Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

Резюме

Здесь мы представляем два протокола для измерения митохондриальной Ca^{2 +} приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Для изолированных митохондриях, мы подробно плиты на основе чтения Ca^{2 +} импорта с помощью Ca^{2 +} чувствительной пробирного красителя кальция Грин 5N. Для культивируемых клеток мы описываем confocal микроскопии метод, с помощью Ca^{2 +} краситель кондицио-2/AM.

Аннотация

CA^{2 +} обработка митохондрий функция критической регулирования физиологических и патофизиологических процессов в широком спектре клеток. Способность точно измерить приток и измеряем Ca^{2 +} от митохондрий имеет важное значение для определения роли митохондриальной Ca^{2 +} обработка в этих процессах. В настоящем докладе мы представляем два метода для измерения митохондриальной Ca^{2 +} обработка в изолированных митохондриях и культивируемых клеток. Мы сначала подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения с использованием Ca^{2 +} чувствительной краситель кальция Грин 5N. На основе чтения формат пластины обходит потребность в специализированном оборудовании, и краска кальция Грин 5N идеально подходит для измерения Ca^{2 +} от изолированных ткани митохондрий. Для нашего приложения мы описываем измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения в митохондриях, изолированных от мыши ткани сердца; Однако эта процедура может применяться для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения в митохондриях, изолированный от других тканей, таких как печень, скелетные мышцы и мозг. Во-вторых мы описываем конфокальной микроскопии основанные assay для измерения митохондриальной Ca^{2 +} в permeabilized клеток с помощью Ca^{2 +} чувствительной краситель кондицио-2/AM и обработки изображений с использованием 2-мерной лазерной сканирующей микроскопии. Этот протокол permeabilization устраняет загрязнения цитозольной краситель, позволяя для конкретной записи изменений в митохондриальной Ca^{2 +}. Кроме того лазерной сканирующей микроскопии позволяет высокие частоты кадров для захвата быстрого изменения митохондриального Ca^{2 +} в ответ на различные препараты или реагентов, применяемых в решении внешней. Этот протокол может применяться для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения во многих типах клеток, включая клетки первичной например культивировании и нейронов и увековечен клеточных линий.

Введение

Митохондрии являются важнейшие объекты внутриклеточных Ca^{2 +} хранения и сигнализации. Десятилетия исследований показали, что митохондрии имеют возможность импорта и секвестр Ca^{2 + 1,2}. Митохондрии, однако, являются не просто пассивные узлы Ca^{2 +} хранения. CA^{2 +} в отсеке митохондриальной выполняет основные сигнальные функции, включая регулирование метаболических вывода и активации пути смерти клетки митохондриального опосредованной, который был рассмотрен ранее³. Для регуляции метаболизма Ca^{2 +} усиливает деятельность трех матрица локализованных дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, а также дыхательной цепи комплексов, увеличить митохондриального энергетического производства^4,5 . С митохондриальных Ca^{2 +} перегрузки и dysregulated митохондриальных Ca^{2 +} обработка Ca^{2 +} триггеры митохондриальной проницаемость переходного поры (MPTP) открытие, приводит к permeabilization внутреннюю мембрану митохондрий, мембрана потенциальные потери, митохондриальной дисфункции, отеки, разрыв и в конечном счете, клеточной смерти^6,,78,9. Таким образом митохондриальных Ca^{2 +} сигнализации непосредственно влияет на сотовый жизнь и смерть пути через метаболического контроля и оси MPTP-смерть.

В последние годы, там быстро растет интерес к изучению динамики митохондриальной Ca^{2 +} в большую часть для идентификации молекулярных компонентов митохондриальной Ca^{2 +} Унипорт комплекс, митохондриальных внутренняя транспортер мембраны, которая является основным режимом Ca^{2 +} импорт в митохондриальной матрицы ^10,,1112. Выявление этих структурных и регламентационных субблоков Унипорт вывел возможность генетически ориентации митохондриальной Ca^{2 +} приток чтобы модулировать митохондриальной функции и дисфункции и способствовало изучение вклад Унипорт комплекс и митохондриальной Ca^{2 +} притока к болезни^13,14,15. Действительно митохондриальных Ca^{2 +} сигнализации был вовлечен в патологии разнообразных заболеваний, начиная от болезни сердца нейродегенеративные и рака на^{16,,1718, 19,20}.

