Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Özet

Burada, iki protokol mitokondrial Ca^{2 +} akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için mevcut. İzole mitokondri için biz bir plaka okuyucu tabanlı Ca^{2 +} alma detaylı tahlil Ca^{2 +} hassas kullanarak boya kalsiyum yeşil-5N. Kültürlü hücreler için Ca^{2 +} boya Rhod-2/AM kullanarak bir confocal mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır.

Özet

Mitokondri tarafından işleme Ca^{2 +} hücreleri geniş bir yelpazede fizyolojik ve patofizyolojik işlemlerinde düzenleyen bir kritik işlevdir. Yeteneği doğru akın ve sızma Ca^{2 +} mitokondri üzerinden ölçmek için bu işlemlerde işleme mitokondrial Ca^{2 +} rolünü belirlemek için önemlidir. Bu rapor halinde mitokondrial Ca^{2 +} işleme izole mitokondri ve kültürlü hücreleri ölçümü için iki yöntem sunar. Biz ilk Ca^{2 +} hassas boya kalsiyum yeşil-5N kullanarak mitokondrial Ca^{2 +} alımı ölçmek için plaka okuyucu tabanlı platform ayrıntı. Plaka okuyucu tabanlı biçimi özel ekipman ihtiyacını kaçınmanızı sağlar ve kalsiyum yeşil-5N boya Ca^{2 +} izole doku mitokondri üzerinden ölçmek için idealdir. Bizim uygulamamız için ölçüm mitokondrial Ca^{2 +} Alım fare kalp dokusundan izole mitokondri içinde açıklar; Ancak, bu yordamı diğer doku karaciğer, kas iskelet ve beyin gibi gelen izole mitokondri mitokondrial Ca^{2 +} anlamazdın ölçmek için uygulanır. İkinci olarak, biz bir confocal mikroskobu tabanlı tahlil mitokondrial Ca^{2 +} Ca^{2 +} hassas boya Rhod-2/AM kullanarak ve 2 boyutlu lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleme permeabilized hücrelerdeki ölçüm için tanımlamak. Bu permeabilization Protokolü sitozolik boya kirlenme, mitokondrial Ca^{2 +}değişikliklerin belirli kayıt için izin ortadan kaldırır. Ayrıca, lazer tarama mikroskobu yüksek kare hızları mitokondrial Ca^{2 +} çeşitli ilaçlar veya dış çözümde uygulanan reaktifler yanıt olarak hızlı değişimlerin yakalamak için izin verir. Bu iletişim kuralı mitokondrial Ca^{2 +} anlamazdın kardiyak miyositler ve nöronlar ve ölümsüzleştirdi hücre hatları gibi Primer hücre de dahil olmak üzere birçok hücre tipleri ölçmek için uygulanır.

Giriş

Mitokondri intrasellüler Ca^{2 +} depolama ve sinyal kritik siteler vardır. Onlarca yıllık araştırma mitokondri yeteneği alma ve Ca^{2 + 1,2}çekilmek zorunda gösterdi. Mitokondri, ancak, Ca^{2 +} depolama sadece pasif siteler değildir. CA^{2 +} mitokondrial yuvası, metabolik çıkış düzenlenmesi de dahil olmak üzere temel sinyal işlevleri gerçekleştirir ve olmuştur harekete geçirmek-in mitokondrial aracılı hücre ölüm yolları, daha önce³gözden. Metabolik regülasyon için Ca^{2 +} üç matris lokalize dehydrogenases tricarboxylic asit döngüsü hem de solunum zinciri kompleksleri, mitokondrial enerji üretim^{4,5 artırmak için etkinliğini artırır} . Mitokondrial Ca^{2 +} aşırı yük ve mitokondrial Ca işleme^{2 +} dysregulated ile Ca^{2 +} Tetikleyicileri mitokondrial geçirgenliği geçiş (MPTP) açılış, mitokondriyal iç zar permeabilization için önde gelen gözenek, membran potansiyel kaybı, şişme, mitokondrial disfonksiyon rüptürü ve sonuçta, hücre ölüm^6,7,8,9. Böylece, mitokondrial Ca^{2 +} sinyal doğrudan hücresel yaşam ve ölüm yolları metabolik kontrol ve MPTP-ölüm eksen etkiler.

