ミトコンドリアの分離と培養細胞におけるミトコンドリアのカルシウム流入の解析

要約

ここでは、ミトコンドリアの分離および培養細胞のミトコンドリアの Ca^{2 +}流入の測定のための 2 つのプロトコルを提案する.我々 のプレート リーダー ベース Ca^{2 +}インポート詳細分離ミトコンドリアの試金を使用して、Ca^{2 +}敏感なカルシウム グリーン-5N を染めます。培養細胞の Ca^{2 +}染料ロード-2/AM を用いた共焦点顕微鏡法について述べる。

要約

Ca^{2 +}ミトコンドリアによって処理細胞の広範なスペクトルでの生理学的および病態生理学的プロセスを調節する重要な機能です。Ca^{2 +}ミトコンドリアからの流出や流入を正確に計測する能力は、ミトコンドリア Ca^{2 +}これらのプロセスでの処理の役割を決定するため重要です。本報告では、ミトコンドリアの Ca^{2 +}ハンドリング分離ミトコンドリアや培養細胞での測定のための 2 つの方法を提案する.我々 はまず、Ca^{2 +}敏感な染料カルシウム グリーン-5N を使用してミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収を測定プレート リーダー ベースのプラットフォームを詳しく説明します。プレート リーダー ベースの形式は、特殊な装置の必要性を回避し、カルシウム グリーン 5N 色素は Ca^{2 +}分離組織のミトコンドリアからの測定に最適です。アプリケーションでは、マウス心臓組織から分離されたミトコンドリア ミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収の測定について説明します。ただし、肝臓、骨格筋、脳など他の組織から分離されたミトコンドリア ミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収を測定するこの手順を適用することができます。第二に、共焦点顕微鏡を用いたミトコンドリア Ca^{2 +} Ca^{2 +}敏感な染料ロード-午前/2 を使用して、2 次元レーザー走査型顕微鏡を用いたイメージング グリセリン細胞の測定の測定について述べる。この透過プロトコルは、ミトコンドリア Ca^{2 +}での変更の特定の録音を可能にする細胞内色素汚染を排除します。また、レーザ走査型顕微鏡高フレーム レートのミトコンドリア Ca^{2 +}に様々 な薬や試薬の外部のソリューションの適用応答で急激な変化をキャプチャすることができます。このプロトコルは、初代培養細胞不死化細胞株や神経細胞、心筋細胞などを含む多くの細胞タイプのミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収を測定に適用できます。

概要

ミトコンドリアは、細胞内 Ca^{2 +}貯蔵とシグナル伝達の重要なサイトです。数十年の研究は、ミトコンドリアがインポートし、Ca^{2 + 1,2}を隔離する能力を持っていることを示しています。しかし、ミトコンドリアは Ca^{2 +}貯蔵の単なる受動的なサイトではありません。Ca^{2 +}ミトコンドリアのコンパートメントで代謝の出力の調節などの基本的なシグナリング機能を実行し、ミトコンドリアを介した細胞死経路の活性化されている見直し以前³。代謝調節の Ca^{2 +}活性を高めるトリカルボン酸だけでなく、呼吸鎖複合体、ミトコンドリアのエネルギー生産^{4,5 を増加する 3 マトリックス ローカライズ脱水素酵素の}.ミトコンドリアの Ca^{2 +}過負荷と調節不全ミトコンドリアの Ca^{2 +}ハンドリング、Ca^{2 +}トリガー ミトコンドリア膜透過性遷移孔 (MPTP) 入り口、ミトコンドリア内膜の透過膜の潜在的な損失、ミトコンドリア機能障害、腫脹、破裂し、最終的には、細胞死^6,7,8,9。細胞生命と死の経路を通じて代謝制御と MPTP 死の軸がこのように、ミトコンドリアの Ca^{2 +}シグナリング直接影響します。

近年が急速に普及したためミトコンドリア Ca^{2 +}動態の研究に関心のミトコンドリアの Ca^{2 +}細胞複雑な分子成分の同定に大きい部分、ミトコンドリア内Ca^{2 +}の主なモードは、膜輸送体は、ミトコンドリアのマトリックス^10、11,12にインポートします。細胞の構造および調節サブユニットの同定はミトコンドリアの機能と機能障害を調節するためのミトコンドリアの Ca^{2 +}流入をターゲット遺伝子の可能性をもたらしたし、の研究を促進、細胞複合体とミトコンドリア Ca^{2 +}流入病^13,14,15への貢献。確かに、様々 な神経変性疾患、および癌^{16,17,18、心臓病に至る疾患の病態に関与しているミトコンドリアの Ca2 +シグナル伝達 19,20}。

