Analyses des Influx de Calcium mitochondrique dans les mitochondries isolées et des cellules

Résumé

Nous présentons ici deux protocoles pour mesurer des influx mitochondriale de Ca^{2 +} dans les mitochondries isolées et des cellules. Pour les mitochondries isolées, nous détaillons une plaque base lecteur Ca^{2 +} importation de dosage à l’aide du Ca^{2 +} sensibles teindre calcium vert-5N. Pour les cellules cultivées, on décrit une méthode de microscopie confocale en utilisant le Ca^{2 +} colorant Rhod-2/AM.

Résumé

Ca^{2 +} manipulation de mitochondries est une fonction critique, régulation des processus physiologiques et physiopathologiques dans un large éventail de cellules. La capacité de mesurer avec précision l’influx et l’efflux de Ca^{2 +} des mitochondries est importante pour la détermination du rôle des mitochondries Ca^{2 +} manipulation dans ces processus. Dans ce rapport, nous présentons deux méthodes pour la mesure des mitochondries Ca^{2 +} manipulation dans les mitochondries isolées et les cellules cultivées. Nous détaillons tout d’abord une plate-forme lecteur plaque pour mesurer mitochondriale absorption de Ca^{2 +} à l’aide de^{la Ca 2 +} colorant photosensible calcium vert-5N. Le format lecteur plaque contourne le besoin d’équipement spécialisé, et le colorant vert-5N de calcium est parfaitement adapté pour mesurer Ca^{2 +} des mitochondries de tissus isolés. Pour notre application, nous décrivons la mesure de l’absorption^{2 +} Ca mitochondriale dans les mitochondries isolées du tissu cardiaque de souris ; Toutefois, cette procédure peut être appliquée pour mesurer l’absorption^{2 +} Ca mitochondriale dans les mitochondries isolées provenant d’autres tissus tels que le foie, le muscle squelettique et le cerveau. Deuxièmement, nous décrivons un essai microscopie confocal pour mesure de mitochondrial Ca^{2 +} dans les cellules perméabilisées aide le Ca^{2 +} colorant photosensible Rhod-2/h et d’imagerie à l’aide de la microscopie à balayage laser 2 dimensions. Ce protocole perméabilisation élimine la contamination colorant cytosolique, permettant une inscription spécifique des changements dans les mitochondries Ca^{2 +}. En outre, microscopie à balayage laser permet des cadences élevées capturer des changements rapides dans les mitochondries Ca^{2 +} en réponse à divers médicaments ou réactifs appliqués dans la solution externe. Ce protocole peut être appliqué pour mesurer l’absorption^{2 +} Ca mitochondriale dans plusieurs types de cellules dont les cellules primaires comme les myocytes cardiaques et les neurones et lignées cellulaires immortalisées.

Introduction

Les mitochondries sont des sites critiques de Ca^{2 +} stockage intracellulaire et la signalisation. Des décennies de recherches ont montré que les mitochondries ont la possibilité d’importer et de séquestrer Ca^{2 + 1,2}. Mitochondries, cependant, ne sont pas des sites purement passives de Ca^{2 +} stockage. Ca^{2 +} dans le compartiment mitochondrial effectue des fonctions de signalisation fondamentales y compris la régulation de la production métabolique et l’activation de voies de mort cellulaire mitochondriale, qui a été examiné précédemment³. Pour la régulation du métabolisme, Ca^{2 +} améliore l’activité des trois déshydrogénases matrice localisée de l’acide tricarboxylique, mais aussi les complexes de la chaîne respiratoire, d’augmenter mitochondrial energy production^4,5 . Avec surcharge mitochondriale de Ca^{2 +} et la dysrégulation mitochondrial Ca^{2 +} manipulation, Ca^{2 +} déclencheurs perméabilité mitochondriale transition pore ouverture (MPTP), conduisant à la perméabilisation de la membrane interne mitochondriale, perte potentielle de membrane, dysfonctionnement mitochondrial, gonflement, se rompre et de cellules en fin de compte, mort^6,7,8,9. Ainsi, Ca^{2 +} signalisation mitochondrial a un impact direct fois vie cellulaire et les voies de la mort à travers le contrôle métabolique et axe de MPTP-mort.

