenar a temperatura ambiente.
3. Preparación de calcio 1 mM verde-5N stock en dimetil sulfóxido (DMSO). El stock de la verde-5N de calcio puede ser alicuotados y almacenado a-20 ° C.
4. Preparación de sustratos para la absorción de Ca^{2 +} .
   1. Preparar el piruvato de sodio de 1 M, pH 7,4. Almacenar en alícuotas a-20 ° C.
   2. Preparar el malato de 500 mM, pH 7,4. Almacenar en alícuotas a-20 ° C.

2. aislamiento de mitocondrias cardiacas

1. Eutanasia el ratón según normas institucionales.
   Nota: Nuestro método institucionalmente aprobados de eutanasia, ratones fueron anestesiados por inhalación isofluorane y sacrificados por dislocación cervical.
2. Recoger el corazón por abrir la cavidad torácica, corte a lo largo de ambos lados de las costillas, que flanquean el corazón, cortando el diafragma y extirpando el tejido del corazón.
   Nota: En el presente Protocolo, se realiza con aislamiento mitocondrial de todo corazón de un ratón adulto (aproximadamente 120 mg), que debe ser suficiente para 3-4 experimentos. Para el aislamiento mitocondrial de otros tejidos ricos en mitocondrias, como el hígado, hasta 200 mg de tejido puede utilizarse siguiendo el protocolo descrito.
3. Enjuague el tejido completamente 25 mL de helado 1 x de tampón fosfato salino (PBS) asegurando que es exprimida toda la sangre de los ventrículos.
   Nota: El corazón se suficientemente efectúe cuando el líquido exprimido del corazón salga limpia.
4. Picar el corazón en trozos pequeños en 5 mL de helado de 1 x PBS utilizando un par de tijeras afiladas.
5. Descartar el PBS y transferencia de tejido de corazón picado a un homogeneizador de dounce previamente refrigerado 7 mL vidrio-teflon con una separación de 0.10 a 0.15 mm.
6. Añadir 5 mL de buffer EGTA MS helada y homogeneizar la muestra hasta piezas de tejido no son visibles (aproximadamente 11 carreras).
   Nota: No homogeneizar demasiado el tejido como el objetivo es obtener las mitocondrias intactas y funcionales.
7. Transferir el homogeneizado en un tubo de 15 mL.
8. Centrifugar el homogeneizado a 600 x g a 4 ° C durante 5 minutos para que sedimenten los núcleos y células intactas.
9. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo 15 mL y centrifugar a 10.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos para que sedimenten las mitocondrias.
10. Deseche el sobrenadante y mantener el pellet mitocondrial en el hielo.
11. Lavar el pellet mitocondrial utilizando doble buffer EGTA MS helada. Para cada colada, Resuspender el precipitado mitocondrial en 5 mL de buffer EGTA MS centrifugar a 10.000 x g a 4 ° C por 10 min y descarte el sobrenadante.
12. Después del último lavado, eliminar el sobrenadante y resuspender las mitocondrias en 100 μL de tampón de EGTA MS frío hielo. Mantenga las mitocondrias en el hielo.
    Nota: Las mitocondrias deben utilizarse para la experimentación dentro de 1 h.
13. Medir la concentración de la proteína mitocondrial mediante un análisis de la proteína de Bradford²⁶.

3. placa base de lector medición de la absorción de calcio mitocondrial

Nota: Aquí, es descrito el protocolo de análisis mitocondrial Ca^{2 +} absorción con un lector multimodo equipados con inyectores. Cualquier lector de la placa con la capacidad de lectura de la fluorescencia verde-5N calcio (excitación/emisión de 506/532 nm) en un modo cinético con reactivo automatizado pueden utilizarse inyectores para mantener la reacción de la luz.