ミトコンドリア Ca^{2 +}代謝と細胞死のシグナル伝達の基本的な重要性を与えられ、生物学的システムの広い範囲と組み合わせるそのミトコンドリア Ca^{2 +}シグナル伝達への影響、ミトコンドリアの Ca 2 +^{を評価する手法}流入が大きな関心を集めています。当然ながら、さまざまな技術やミトコンドリア Ca^{2 +}を測定するためのツールが開発されています。蛍光 Ca^{2 +}などのツールを利用する方法が含まれます-敏感な染料^21,22と^{遺伝子にコードされた Ca 2 +}センサー cameleon、イクオリン^{23など、ミトコンドリアを対象と 24}。この記事の目的は、さまざまな方法やミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収を測定できるモデル システムを強調することです。ミトコンドリアの Ca^{2 +}流入能力を評価する 2 つの実験的手法を提示します。例として心臓のミトコンドリアを使用、プレート リーダー ベースのプラットフォームの詳細に説明してミトコンドリア Ca^{2 +}の測定を使用して、Ca^{2 +}敏感な吸収色素分離組織のミトコンドリア^{14 に最適ですカルシウム グリーン 5N}.共焦点顕微鏡イメージングを用いたのミトコンドリア Ca^{2 +} Ca^{2 +}敏感な染料ロード-2/午前²⁵を用いたグリセリンの細胞の測定の測定について述べるも NIH 3T3 細胞を使用して、.

プロトコル

このプロトコルで記述されているすべてのメソッドは、制度的動物のケアと使用エモリー大学委員会によって承認されています。

注: 最初の部分は、プレート リーダーを使用して分離心筋ミトコンドリア ミトコンドリアの Ca^{2 +}流入を測定する実験です。

1. 試薬および解決

1. 500 mL のミトコンドリアの分離のための MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーを作る: 225 mM マンニトール、75 mM ショ糖、5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 1 mM エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N、N、N'、N'-四酢酸 (グリコールエーテルジアミン四酢酸)、pH 7.4 に調整島。0.22 μ m のフィルターを通してそれを殺菌、4 ° C で保存MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーが使用する前に 4 ° C にあらかじめ冷えたことを確認します。
2. 100 mL の KCl のバッファーを準備: 125 mM KCl、20 mM HEPES、1 mM KH₂PO₄、2 mM MgCl₂、40 μ M グリコールエーテルジアミン四酢酸、pH 島の 7.2 に調整。室温で保管してください。
3. ジメチルスルホキシド (DMSO) でグリーン 5N 株式 1 mM カルシウムを準備します。カルシウム グリーン 5N 株式 aliquotted をすることができ、-20 ° C で保存
4. Ca^{2 +}取り込みのための基板を準備します。
   1. 1 M ピルビン酸ナトリウム、pH 7.4 を準備します。因数-20 ° C で保存します。
   2. 500 mM リンゴ酸、pH 7.4 を準備します。因数-20 ° C で保存します。

2. 心筋ミトコンドリアの分離

1. 制度の基準によるとマウスを安楽死させます。
   注: 安楽死の私達の制度上承認された方法、マウスが isofluorane 吸入麻酔し、頚部転位によって犠牲に。
2. 胸の空洞を開き、肋骨の両側に沿って切断、中心部の側面、横隔膜を離れて切断と心臓組織を切除、心を収集します。
   注: このプロトコル 3-4 実験のために十分であるべきアダルト マウス (約 120 mg) から収集した全体の中心からミトコンドリアの分離が行われます。肝臓など他のミトコンドリアの豊富な組織からミトコンドリアの分離、説明されたプロトコルに続く組織の 200 mg までを使用できます。
3. 組織をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) すべての血液は心室から押し出されることを確保する x 氷冷 1 の 25 mL を徹底的にすすいでください。
   注: 中心部から押し出される液体を実行する明確な心が十分に洗浄するでしょう。
4. シャープはさみのペアを使用して冷たい 1 × PBS の 5 mL の小さな断片に心臓をミンチします。
5. PBS を破棄し、みじん切りにした心臓組織を 0.10 に 0.15 mm のクリアランスで中古冷蔵 7 mL ガラス テフロン dounce ホモジナイザーに転送します。
6. 冷たい MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーの 5 mL を追加し、サンプルを均質化組織部分がもはやないまで表示 (約 11 ストローク)。
   無傷と機能のミトコンドリアを取得することと、メモ: は、過剰組織を均質化はないです。
7. 磨砕液を 15 mL チューブに転送します。
8. 核と切れ目のない細胞のペレットに 5 分間、4 ° C で 600 x g でホモジネートを遠心します。
9. 上清を新しい 15 mL チューブに転送し、ミトコンドリアをペレットに 10 分間、4 ° C で 10,000 × g で遠心分離します。
10. 上澄みを廃棄し、氷の上のミトコンドリアのペレットを維持します。
11. 冷たい MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーを 2 回使用してミトコンドリアのペレットを洗浄します。各洗浄のためには、5 mL の MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーでミトコンドリアのペレットを再懸濁します 10,000 x g で 10 分間、4 ° C で遠心分離機、上澄みを廃棄します。
12. 最終的な洗浄後上澄みを廃棄し、氷冷 MS グリコールエーテルジアミン四酢酸バッファーの 100 μ L でミトコンドリアを再懸濁します。氷の上のミトコンドリアを維持します。
    注: 実験 1 h 内のミトコンドリアを使用ください。
13. ブラッドフォード蛋白質の試金²⁶を用いたミトコンドリアのタンパク質濃度を測定します。