Son yıllarda, orada hızla mitokondrial Ca^{2 +} dinamikleri nedeniyle çalışmanın ilgi genişleyen büyük kısmı mitokondrial Ca^{2 +} uniporter karmaşık moleküler bileşenlerin tanımlaması için mitokondri iç bir baş tarz-in Ca^{2 +} şey zar ışınlama mitokondrial matris ^10,11,12alın. Bu yapısal ve düzenleyici alt birimleri uniporter, tanımlaması ileri genetik olarak mitokondriyal Ca^{2 +} akını mitokondriyal işlev ve fonksiyon bozukluğu modüle için hedefleme olasılığı getirdi ve çalışma kolaylaştırdı uniporter karmaşık ve mitokondrial Ca^{2 +} akını hastalığı^13,14,15' e katkı. Nitekim, mitokondrial Ca^{2 +} sinyal hastalıkları kalp hastalığı ateş ve kanser^{16,17,18kadar çeşitli bir dizi patolojiler de karıştığı olmuştur, 19,20}.

Temel metabolizması ve hücre ölümüne içinde sinyal mitokondrial Ca^{2 +} önemi göz önüne alındığında ve biyolojik sistemleri geniş ulaşmak ile kombine o mitokondrial Ca^{2 +} sinyal etkiler, mitokondrial Ca^{2 + değerlendirmek için yöntemleri} akın büyük ilgi vardır. Doğal olarak, çeşitli teknikler ve araçlar mitokondrial Ca^{2 +} ölçmek için geliştirilmiştir. Bu alet öyle aynı derecede floresan Ca^{2 +}kullanmak yöntemleri içerir-hassas boyalar^21,22 ve mitokondri cameleon ve aequorin^{23, gibi hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca2 + sensörler 24}. Bu makalede, farklı yöntemler ve mitokondrial Ca^{2 +} alımı ölçülebilir sistemleri modellemek vurgulamak için hedeftir. Biz mitokondrial Ca^{2 +} akını kapasitesini değerlendirmek için iki deneysel yöntem mevcut. Kardiyak mitokondri örnek olarak kullanarak, bir plaka okuyucu tabanlı platform ayrıntı mitokondrial Ca^{2 +} ölçmek için Ca^{2 +} hassas kullanarak alımı boya kalsiyum yeşil-5N izole doku mitokondri^{14 için idealdir} . Kültürlü NIH 3T3 hücreleri kullanarak, Ayrıca görüntüleme tabanlı bir confocal mikroskobu tahlil mitokondrial Ca^{2 +} permeabilized hücrelerdeki Ca^{2 +} hassas boya Rhod-2/AM²⁵kullanarak ölçüm için açıklar.

Protokol

Bu protokol için açıklanan tüm yöntemleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Emory Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Not: Mitokondrial Ca^{2 +} akını bir plaka okuyucu kullanarak izole kardiyak mitokondri içinde ölçmek için deneysel işlemin ilk bölümüdür.

1. reaktifler ve çözümleri

1. MS-EGTA arabellek mitokondrial yalıtım için 500 mL olun: 225 mM mannitol, 75 mM sukroz, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES), 1 mM etilen glikol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic asit (EGTA), pH 7.4 için ayarlanabilir KOH ile. 0,22 mikron filtre sterilize ve 4 ° C'de saklayın MS-EGTA arabellek kullanmadan önce 4 ° c önceden soğutulmuş olduğundan emin olun.
2. 100 mL KCl arabelleği hazırlamak: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 mikron EGTA ve pH 7.2 KOH ile için ayarlanabilir. Oda sıcaklığında saklayın.
3. 1 mM kalsiyum Dimetil sülfoksit (DMSO) yeşil-5N stokta hazır olun. Kalsiyum yeşil-5N stok aliquotted olabilir ve -20 ° C'de depolanan
4. Yüzeylerde Ca^{2 +} alımı için hazırlayın.
   1. 1 M sodyum pyruvate, pH 7.4 hazırlayın. Aliquots-20 ° C'de depolayın
   2. 500 mM malat, pH 7.4 hazırlayın. Aliquots-20 ° C'de depolayın