1. Programa lee el lector de placas para realizar una cinética de fluorescencia verde-5N de calcio con mediciones cada segundo por un tiempo de análisis total de 1.000 s. Además, programar los inyectores reactivo para dispensar 5 μL de solución de CaCl₂ en los 30 s, 150 s, 300 s , 480 s, 690 s tiempo puntos y.
   Nota: La sincronización de las inyecciones de CaCl₂ son definidos por el usuario y puede ajustarse a necesidades experimentales.
2. Prime los inyectores del reactivo con la solución de CaCl₂ que se utilizará.
   Nota: La concentración de la solución de CaCl₂ es definido por el usuario y se puede ajustar en posteriores pruebas para valorar la cantidad de Ca^{2 +} requerido para activar apertura del MPTP.
3. Añadir 200 μg de mitocondrias a un pozo individual de una placa bien 96.
4. Añadir el volumen adecuado de amortiguador de KCl al pozo tal que el volumen total de mitocondrias y buffer KCl viene a 197 μL.
5. Añadir 1 μL de piruvato de 1 M y 1 μL de malato de 500 mM a la mezcla de las mitocondrias. Pipetee suavemente a la mezcla e incubar las mitocondrias con los substratos por 2 min a temperatura ambiente para permitir a las mitocondrias ser energizado.
6. Añadir 1 μL del stock de verde-5N de calcio 1 mM. Mezclar suavemente por pipeteo.
   Nota: Proteja la reacción de la luz después de añadir el tinte verde-5N de calcio.
7. Iniciar la pre programado cinética protocolo y monitor calcio verde-5N fluorescencia.

4. reactivos y soluciones

Nota: La segunda parte es un procedimiento experimental para la proyección de imagen confocal de mitocondrial Ca^{2 +} en células cultivadas

1. Hacer solución de Tyrode (130 mM de NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM de glucosa y 10 mM HEPES, pH 7.2 con KOH). Almacenar a 4 ° C. Caliéntelo a temperatura ambiente antes de usar.
2. Preparar solución de lavado (acetato de potasio de 100 mM, 15 mM KCl, 5 m m KH₂PO₄, 5 mM de Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0.12 mM CaCl₂, 0,75 mM MgCl₂, fosfocreatina de 10 mM, 10 mM HEPES, pH 7.2 con KOH). Almacenar a 4 ° C. Caliéntelo a temperatura ambiente antes de usar.
3. Preparar solución de permeabilización, que contiene 0.005% de saponina en la solución de lavado. Preparar diariamente.
4. Preparar 0 Ca^{2 +} solución interna (100 m m acetato de potasio, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM de MgCl₂, 10 mM HEPES, pH ajustado a 7.2 con KOH). Almacenar a 4 ° C. Caliéntelo a temperatura ambiente antes de usar.
5. Preparar la solución interna que contiene Ca^{2 +}. Añadir CaCl₂ a la solución interna arriba para alcanzar la concentración deseada de libre Ca^{2 +}. La cantidad de CaCl₂ añadir se calcula utilizando el programa MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
6. Preparar 1 mM stock Rhod-2/AM en DMSO y almacenar a-20 ° C hasta su uso.
7. Preparar 1 mM MitoTracker verde stock en DMSO y almacenar a-20 ° C hasta su uso.

5. las células de la galjanoplastia para la proyección de imagen

1. Lavar 22 x 22 cm² cubreobjetos de vidrio con etanol al 100% y permite el cubreobjetos a aire seco.
2. Coloque el cubreobjetos de vidrio en pocillos individuales de un plato de cultivo de tejidos bien 6.
   Nota: Cubreobjetos pueden ser cubierto con laminina, poly-L-lisina o matriz similar para promover la fijación de la célula.
3. Trypsinize y las células sobre cubreobjetos con el objetivo de confluencia de 70% aproximadamente en el día de la proyección de imagen de la placa.

6. carga las células con el Rhod-2/AM y MitoTracker Green

1. Preparar Rhod-2/AM-MitoTracker green solución de trabajo. Añadir 20 μL de Rhod-2/AM 1 mM stock, 0,2 μL de MitoTracker stock de verde de 1 mM y 2,5 μL de pluronic 20% F-127 a 1 mL de solución de Tyrode. La concentración final de Rhod-2 en la solución de trabajo es de 20 μm y la concentración final de MitoTracker green es de 200 nM.
2. Suavemente Retire el medio de crecimiento el cubreobjetos.
   Nota: Un paso de lavado no es necesario antes de la adición de solución colorante.
3. Añadir Rhod-2/AM-MitoTracker solución verde de forma gota a gota sobre el cubreobjetos hasta que el cubreobjetos esté a cubierto (aproximadamente 3-4 gotas por cubreobjetos).
4. Incubar durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz para permitir que las células de carga con los tintes.
5. De esterificar Rhod-2/AM. Quite con cuidado el Rhod-2/AM-MitoTracker solución verde, reemplazarlo con solución de Tyrode fresca temperatura e incubar durante 30 min a temperatura ambiente protegido de la luz.