3 ミトコンドリアのカルシウム吸収のプレート リーダーによる計測

注: ここでは、それはインジェクターが装備マルチモード プレート リーダーを使用してミトコンドリアの Ca^{2 +}吸収を分析のために、プロトコルを記述しました。カルシウム グリーン 5N 蛍光を読み取る能力を持つリーダーをプレートいずれか (励起/蛍光 506/532 nm) キネティック モード自動試薬と反応を光から保護を保つためにインジェクターを使用ことができます。

1. 毎秒 1,000 の総測定時間測定とカルシウム グリーン 5N 蛍光の運動を実行するプレート リーダーを読み取るプログラム s のさらに、プログラムの 30 の CaCl₂ソリューションの 5 μ L を分注する試薬インジェクター s、150 s, 300 s、480 s、および 690 秒時点。
   注: CaCl₂注射のタイミングは、ユーザー定義、実験ニーズに合わせての調整することができます。
2. 首相の CaCl₂ソリューションの試薬注入器を使用します。
   注: CaCl₂溶液の濃度は、ユーザー定義、Ca^{2 +} MPTP オープニングをトリガーするために必要な量を滴定する後続の実行で調整することができます。
3. 96 well プレートの各ウェルにミトコンドリアの 200 μ g を追加します。
4. ミトコンドリアと KCl のバッファーの総量は 197 μ L になるように、井戸に KCl バッファーの適切な量を追加します。
5. ミトコンドリアの混合物に 1 M ピルビン酸の 1 μ L と 500 mM マラテの 1 μ L を追加します。優しく、ミックスしてミトコンドリアが活性化するように常温で 2 分間基板とミトコンドリアをインキュベート ピペットで移しなさい。
6. 1 mM カルシウム グリーン 5N 株式の 1 μ L を追加します。ピペットで穏やかに混合します。
   注: を防ぐカルシウム グリーン 5N 色素添加による光反応。
7. 事前にプログラムされた運動プロトコルとモニター カルシウム グリーン 5N 蛍光を開始します。

4. 試薬および解決

注: 2 番目の部分はミトコンドリア Ca^{2 +}細胞の共焦点レーザー顕微鏡の実験手順です。

1. タイロード液 (130 mM NaCl, 4 mM KCl、2 mM CaCl₂MgCl₂、10 mM グルコース 1 mM, 10 mM HEPES、島と pH 7.2) を確認します。4 ° C で保存します。それを使用する前に室温に温めてください。
2. 洗浄ソリューション (100 mM カリウム酢酸 15 mM KCl、5 mM KH₂PO₄、5 mM Mg-ATP、0.35 ミリメートル グリコールエーテルジアミン四酢酸、0.12 mM CaCl₂、0.75 mM MgCl₂、クレアチンリン酸 10 mM、10 mM HEPES、島と pH 7.2) を準備します。4 ° C で保存します。それを使用する前に室温に温めてください。
3. 洗浄ソリューションで 0.005% サポニンを含む透過ソリューションを準備します。それは新鮮な毎日を準備します。
4. 準備 0 Ca^{2 +}内部ソリューション (100 mM カリウム酢酸、15 mM KCl、0.35 mM 0.75 mM MgCl₂、グリコールエーテルジアミン四酢酸 10 mM HEPES、pH 7.2 島の調整)。4 ° C で保存します。それを使用する前に室温に温めてください。
5. Ca^{2 +}を含む内部の溶液を準備します。無料 Ca^{2 +}目的の濃度に到達する上内部ソリューションに CaCl₂を追加します。CaCl₂追加する量は、MaxChelator プログラム (maxchelator.stanford.edu) を使用して計算されます。
6. DMSO のロード-2/午前株式 1 mM を準備し、使用するまで-20 ° C で保存します。
7. 1 mM MitoTracker DMSO でグリーン ・ ストックを準備し、使用するまで-20 ° C でそれを保存します。

5. めっき細胞イメージング

1. 22 × 22 cm²ガラス coverslips 100% エタノールを洗浄し、乾燥空気に coverslips を許可します。
2. 6 ウェル培養皿の個々 の井戸にガラス coverslips を配置します。
   注: Coverslips はラミニン、ポリ-L-リジン、または細胞接着を促進するために類似のマトリックスでコーティングすることができます。
3. Trypsinize し、イメージングの日の約 70% の合流を目指してカバーガラス上細胞をプレートします。

