Análises de influxo de cálcio mitocondrial em mitocôndrias isoladas e células cultivadas

Resumo

Aqui, apresentamos dois protocolos para a medição de mitocondrial Ca^{2 +} afluxo em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Por mitocôndrias isoladas, detalhamos uma placa baseada no leitor Ca^{2 +} importação ensaio usando o Ca^{2 +} sensível tingir cálcio verde-5N. Para culturas de células, nós descrevemos um método de microscopia confocal, usar a tintura de Ca^{2 +} Rhod-2h.

Resumo

CA^{2 +} manipulação por mitocôndrias é uma função crítica que regulam processos fisiológicos e fisiopatológicos em um amplo espectro de células. A capacidade de medir com precisão o influxo e efluxo de Ca^{2 +} de mitocôndrias é importante para determinar a função mitocondrial Ca^{2 +} tratamento nestes processos. Neste relatório, nós apresentamos dois métodos para a medição de mitocondrial Ca^{2 +} manipulação em mitocôndrias isoladas e células cultivadas. Nós primeiro detalhe uma plataforma baseada em leitor de placa para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorção usando o Ca^{2 +} corante sensível cálcio verde-5N. O formato baseado em leitor de placa contorna a necessidade de equipamento especializado, e o corante verde-5N de cálcio é ideal para medição de Ca^{2 +} de mitocôndrias isoladas de tecido. Para a nossa aplicação, nós descrevemos a medição de mitocondrial Ca^{2 +} absorção em mitocôndrias isoladas de tecido do coração de rato; no entanto, este procedimento pode ser aplicado para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorção em mitocôndrias isoladas de outros tecidos como fígado, músculo esquelético e o cérebro. Em segundo lugar, descrevemos um ensaio baseado em microscopia confocal para medição de mitocondrial Ca^{2 +} em pilhas permeabilized usando o Ca^{2 +} sensível corante Rhod-2h e imagem usando microscopia de varredura a laser 2-dimensional. Este protocolo de permeabilização elimina contaminação citosólica corante, permitindo a gravação específica de alterações no mitocondrial Ca^{2 +}. Além disso, microscopia de varredura a laser permite altas taxas de quadros capturar mudanças rápidas em mitocondrial Ca^{2 +} em resposta a várias drogas ou reagentes aplicados na solução externa. Este protocolo pode ser aplicado para medir mitocondrial Ca^{2 +} absorção em muitos tipos de células, incluindo as células primárias como miócitos e neurônios e linhas celulares imortalizado.

Introdução

As mitocôndrias são sites críticos de Ca^{2 +} armazenamento intracelular e sinalização. Décadas de pesquisa demonstraram que as mitocôndrias têm a capacidade de importar e sequestro de Ca^{2 + 1,2}. Mitocôndrias, no entanto, não são meramente passivas sites de armazenamento de Ca^{2 +} . CA^{2 +} no compartimento mitocondrial executa funções de sinalização fundamentais, incluindo o Regulamento da produção metabólica e ativação das vias de morte celular mediada por mitocondrial, que tem sido revisado anteriormente³. Para a regulação metabólica, Ca^{2 +} aumenta a atividade de três matriz-localizada desidrogenases do ciclo do ácido cítrico, bem como complexos da cadeia respiratória, para aumentar a produção de energia mitocondrial^4,5 . Com a sobrecarga de Ca^{2 +} mitocondrial e desregulação mitocondrial Ca^{2 +} manipulação, Ca^{2 +} disparadores transição de permeabilidade mitocondrial pore abertura (MPTP), levando a permeabilização da membrana mitocondrial interna, perda potencial de membrana, disfunção mitocondrial, inchaço, ruptura e, finalmente, da pilha morte^6,7,8,9. Assim, Ca^{2 +} sinalização mitocondrial impacta diretamente a vida celular e vias de morte através do controle metabólico e eixo MPTP-morte.