Учитывая основополагающее значение митохондриальной Ca^{2 +} сигнализации в метаболизм и клеточную смерть и в сочетании с широким охватом биологических систем, митохондриальных Ca^{2 +} сигнализации воздействий, методы оценки митохондриальной Ca^{2 +} приток представляют большой интерес. Не удивительно был разработан целый ряд методов и инструментов для измерения митохондриальной Ca^{2 +} . К ним относятся методы, которые используют инструменты, такие как флуоресцентные Ca^{2 +}-чувствительных красители^21,22 и генетически закодированный Ca^{2 +} датчики ориентированы на митохондрии, например cameleon и Экворин^{23, 24}. Цель этой статьи — выделить различные методы и модели систем, в которых может быть измерена митохондриальной Ca^{2 +} поглощения. Мы представляем две экспериментальные методы для оценки митохондриальной Ca^{2 +} приток потенциала. Использование сердечной митохондрий в качестве примера, мы подробно пластины читателя-платформа для измерения митохондриальной Ca^{2 +} поглощения с помощью Ca^{2 +} чувствительной красителя Грин 5N кальция, который идеально подходит для изолированных ткани митохондрий¹⁴ . Используя искусственный низ 3T3 клеток, мы также описывают конфокальная микроскопия на основе изображений assay для измерения митохондриальной Ca^{2 +} в permeabilized клетки, с помощью Ca^{2 +} чувствительной краситель кондицио-2/AM²⁵.

протокол

Все методы, описанные в настоящем протоколе были одобрены институциональный уход животных и использование комитета университета Эмори.

Примечание: Первая часть является экспериментальная процедура измерения митохондриальной Ca^{2 +} приток в изолированных сердечной митохондрий, используя читателя пластины.

1. реагенты и решения

1. Сделать 500 мл MS-EGTA буфера для митохондриального изоляции: 225 мм маннитол, сахароза 75 мм, 5 мм 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic кислота (HEPES), 1 мм этиленгликоля bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tetraacetic кислота (EGTA), рН, скорректированы до 7,4 с Кох. Стерилизовать его через фильтр 0,22 мкм и хранить при 4 ° C. Убедитесь, что буфер MS-EGTA предварительно охлажденным до 4 ° C перед использованием.
2. Подготовка 100 мл хлористого калия буфера: 125 мм KCl, 20 HEPES, 1 мм х₂PO₄, 2 мм MgCl₂, 40 мкм EGTA и рН скорректирована с 7,2 с Кох. Храните при комнатной температуре.
3. Подготовка 1 мм кальция Грин 5N складе диметилсульфоксида (ДМСО). Зеленый 5N запас кальция может быть aliquotted и хранятся при температуре-20 ° C.
4. Подготовьте субстратов для Ca^{2 +} поглощения.
   1. Подготовка 1 М пируват натрия, рН 7,4. Храните его в аликвоты при-20 ° C.
   2. Подготовка 500 мм малат, рН 7,4. Храните его в аликвоты при-20 ° C.

2. изоляция сердца митохондрий

1. Усыпить мыши в соответствии организационных стандартов.
   Примечание: Для наших институционально утвержденным методом эвтаназии, мышей были наркоз при вдыхании isofluorane и жертву шейки матки дислокации.
2. Собирайте сердца, открыв грудной полости, разрезания вдоль обеих сторон ребра, окаймляющие сердце, убирания диафрагмы и иссечения ткани сердца.
   Примечание: В настоящем Протоколе, митохондриальных изоляции производится от всего сердца, собранных от взрослой мыши (примерно 120 мг), которая должна быть достаточной для 3-4 экспериментов. Для митохондриального изоляции от других митохондрии богатых тканей, таких как печень могут использоваться до 200 мг ткани после описанных протокол.
3. Промывайте ткань тщательно в 25 мл ледяной 1 x фосфатный буфер (PBS) обеспечение того, чтобы все крови выдавливается из желудочков.
   Примечание: Сердце будет достаточно промыть когда жидкости выдавливается сердце работает четко.
4. Фарш сердце на мелкие кусочки в 5 мл ледяной 1 x PBS с помощью острых ножниц.
5. Отменить PBS и передавать предварительно охлажденные 7 мл стекла тефлон dounce гомогенизатор 0,10-0,15 мм зазором фарша сердечной ткани.
6. Добавьте 5 мл ледяной MS-EGTA буфера и гомогенизации образец до тех пор, пока кусочки ткани, больше не видны (примерно 11 инсультов).
   Примечание: Не чрезмерно гомогенизировать ткани, как цель состоит в том, чтобы получить нетронутыми и функциональных митохондрий.
7. Передача огневки до 15 мл.
8. Центрифуга огневки на 600 x g при 4 ° C за 5 мин до Пелле ядер и нерушимой клетки.
9. Супернатант передать свежие 15 мл и центрифуги на 10000 x g при 4 ° C на 10 минут, чтобы Пелле митохондрий.
10. Отменить супернатант и держать митохондриальной гранул на льду.
11. Вымойте митохондриальной Пелле, дважды с помощью ледяной MS-EGTA буфера. Для каждого мытья Ресуспензируйте митохондриальной Пелле в 5 мл буфера MS-EGTA, центрифуги на 10000 x g при 4 ° C на 10 мин и удалить супернатант.
12. После окончательного вымыть удалить супернатант и Ресуспензируйте митохондрий в 100 мкл лед холодной MS-EGTA буфера. Держите митохондрии на льду.
    Примечание: Митохондрий должно использоваться для экспериментов в течение 1 ч.
13. Измерение концентрации митохондриальных белок, используя Assay протеина Брадфорд²⁶.