6. 読み込みロード-2/午前および MitoTracker グリーンの細胞

1. ロード 2/AM MitoTracker の準備作業ソリューションをグリーンします。ロード-2/午前 1 mM 在庫の 20 μ L、MitoTracker グリーン 1 mM 株の 0.2 μ L と 20% プルロニック F-127 タイロード液の 1 ml の 2.5 μ L を追加します。実用的なソリューションのロード 2 の最終濃度が 20 μ M と MitoTracker グリーンの最終濃度は 200 nM。
2. 優しく、coverslip から成長メディアを削除します。
   注意: 洗浄ステップは染付のソリューションの前に必要ではありません。
3. ロード-2/AM-MitoTracker を追加 coverslip の coverslip がちょうどになるまでに滴下しファッションで緑のソリューション (coverslip あたり約 3-4 滴) を覆われています。
4. それをセルが染料を使用して読み込むように光から保護部屋の温度で 30 分間インキュベートします。
5. ロード 2/午前を脱エステル化します。優しくロード-2/AM-MitoTracker を削除ソリューションをグリーン、新鮮な室温タイロード液に置き換えて、光から保護部屋の温度で 30 分間インキュベートします。

7 ミトコンドリア ロード 2/午前の MitoTracker グリーン蛍光共焦点イメージング

1. 商工会議所をイメージング顕微鏡、coverslip を転送し、チャンバー洗浄ソリューション。
2. 40 X の位相コントラストで細胞を観察するための設定の下のセルが表示されるまで、フォーカス フォーカスを調整します。
3. ロード 2/AM MitoTracker の膜を permeabilize グリーン ロード細胞ミトコンドリアのローカライズされた色素を保持したまま細胞質局在ロード-2 を削除します。
   1. Coverslip から洗浄ソリューションを削除します。
   2. 約 1 分の透過ソリューションで置き換えること。
   3. 透過プロセス全体を通じて細胞膜の形態を視覚的に監視します。グリセリンの細胞は粗面を開発する.
   4. 透過が完了したら、すぐに透過ソリューションを削除し、置き換えます 0 Ca^{2 +}内部ソリューション。
4. 同時に画像のロード 2 蛍光 (559 nm レーザー ラインおよび排出 575 675 nm の間の波長で収集を使用して励起) と MitoTracker グリーン蛍光 (488 nm レーザー ラインと収集間の波長で放射を使用して励起505-525 nm)。ロード 2 と MitoTracker グリーンの明確な共存を表示するグリセリンの細胞に焦点を当てます。
5. 顕微鏡レーザーを減少し、ミトコンドリアのロード 2 蛍光がぼんやりと見えるようになるよう設定を得る。
6. 特定のアプリケーションのための適切なフレーム率と時間コースで 2 次元スキャンを取得する顕微鏡の設定を選択します。少なくとも 30 フレーム/秒のフレーム レート推移ミトコンドリア Ca^{2 +}の動態を正確にキャプチャする勧めします。
7. セルまたは顕微鏡の焦点を乱すことがなく、0 Ca^{2 +}内部ソリューションを削除します。
8. 画像の取得を開始します。
9. 追加 Ca^{2 +}-10 秒の時に十分に備えて内部ソリューション ポイント手動または灌流システムを使用します。
10. 対象 (ROIs) ミトコンドリア ロード 2 と画像集録ソフトウェアの MitoTracker 緑信号との間の共存の領域を包含する領域を選択します。
    注: 記録の各時点の任意蛍光 (F) 値は、各投資収益率が取得されます。これらの値はバック グラウンド減算 (Ca^{2 +}添加; する前に最初の蛍光に正規化し、F₀) とデータの表示およびミトコンドリア Ca^{2 +}の変動の振幅の定量化のための時間をかけて F₀としてプロットします。

結果

図 1ミトコンドリア Ca^{2 +}取り込み測定プレート リーダー ベースのプラットフォームを使用して分離心筋ミトコンドリアで、Ca^{2 +}カルシウム グリーン-5N を染めます。制御条件 (図 1 a) 心筋ミトコンドリアいたカルシウム グリーン-5N を含む KCl バッファー中に浮遊し、30 の追加 CaCl₂ (0.6 mM CaCl₂?...

ディスカッション

ここでは、ミトコンドリアの Ca^{2 +}流入を測定する 2 つの異なるアプローチについて述べる。プレート リーダー ベース カルシウム グリーン 5N 法モニター extramitochondrial Ca^{2 +}レベルであり、Ca^{2 +}取り込みアッセイは、分離ミトコンドリアでの測定に適しています。我々 は分離されたマウス心筋ミトコンドリアから代表的な結果を示している、このアッセイことが高いミ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440