Nos últimos anos, lá tem sido rápida expansão interesse no estudo da mitocondrial Ca^{2 +} dinâmica devido, em grande parte para a identificação dos componentes moleculares do Ca^{2 +} uniporter mitocondrial complexa, um interior mitocondrial transportador de membrana que é um modo primário de Ca^{2 +} importar para a matriz mitocondrial ^10,11,12. Identificação destas subunidades estruturais e reguladoras do uniporter tem trazido a possibilidade de direcionamento geneticamente mitocondrial Ca^{2 +} influxo para modular a função mitocondrial e disfunção e facilitou o estudo do contribuição do uniporter complexo e mitocondrial Ca^{2 +} influxo a doença^13,14,15. Com efeito, Ca^{2 +} sinalização mitocondrial tem sido implicada nas patologias de um diversificado leque de doenças que variam de doença cardíaca a neurodegeneração e câncer^{16,17,18, 19,20}.

Dada a importância fundamental da mitocondrial Ca^{2 +} sinalização no metabolismo e morte celular e combinado com o amplo alcance dos sistemas biológicos que Ca^{2 +} sinalização mitocondrial impacta, métodos para avaliar mitocondrial Ca^{2 +} influxo são de grande interesse. Não surpreendentemente, desenvolveram-se uma variedade de técnicas e ferramentas para medir mitocondrial Ca^{2 +} . Estes incluem métodos que utilizam ferramentas como fluorescente Ca^{2 +}-corantes sensíveis^21,22 e geneticamente codificado Ca^{2 +} sensores direcionados para a mitocôndria, como cameleon e aequorin^{23, 24}. O objetivo deste artigo é destacar os diferentes métodos e sistemas de modelo no qual mitocondrial Ca^{2 +} absorção pode ser medida. Apresentamos dois métodos experimentais para avaliar a capacidade mitocondrial Ca^{2 +} influxo. Usando a mitocôndria cardíaca como um exemplo, detalhamos uma plataforma baseada em leitor de placa de medição mitocondrial Ca^{2 +} absorção usando o Ca^{2 +} sensível tintura verde-5N de cálcio que é ideal para mitocôndrias isoladas de tecido¹⁴ . Também utilizando culturas de células de NIH 3T3, descrevemos um ensaio baseado em imagem de microscopia confocal para medida de mitocondrial Ca^{2 +} em pilhas permeabilized usando o Ca^{2 +} sensível corante Rhod-2h²⁵.

Protocolo

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comité uso da Universidade de Emory e institucional Cuidado Animal.

Nota: A primeira parte é o procedimento experimental para medir mitocondrial Ca^{2 +} influxo em mitocôndrias cardíacas isoladas usando um leitor de placa.

1. reagentes e soluções

1. Fazer 500 mL de tampão de MS-EGTA para isolamento mitocondrial: manitol 225mm, sacarose 75 mM, o ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 5 mM 4 (HEPES), 1mm glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-ácido etilenodiaminotetracético (EGTA), pH ajustado para 7,4 com KOH. Esterilize-o através de um filtro de 0,22 μm e armazená-lo em 4 ° C. Certifique-se de que o buffer de MS-EGTA é pre-refrigerado a 4 ° C antes do uso.
2. Preparar 100 mL de tampão de KCl: 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1mm KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA e pH ajustado para 7.2 com KOH. Armazená-lo em temperatura ambiente.
3. Prepare o cálcio 1 mM verde-5N estoque em dimetilsulfóxido (DMSO). O estoque de verde-5N de cálcio pode ser aliquotado e armazenado a-20 ° C.
4. Prepare substratos para a absorção de Ca^{2 +} .
   1. Prepare o piruvato de sódio 1 M, pH 7,4. Armazená-lo em alíquotas a-20 ° C.
   2. Prepare o malato de 500 mM, pH 7,4. Armazená-lo em alíquotas a-20 ° C.