2. kardiyak mitokondri yalıtım

1. Fareyi kurumsal standartlarına göre ötenazi.
   Not: ötenazi için bizim kurumsal olarak onaylanmış yöntemi fareler tarafından isofluorane inhalasyon anestezi ve servikal çıkığı tarafından kurban.
2. Kalp, göğüs boşluğu açma, kaburga iki tarafında boyunca kesme, kalp kanat, uzakta diyafram kesme ve kalp doku bilincin tarafından toplamak.
   Not: Bu protokol için 3-4 deneyler için yeterli olmalıdır bir yetişkin fare (yaklaşık 120 mg), toplanan bütün yürekten mitokondrial yalıtım yapılır. Karaciğer gibi diğer mitokondri bakımından zengin dokular mitokondrial izolasyonu için en çok 200 mg doku açıklanan protokol sonrası kullanılabilir.
3. Doku buz gibi 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) tüm kan ventrikül dışarı sıkılmış sağlanması x 25 mL içinde iyice durulayın.
   Not: kalp dışarı sıkılmış sıvı açık çalıştığında kalbi yeterince durulanır.
4. Kalbin buz gibi 1 x PBS keskin makas kullanarak 5 ml küçük parçalar halinde kıyma.
5. PBS atın ve kıyılmış kalp doku 0,10-0.15 mm giriş izni önceden soğutulmuş 7 mL cam-teflon dounce homogenizer transfer.
6. Buz gibi MS-EGTA arabellek 5 mL ekleyin ve doku parçaları artık görünür (yaklaşık 11 vuruş) kadar örnek lunaparkçı.
   Not: sağlam ve işler durumda mitokondri elde etmek için amaç olduğu gibi doku aşırı homojenize değil.
7. Homogenate 15 mL tüp aktarın.
8. Homogenate 600 x g çekirdeği ve kesilen hücreleri cips 5 min için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
9. Bir taze 15 mL tüp süpernatant aktarmak ve 10.000 x g mitokondri cips için 10 dakika için 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
10. Süpernatant atın ve buz üzerinde mitokondrial Pelet koruyun.
11. İki kez buz gibi MS-EGTA tampon kullanarak mitokondrial Pelet yıkayın. Her yıkama için mitokondrial Pelet MS-EGTA arabellek 5 mL resuspend, 10.000 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve süpernatant atmak.
12. Son yıkama sonra süpernatant atın ve mitokondri buz soğuk MS-EGTA arabellek 100 μL içinde resuspend. Mitokondri buz üzerinde tutun.
    Not: Mitokondri deneme 1 saat içinde kullanılmalıdır.
13. Bir Bradford Protein tahlil²⁶kullanarak mitokondrial protein konsantrasyonu ölçmek.

3. plaka okuyucu tabanlı ölçümü mitokondrial kalsiyum alımı

Not: Burası multimod plaka okuyucu kullanarak mitokondrial Ca^{2 +} alımı analiz enjektörleri ile donatılmış için protokol açıklanan. Herhangi bir plaka okuyucu kalsiyum yeşil-5N Floresans okuma yeteneği ile (uyarma/emisyon 506/532 nm) enjektörleri ışıktan korunan tepki tutmak için otomatik reaktif bir Kinetik modunda kullanılabilir.

1. Program bir Kinetik gerçekleştirmek için plaka okuyucu her saniye Toplam tahlil vakit geçirmek 1.000 alınan ölçümlere ile kalsiyum yeşil-5N Floresans okumak Ayrıca s., 5 μL CaCl₂ çözüm 30 dağıtmak için reaktif enjektörleri program s, 150 s, 300 s , 480 s ve 690 s zaman puan.
   Not: CaCl₂ enjeksiyonları zamanlaması kullanıcı tanımlı olan ve deneysel ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir.
2. Reaktif enjekte edenlerin CaCl₂ çözüm ile kullanılmak üzere Başbakan.
   Not: CaCl₂ çözüm konsantrasyonu kullanıcıya özgüdür ve sonraki çalışır MPTP açılış tetiklemek için Ca^{2 +} miktarı titre için ayarlanabilir.
3. Mitokondri 200 μg 96 iyi plaka tek tek bir şey için ekleyin.
4. Öyle ki toplam hacmi mitokondri ve KCl arabellek için 197 μL gelir KCl arabellek uygun hacmi kuyuya ekleyin.
5. 1 M pyruvate 1 μL ve 500 mM malat 1 μL mitokondri karışıma ekleyin. Damlalıklı hafifçe karıştırın ve mitokondri mitokondri enerjik olmak izin vermek için oda sıcaklığında 2 min için yüzeyler ile kuluçkaya için.
6. 1 mM kalsiyum yeşil-5N stokunun 1 μL ekleyin. Pipetting tarafından karışımı yavaşça.
   Not: tepki kalsiyum yeşil-5N boya eklenmesi aşağıdaki ışıktan korumak.
7. Önceden programlanmış Kinetik iletişim kuralı ve monitör kalsiyum yeşil-5N Floresans başlatın.