7. proyección de imagen confocal de la Rhod-2/AM mitocondrial MitoTracker fluorescencia

1. Transferir el cubreobjetos al microscopio de cámara y llenar la cámara con solución de lavado.
2. En configuración para observar células en contraste de fase 40 X, ajustar el foco hasta que las células sean visibles y en foco.
3. Permeabilizar la membrana plasmática de Rhod-2/AM-MitoTracker green cargado quitar localizada citosol Rhod-2, conservando el tinte localizada en las mitocondrias de las células.
   1. Quite el cubreobjetos a la solución de lavado.
   2. Reemplazar con solución de permeabilización durante aproximadamente 1 minuto.
   3. Controlar visualmente la morfología de la membrana plasmática a través del proceso de permeabilización. Las células permeabilized desarrollará una superficie rugosa.
   4. Cuando termine la permeabilización, inmediatamente retire la solución de permeabilización y sustituirla por 0 Ca^{2 +} solución interna.
4. Al mismo tiempo la imagen Rhod-2 fluorescencia (excitación usando la 559 nm láser línea y emisión recogido en longitudes de onda entre 575-675 nm) y MitoTracker verde fluorescencia (excitación usando la línea de láser 488nm y emisión en longitudes de onda entre 505-525 nm). Se centran en células permeabilized mostrando un claro colocalización de Rhod-2 y MitoTracker verde.
5. Disminuir el laser microscopio y obtener configuración tales que la fluorescencia de Rhod-2 mitocondrial es débil y apenas visible.
6. Seleccione configuración de microscopio para adquirir 2 dimensiones analiza en un curso de ritmo y tiempo de marco apropiado para la aplicación específica. Se recomienda una velocidad de al menos 30 fotogramas/s para capturar con precisión la cinética de los cambios en mitocondrial Ca^{2 +}.
7. Retire la Ca 0^{2 +} solución interna sin molestar a las células o el enfoque del microscopio.
8. Iniciar la adquisición de la imagen.
9. Añadir Ca^{2 +}-solución interna repleta en el momento de s 10 punto ya sea manualmente o con un sistema de perfusión.
10. Seleccione las regiones de interés (ROIs) para abarcar regiones de colocalización entre Rhod-2 mitocondrial y MitoTracker verde señal en el software de adquisición de imagen.
    Nota: Se obtienen valores de fluorescencia arbitraria (F) para cada momento de la grabación de cada retorno de la inversión. Estos valores son antecedentes restan y normalizado a la fluorescencia inicial (antes de Ca^{2 +} adición; F₀) y graficados como F/F₀ en el tiempo para la presentación de datos y cuantificación de la amplitud del cambio de mitocondrial Ca^{2 +}.

Resultados

La figura 1 muestra mitocondrial Ca^{2 +} mediciones de absorción en la mitocondria cardiaca aislada utilizando la plataforma de placa base de lector y el Ca^{2 +} calcio verde-5N del tinte. Bajo condiciones de control (figura 1A), mitocondria cardiaca fueron suspendida en tampón de KCl que contiene calcio verde-5N y luego desafiado con pulsos secuenciales de CaCl₂ (5 μL de una solución de CaCl_...

Discusión

Aquí, describimos a dos enfoques diferentes para medir mitocondrial Ca^{2 +} afluencia. Placa lector basado en calcio verde-5N método monitores extramitochondrial Ca^{2 +} niveles y es un Ca^{2 +} absorción ensayo que es ideal para mediciones en mitocondrias aisladas. Aunque hemos mostrado resultados representativos de aislados murino mitocondria cardiaca, este ensayo puede ser fácilmente adaptado para las mitocondrias aisladas de tejidos con alta abundancia mitocondrial incluyendo hígado, m?...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440