2. isolamento de mitocôndrias cardíacas

1. Eutanásia o mouse de acordo com as normas institucionais.
   Nota: Para nosso método aprovado institucionalmente da eutanásia, os ratos foram anestesiados pelo isofluorano inalação e sacrificados por deslocamento cervical.
2. Recolha o coração abrindo a cavidade torácica, corte ao longo de ambos os lados das costelas, flanqueando o coração, cortando o diafragma e excisão do tecido do coração.
   Nota: No presente protocolo, isolamento mitocondrial é executado de um coração inteiro coletado de um rato adulto (aproximadamente 120 mg), que deve ser suficiente para 3-4 experimentos. Para o isolamento mitocondrial de outros tecidos ricos em mitocôndrias, tais como o fígado, até 200 mg de tecido pode ser usado o protocolo descrito a seguir.
3. Lave o tecido completamente em 25 mL de gelado 1 x solução salina tamponada fosfato (PBS) garantindo que todo sangue é espremido fora dos ventrículos.
   Nota: O coração suficientemente limpa os tubos quando o líquido espremido fora do coração fica claro.
4. Picar o coração em pedaços pequenos em 5 mL de PBS gelado 1 x usando um par de tesouras afiadas.
5. Descartar a PBS e transferir o tecido cardíaco picada para um homogeneizador de homogenizacao de vidro-teflon pré-refrigerada 7 mL com uma folga de 0,10 a 0,15 mm.
6. Adicionar 5 mL de tampão de MS-EGTA gelada e homogeneizar a amostra até pedaços de tecido já não são visíveis (aproximadamente 11 traços).
   Nota: Excesso não homogeneizar o tecido como o objetivo é obter a mitocôndria intacta e funcional.
7. Transfira o homogeneizado para um tubo de 15 mL.
8. Centrifugue o homogenate a 600 x g a 4 ° C por 5 min para núcleos e células ininterrupta de Pelotas.
9. Transferir o sobrenadante para um tubo 15 mL e centrifuga-lo a 10.000 x g a 4 ° C por 10 min de mitocôndrias de Pelotas.
10. Desprezar o sobrenadante e manter a pelota mitocondrial no gelo.
11. Lave o pellet mitocondrial duas vezes usando o buffer de MS-EGTA gelada. Para cada lavagem, resuspenda o pellet mitocondrial em 5 mL de tampão de MS-EGTA, centrifugue-a 10.000 x g a 4 ° C por 10 min e descartar o sobrenadante.
12. Após a última lavagem, desprezar o sobrenadante e ressuspender as mitocôndrias em 100 μL de tampão de MS-EGTA frio gelo. Manter as mitocôndrias no gelo.
    Nota: As mitocôndrias devem ser usadas para a experimentação dentro de 1h.
13. Medir a concentração de proteína mitocondrial usando um ensaio da proteína de Bradford²⁶.

3. placa baseada em leitor de medição da absorção de cálcio mitocondrial

Nota: Aqui, é descrito o protocolo para análise mitocondrial Ca^{2 +} absorção usando um leitor de placa multimodo equipado com injetores. Qualquer leitor da placa com a capacidade de leitura da fluorescência verde-5N de cálcio (excitação/emissão de 506/532 nm) em um modo cinético com reagente automatizado injetores para manter a reação, protegida da luz podem ser usados.

1. Programa o leitor para realizar uma cinética ler de fluorescência verde-5N de cálcio com as medições feitas a cada segundo por um tempo total do ensaio de 1.000 s. Além disso, programar os injectores de reagente para dispensar 5 μL de solução de CaCl₂ a 30 s, 150 s, 300 s , 480 s e 690 pontos de tempo de s.
   Nota: A hora das injeções CaCl₂ são definidos pelo usuário e pode ser ajustado para, de acordo com necessidades experimentais.
2. Primeiro os injetores do reagente com a solução de CaCl₂ deve ser usado.
   Nota: A concentração da solução CaCl₂ é definido pelo usuário e pode ser ajustada em execuções subsequentes para dosear a quantidade de Ca^{2 +} necessário para acionar a abertura do MPTP.
3. Adicione 200 μg de mitocôndrias de um bem individual de uma placa bem 96.
4. Adicione o volume apropriado de buffer de KCl para o poço, tal que o volume total de mitocôndrias e buffer de KCl trata de 197 μL.
5. Adicione 1 μL de piruvato de 1m e 1 μL de malato de 500 mM para a mistura de mitocôndrias. Pipeta suavemente para misturar e incubar as mitocôndrias com os substratos por 2 min à temperatura ambiente para permitir que as mitocôndrias tornar-se energizada.
6. Adicione 1 μL de estoque de verde-5N de cálcio de 1 mM. Misture suavemente pipetando.
   Nota: Proteja a reação da luz após a adição do corante verde-5N cálcio.
7. Inicie o pré-programados cinética protocolo e monitor cálcio verde-5N fluorescência.