4. reaktifler ve çözümleri

Not: İkinci bölümde mitokondrial Ca^{2 +} kültürlü hücrelerdeki confocal görüntüleme için deneysel bir işlem olduğunu.

1. Tyrode'nın çözüm (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM glikoz ve 10 mM HEPES, pH 7.2 KOH ile) olun. 4 ° C'de depolayın O oda sıcaklığına kullanmadan önce sıcak.
2. Yıkama çözüm (100 mM potasyum asetat, 15 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 5 mM Mg-ATP, 0.35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl₂, 0,75 mM MgCl₂, 10 mM phosphocreatine, 10 mM HEPES, pH 7.2 KOH ile) hazırlayın. 4 ° C'de depolayın O oda sıcaklığına kullanmadan önce sıcak.
3. Permeabilization çözüm, %0,005 saponin yıkama çözüm içeren hazır olun. Taze günlük hazırlayın.
4. 0 hazırlamak Ca^{2 +} iç çözüm (100 mM potasyum asetat, 15 mM KCl, 0.35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH 7.2 KOH ile ayarlanır). 4 ° C'de depolayın O oda sıcaklığına kullanmadan önce sıcak.
5. CA^{2 +}içeren iç çözüm hazırlamak. Ücretsiz Ca^{2 +}istenilen konsantrasyonu ulaşmak için CaCl₂ iç çözüm ekleyin. Eklemek için CaCl₂ miktarı MaxChelator programı (maxchelator.stanford.edu) kullanılarak hesaplanır.
6. 1 mM DMSO stokta Rhod-2/AM hazırlamak ve kadar kullanmak-20 ° C'de saklayın.
7. 1 mM MitoTracker yeşil DMSO stokta hazırlamak ve kadar kullanmak-20 ° C'de saklayın.

5. kaplama hücreleri görüntüleme için

1. 22 x 22 cm² cam coverslips % 100 etanol ile yıkama ve kuru hava coverslips sağlar.
2. Cam coverslips 6-iyi doku kültürü çanak bireysel kuyu yerleştirin.
   Not: Coverslips laminin, Poli-L-lizin veya hücre eki tanıtmak için benzer matrix ile kaplı olması.
3. Trypsinize ve hücreleri görüntüleme gün üzerinde yaklaşık % 70 izdiham için amaçlayan coverslips üzerine plakası.

6. yükleme hücreleri Rhod-2/AM ve MitoTracker yeşil

1. Rhod-2/AM-MitoTracker hazırlamak yeşil çalışma çözüm. 20 μL Rhod-2/AM 1 mM hisse senedi, MitoTracker yeşil 1 mM stokunun 0.2 μL ve Tyrode'nın çözüm % 20 pluronic F-127 1 ml 2.5 μL ekleyin. Rhod-2 son konsantrasyonu çalışma çözüm içinde 20 µM ve MitoTracker yeşil son konsantrasyonu 200 nM.
2. Yavaşça büyüme medya coverslip çıkarın.
   Not: Bir yıkama adım boya çözüm ek önce gerekli değildir.
3. Rhod-2/AM-MitoTracker eklemek kadar coverslip sadece coverslip üzerine dropwise bir biçimde yeşil çözüm kaplı (yaklaşık 3-4 damla coverslip başına).
4. Işık hücreleri Boyar maddeler ile yüklemek izin vermek için korumalı oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
5. Rhod-2/AM de-esterify. Yavaşça çıkarın Rhod-2/AM-MitoTracker yeşil çözüm, eski yerine koymak o ile taze oda sıcaklığında Tyrode'nın çözüm ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.