3. плита на основе чтения измерение митохондриальной кальция поглощения

Примечание: Здесь, это описал протокол для анализа митохондриальной Ca^{2 +} поглощения с использованием многомодового пластины читатель оснащен инжекторов. Любого листа читателя с возможностью чтения кальция Грин 5N флуоресцирования (возбуждение/излучение 506/532 нм) в кинетическую режиме с автоматизированной реагент может использоваться форсунки держать реакции, защищенном от света.

1. Программа читателя пластины для выполнения кинетическая читать кальция Грин 5N. флуоресценции с измерений каждую секунду для всего пробирного время 1000 s. Дополнительно, программа реагент инжекторы отказаться 5 мкл раствора CaCl₂ на 30 сек, 150 s, 300 s , 480 s и 690 s время пунктов.
   Примечание: Время CaCl₂ инъекции, определяемые пользователем и может быть скорректирована для экспериментальной нужд.
2. Премьер реагент инжекторы с раствором₂ CaCl использоваться.
   Примечание: Концентрация раствора₂ CaCl определяется пользователем и может быть скорректирована в последующих запусков к Титруйте количество Ca^{2 +} требуется вызвать MPTP открытия.
3. Добавьте 200 мкг митохондрий в отдельных также 96 хорошо плиты.
4. Добавьте соответствующий объем буфера KCl и таким образом, что общий объем митохондрии и KCl буфер приходит к 197 мкл.
5. Добавьте в смесь митохондрии 1 мкл пируват 1 М и 1 мкл малат 500 мм. Накапайте осторожно, чтобы смешивать и инкубировать митохондрии с субстратами для 2 мин при комнатной температуре, чтобы позволить митохондрий стать под напряжением.
6. Добавьте 1 мкл акций Грин 5N кальция 1 мм. Смешайте нежно закупорить.
   Примечание: Защищайте реакции от света после добавления красителя Грин 5N кальция.
7. Начало запрограммированных кинетическая протокол и монитор кальция Грин 5N флуоресценции.

4. реактивы и решения

Примечание: Вторая часть является экспериментальная процедура конфокальная томография митохондриальной Ca^{2 +} в культивируемых клеток

1. Сделайте Tyrode в раствор (130 мм NaCl, 4 мм KCl, 2 мм CaCl₂, 1 мм MgCl₂, глюкоза 10 мм и 10 мм HEPES, рН 7,2 с Кох). Хранить при 4 ° C. Нагреть до комнатной температуре перед использованием.
2. Приготовьте промывочный раствор (ацетат калия 100 мм, 15 мм KCl, 5 мм х₂PO₄, 5 мм Mg-АТФ, 0,35 мм EGTA, 0.12 мм₂CaCl, 0,75 мм MgCl₂, фосфокреатин 10 мм, 10 мм HEPES, рН 7,2 с Кох). Хранить при 4 ° C. Нагреть до комнатной температуре перед использованием.
3. Готовят раствор Permeabilization, который содержит сапонин 0,005% в промывочный раствор. Готовят свежий ежедневно.
4. Подготовить 0 Ca^{2 +} внутреннее решение (100 мм калия ацетат, 15 мм KCl, 0,35 мм EGTA, 0,75 мм₂MgCl 10 мм HEPES, рН, скорректирована с 7,2 с Кох). Хранить при 4 ° C. Нагреть до комнатной температуре перед использованием.
5. Подготовка внутренних раствор, содержащий Ca^{2 +}. Добавьте CaCl₂ внутреннее решение выше для достижения желаемой концентрации свободного Ca^{2 +}. Количество₂ CaCl для добавления рассчитывается с помощью программы MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
6. Подготовка 1 мм кондицио-2/на складе в ДМСО и храните его при 20 ° C до использования.
7. Подготовка 1 мм MitoTracker зеленый складе в ДМСО и храните его при 20 ° C до использования.