4. reagentes e soluções

Nota: A segunda parte é um procedimento experimental para a imagem latente confocal de mitocondrial Ca^{2 +} em pilhas cultivadas

1. Fazer a solução de Tyrode (130 mM NaCl, 4 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, glicose de 10 mM e 10 mM HEPES, pH 7.2 com KOH). Armazená-lo em 4 ° C. Esquente a temperatura ambiente antes do uso.
2. Prepare a solução de lavagem (acetato de potássio 100 mM, 15 mM KCl, 5mm KH₂PO₄, 5mm Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0.12 mM CaCl₂, 0,75 mM MgCl₂, fosfocreatina 10 mM, 10 mM HEPES, pH 7.2 com KOH). Armazená-lo em 4 ° C. Esquente a temperatura ambiente antes do uso.
3. Prepare a solução de permeabilização, que contém saponina de 0.005% em solução de lavagem. Prepare-se frescas diariamente.
4. Preparar 0 Ca^{2 +} solução interna (100mm acetato de potássio, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl₂, 10mm HEPES, pH ajustado a 7.2 com KOH). Armazená-lo em 4 ° C. Esquente a temperatura ambiente antes do uso.
5. Prepare a solução interna que contém Ca^{2 +}. Adicione CaCl₂ a solução interna acima para atingir a concentração desejada de free Ca^{2 +}. A quantidade de CaCl₂ adicionar é calculada usando o programa MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
6. Prepare-se 1 mM estoque Rhod-2h em DMSO e armazená-lo a-20 ° C até o uso.
7. Prepare-se 1 mM MitoTracker caldo verde em DMSO e armazená-lo a-20 ° C até o uso.

5. chapeamento células para tratamento de imagens

1. Lave as lamelas de vidro de² 22 x 22 cm com 100% de etanol e permitir que as lamelas ao ar seco.
2. As lamelas de vidro em poços individuais de um prato de cultura de tecidos de 6-poços de lugar.
   Nota: As lamelas podem ser revestidas com laminina, poli-L-lisina ou matriz semelhante para promover a fixação da célula.
3. Trypsinize e as células para as lamelas, apontando para cerca de 70% de confluência no dia da imagem latente da placa.

6. carregamento células com o Rhod-2h e MitoTracker Green

1. Preparar Rhod-2/AM-MitoTracker verde solução de trabalho. Adicione 20 μL de Rhod-2h 1 mM estoque, 0,2 µ l de estoque de 1mm verde MitoTracker e 2,5 μL de 20% pluronic F-127 a 1 mL de solução de Tyrode. A concentração final de Rhod-2 na solução de trabalho é de 20 µM, e a concentração final de MitoTracker green 200 nM.
2. Suavemente retire a mídia de crescimento da lamela.
   Nota: Uma etapa de lavagem não é necessária antes da adição de solução corante.
3. Adicionar o Rhod-2/AM-MitoTracker solução verde de forma gota a gota no sentido da lamela até a lamela é só coberto (aproximadamente 3-4 gotas por lamela).
4. -Incube durante 30 min à temperatura ambiente protegida da luz para permitir que as células carregar com as tinturas.
5. De esterificar Rhod-2/AM. Remova cuidadosamente o Rhod-2/AM-MitoTracker verde solução, substituí-lo com solução de Tyrode temperatura ambiente fresco e incube durante 30 min à temperatura ambiente protegida da luz.