7. mitokondrial Rhod-2/AM ve MitoTracker yeşil Floresans confocal görüntüleme

1. Coverslip odası Imaging mikroskop aktarmak ve odası yıkama çözüm ile doldurun.
2. Faz kontrast 40 X hücrelerde gözlemlemek için Ayarlar'ın altında hücreleri görünür hale gelene kadar ve odak odak ayarlamak.
3. Rhod-2/AM-MitoTracker plazma zarı permeabilize yeşil boya mitokondri lokalize koruyarak sitozol lokalize Rhod-2, kaldırmak için hücreleri yüklü.
   1. Yıkama çözüm coverslip kaldırın.
   2. Yaklaşık 1 dak Permeabilization çözüm ile değiştirin.
   3. Görsel olarak permeabilization sürecinde plazma zarı Morfoloji izlemek. Permeabilized hücre yapısı bir yüzey gelişecektir.
   4. Permeabilization tamamlandığında, hemen Permeabilization çözümü kaldırmak ve 0 Ca^{2 +} ile iç çözüm değiştirin.
4. Aynı anda Rhod-2 floresan (559 nm lazer çizgi ve emisyon dalga boylarında 575-675 nm arasında toplanan kullanarak uyarma) görüntü ve MitoTracker yeşil floresan (uyarma 488nm lazer çizgi ve dalga boyu arasında toplanan emisyon kullanma 505-525 nm). Permeabilized hücre Rhod-2 ve MitoTracker yeşil açık bir colocalization görüntüleme odaklanın.
5. Mikroskop lazer azaltmak ve mitokondrial Rhod-2 floresan loş ve sadece görünür olacak ayarları kazanç.
6. Belirli bir uygulama için bir uygun çerçeve oranı ve saat ders 2-boyutlu taramalar elde etmek için mikroskop ayarları'nı seçin. En az 30 kare/s kare hızı doğru değişimler mitokondrial Ca^{2 +}Kinetik yakalamak için önerilir.
7. 0 Ca^{2 +} iç çözüm hücreleri ya da mikroskop odak bozmadan kaldırın.
8. Resim alma başlatın.
9. CA^{2 +}Ekle-10 s zaman dolu iç çözüm noktası el ile veya bir perfüzyon sistemi ile.
10. Faiz (ROIs colocalization arasında mitokondrial Rhod-2 ve MitoTracker yeşil sinyal görüntü edinme yazılımında bölgelerinde kapsayacak şekilde) bölgeleri seçin.
    Not: Rasgele floresan (F) değerleri kayıt her zaman için her yatırım Getirisi için elde edilir. Bu değerler çıkartılır ve (önce Ca^{2 +} ek; ilk floresan için normalleştirilmiş arka plan F₀) ve veri sunumu ve genlik değişikliğinin mitokondrial Ca^{2 +}miktar için zaman içinde F/F₀ çizilen.

Sonuçlar

Şekil 1 gösterir mitokondrial Ca^{2 +} alımı ölçümleri plaka okuyucu tabanlı platformu kullanarak izole kardiyak mitokondri içinde ve Ca^{2 +} boya kalsiyum yeşil-5N. Denetim koşullarda (şekil 1A), kardiyak mitokondri kalsiyum yeşil-5N içeren KCl arabellekte askıya ve 30'eklendi CaCl₂ (0.6 mm CaCl₂ çözüm 5 μL) ve ardışık darbeleri ile meydan s, 150 s, 300 s, 480 s ve 690...

Tartışmalar

Burada, mitokondrial Ca^{2 +} akını ölçmek için iki farklı yaklaşımlar açıklayın. Plaka okuyucu tabanlı kalsiyum yeşil-5N yöntemi monitörler extramitochondrial Ca^{2 +} düzeyleri ve izole mitokondri ölçümlerde için de uygun olan bir Ca^{2 +} alımı tahlil olduğunu. Biz izole fare kardiyak mitokondri temsilcisi sonuçlar göstermiştir, bu tahlil dokulardan karaciğer, kas iskelet ve beyin de dahil olmak üzere yüksek mitokondrial bereket ile izole mitokondri için kolayca ad...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440