5. покрытие клетки для изображений

1. Вымойте 22 x 22 см² стекла coverslips с 100% этанола и дайте высохнуть coverslips воздуха.
2. Место coverslips стекла в индивидуальные добра 6-ну тканевые культуры блюдо.
   Примечание: Coverslips могут быть покрыты с Ламинин, поли L-лизин или аналогичные матрицы содействовать клеток вложение.
3. Trypsinize и пластина клетки на coverslips, направленных для приблизительно 70% слияния в день изображений.

6. Загрузка клетки с кондицио-2/AM и MitoTracker зеленый

1. Подготовить кондицио-2/AM-MitoTracker зеленый рабочее решение. Добавьте 20 мкл кондицио-2/AM 1 мм штока, 0.2 мкл акций MitoTracker зеленый 1 мм и 2,5 мкл плюрониевого F-127 20% по 1 мл раствора в Tyrode. Конечная концентрация кондицио-2 в рабочем растворе 20 мкм и конечная концентрация MitoTracker зеленый 200 Нм.
2. Аккуратно удалите роста СМИ из coverslip.
   Примечание: Мыть шаг не является необходимым до того раствор красителя.
3. Добавьте кондицио-2/AM-MitoTracker зеленый раствор в прикапывают моды на coverslip пока coverslip не просто покрыты (примерно 3-4 капель в coverslip).
4. Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света, чтобы позволить клетки для загрузки с красителями.
5. Де эстерифицировать кондицио-2/AM. Аккуратно удалите кондицио-2/AM-MitoTracker зеленый решение, заменить его на свежий комнатной температуре Tyrode решения и Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре в защищенном от света.

7. конфокальный изображений митохондриальной кондицио-2/AM и флуоресценции MitoTracker зеленый

1. Передача coverslip для изображений камеры микроскопа и заполнить камеры с промывочного раствора.
2. В разделе Параметры для наблюдения клеток в Фазовый контраст на 40 X Отрегулируйте фокус до тех пор, пока клетки видны и в фокусе.
3. Разрушения плазматической мембраны кондицио-2/AM-MitoTracker зеленый загружен клетки для удаления локализованных цитозоль кондицио-2, сохраняя митохондрии локализованных красителя.
   1. Удаление промывочный раствор из coverslip.
   2. Замените его Permeabilization решения для приблизительно 1 мин.
   3. Визуально контролировать морфология плазматической мембраны на протяжении всего процесса permeabilization. Permeabilized клетки разработает шероховатую поверхность.
   4. При полной permeabilization, немедленно удалите решение Permeabilization и заменить его с 0 Ca^{2 +} внутреннее решение.
4. Одновременно изображения флуоресценции кондицио-2 (возбуждение, используя 559 Нм лазерной линии и выбросах, собранные на длинах волн между 575-675 Нм) и MitoTracker Зеленая флуоресценция (возбуждение, используя 488nm лазерной линии и выбросах, собранные на длинах волн между 505-525 Нм). Фокус на permeabilized клетки, отображение ясно colocalization кондицио-2 и MitoTracker зеленый.
5. Уменьшить лазерных микроскопов и получить параметры таким образом, что митохондриальной флуоресценции кондицио-2 dim и просто видно.
6. Выберите параметры Микроскоп, чтобы приобрести 2-мерных сканирование на соответствующий кадр скорости и времени курс для конкретного приложения. Частота кадров по крайней мере 30 кадров/сек рекомендуется точно захватить Кинетика изменения митохондриального Ca^{2 +}.
7. Удалите 0 Ca^{2 +} внутреннее решение не нарушая клетки или Микроскоп фокус.
8. Начало захвата изображений.
9. Добавить Ca^{2 +}-изобилует внутреннего решения в 10 s время точка либо вручную, либо с системой перфузии.
10. Выберите регионы интереса (ROI) для охвата регионов colocalization между митохондриальной кондицио-2 и MitoTracker зеленый сигнал в приобретение изображений программное обеспечение.
    Примечание: Произвольные флуоресцирования (F) значения для каждой точки время записи получаются для каждого ROI. Эти значения являются фон вычитается и нормализуется до первоначального флюоресценция (до Ca^{2 +} дополнение; F₀) и печать как F/F₀ со временем для представления данных и количественной оценки амплитуды изменения митохондриального Ca^{2 +}.

Результаты

Рисунок 1 показывает митохондриальной Ca^{2 +} измерения поглощения в изолированные сердца митохондрий, используя платформу на основе чтения пластины и Ca^{2 +} краситель кальция Грин 5N. В условиях управления (рис. 1а), сердечной митох...

Обсуждение

Здесь мы опишем два различных подхода для измерения митохондриальной Ca^{2 +} приток. Плиты на основе чтения кальция Грин 5N метод мониторов extramitochondrial Ca^{2 +} уровнях и Ca^{2 +} поглощение assay который хорошо подходит для измерений в изолированных митохондриях. В то время как мы показ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440