7. confocal Imaging da mitocondrial Rhod-2/AM e fluorescência MitoTracker Green

1. Transferir a lamela para o microscópio de câmara de imagem e encha a câmara com solução de lavagem.
2. Em configurações para observar células em contraste de fase em 40 X, ajuste de foco até que as células são visíveis e em foco.
3. Permeabilize da membrana plasmática de Rhod-2/AM-MitoTracker verde carregado de células para remover Rhod citosol-localizada-2, mantendo-se mitocôndrias-localizada a tintura.
   1. Remova a solução de lavagem da lamela.
   2. Substituí-lo com solução de permeabilização por cerca de 1 min.
   3. Monitore visualmente a morfologia da membrana plasmática ao longo do processo de permeabilização. Pilhas permeabilized desenvolverá uma superfície áspera.
   4. Quando permeabilização é completa, imediatamente remover a solução de permeabilização e substituí-lo com 0 Ca^{2 +} solução interna.
4. Simultaneamente, imagem fluorescência Rhod-2 (excitação usando a linha de laser nm 559 e emissões coletados em comprimentos de onda entre 575-675 nm) e MitoTracker verde fluorescência (excitação usando a linha de laser 488nm e emissão coletados em comprimentos de onda entre 505-525 nm). Concentrar-se em células permeabilized, exibindo uma clara colocalization de Rhod-2 e MitoTracker verde.
5. Diminuir o laser do microscópio e obter configurações tal que a fluorescência de Rhod-2 mitocondrial é apenas visível e ofuscante.
6. Selecione Configurações de microscópio para adquirir 2-dimensional varreduras em um curso de tempo e taxa de quadro apropriado para a aplicação específica. Recomenda-se uma taxa de quadros de pelo menos 30 frames/s para capturar com precisão a cinética de alterações em mitocondrial Ca^{2 +}.
7. Remova o 0 Ca^{2 +} solução interna sem perturbar as células ou o foco do microscópio.
8. Inicie a aquisição de imagens.
9. Adicionar Ca^{2 +}-repleto solução interna ao tempo 10 s ponto manualmente ou com um sistema de perfusão.
10. Selecione as regiões de interesse (ROIs) para englobar as regiões de colocalization entre mitocondrial Rhod-2 e MitoTracker verde sinal do software de aquisição de imagem.
    Nota: Valores arbitrários fluorescência (F) para cada ponto de tempo de gravação são obtidos para cada ROI. Esses valores são fundo subtraídas e normalizado para a fluorescência inicial (antes Ca^{2 +} adição; F,₀) e plotados como F/F₀ ao longo do tempo para a apresentação de dados e quantificação da amplitude da mudança do mitocondrial Ca^{2 +}.

Resultados

A Figura 1 mostra mitocondrial Ca^{2 +} medidas de absorção em mitocôndrias cardíacas isoladas, utilizando a plataforma baseada em leitor de placa e o Ca^{2 +} corante verde de cálcio-5N. Sob condições de controle (figura 1A), mitocôndrias cardíacas foram suspensos em tampão de KCl contendo cálcio verde-5N e então desafiadas com pulsos sequenciais de CaCl₂ (5 μL de solução de CaCl₂

Discussão

Aqui, descrevemos duas abordagens diferentes para medir mitocondrial Ca^{2 +} influxo. Extramitochondrial verde-5N método monitores a placa baseada em leitor de cálcio Ca^{2 +} níveis e é um Ca^{2 +} absorção ensaio que é bem adequado para medições em mitocôndrias isoladas. Enquanto mostramos resultados representativos de mitocôndrias isoladas de cardíacas murino, este ensaio pode ser facilmente adaptado para as mitocôndrias isoladas de tecidos com alta abundância mitocondrial, inclu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440