Ces dernières années, il s’est rapidement développée intérêt dans l’étude de Ca^{2 +} dynamique mitochondriale due en grande partie à l’identification des constituants moléculaires de la complexe mitochondrique Ca^{2 +} Uniport, un interne mitochondriale transporteur membranaire qui est un mode primaire de Ca^{2 +} importer dans la matrice mitochondriale ^10,11,12. Identification de ces sous-unités structurelles et réglementaires de l’Uniport a fait naître la possibilité de ciblage génétiquement des influx mitochondriale de Ca^{2 +} pour moduler la fonction mitochondriale et dysfonction et facilité l’étude de la contribution de l’Uniport complexe et mitochondrial Ca^{2 +} afflux de maladie^13,14,15. En effet, Ca^{2 +} signalisation mitochondriale a été impliquée dans les pathologies d’un large éventail de maladies allant de maladie cardiaque à la neurodégénérescence et cancer^{16,17,18, 19,20}.

Étant donné l’importance fondamentale des mitochondries Ca^{2 +} signalisation dans le métabolisme et la mort cellulaire et combinée avec la large portée des systèmes biologiques que Ca^{2 +} signalisation mitochondrial impacts, méthodes d’évaluation Ca mitochondrial^{2 +} afflux sont d’un grand intérêt. Il n’est pas surprenant, une variété de techniques et d’outils pour mesurer mitochondrial Ca^{2 +} ont été développés. Il s’agit de méthodes qui utilisent des outils tels que fluorescent Ca^{2 +}-colorants sensibles^21,22 et codé génétiquement Ca^{2 +} capteurs ciblées vers les mitochondries, comme cameleon et aequorine^{23, 24}. L’objectif de cet article est de mettre en évidence les différentes méthodes et systèmes de modèles dans lequel capture^{2 +} Ca mitochondriale peut être mesurée. Nous présentons deux méthodes expérimentales pour évaluer la capacité afflux de mitochondrial Ca^{2 +} . À l’aide de mitochondries cardiaques à titre d’exemple, nous détaillons une plateforme axée sur le lecteur de plaque pour mesurer mitochondrial Ca^{2 +} absorption à l’aide du Ca^{2 +} sensibles teindre calcium vert-5N qui convient parfaitement aux mitochondries isolées de tissus¹⁴ . En utilisant des cellules 3 t 3 de NIH, nous décrivons également un test d’imagerie microscopie confocale pour mesure de mitochondrial Ca^{2 +} dans les cellules perméabilisées utilisant le Ca^{2 +} colorant photosensible Rhod-2/AM²⁵.

Protocole

Toutes les méthodes décrites dans le présent protocole ont été approuvés par le Comité de l’Université Emory d’utilisation et d’institutionnels animalier.

Remarque : La première partie est la procédure expérimentale pour mesurer des influx mitochondriale de Ca^{2 +} dans les mitochondries cardiaques isolées à l’aide d’un lecteur.

1. les réactifs et Solutions

1. Faire 500 mL de tampon de MS-EGTA pour isolement mitochondriale : 225 mM de mannitol, saccharose de 75 mM, 5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic d’acide (HEPES), 1 mM d’éthylène glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-tétraacétique (EGTA), pH ajusté à 7,4 avec KOH. Stériliser à travers un filtre 0,22 de μm et conserver à 4 ° C. Veiller à ce que le tampon de MS-EGTA est préalablement réfrigéré à 4 ° C avant utilisation.
2. Préparer 100 mL de tampon de KCl : 125 mM KCl, 20 mM HEPES, 1 mM KH₂PO₄, 2 mM MgCl₂, 40 μM EGTA et pH ajusté à 7,2 avec KOH. Conserver à température ambiante.
3. Préparation de 1 mM de calcium vert-5N stock dans le diméthylsulfoxyde (DMSO). Le stock de vert-5N de calcium peut être aliquoté et conservés à-20 ° C.
4. Préparation des substrats pour la capture de Ca^{2 +} .
   1. Préparer le pyruvate de sodium 1 M, pH 7,4. Stockez-la dans aliquotes à-20 ° C.
   2. Préparer le malate de 500 mM, pH 7,4. Stockez-la dans aliquotes à-20 ° C.

2. isolation des mitochondries cardiaques

1. Euthanasier la souris selon les normes institutionnelles.
   Remarque : Pour notre méthode institutionnellement agréée de l’euthanasie, souris ont été anesthésiés par inhalation isofluorane et sacrifiés par dislocation cervicale.
2. Collecter le coeur en ouvrant la cage thoracique, couper le long de chaque côté des côtes, flanquant le cœur, coupant le diaphragme et excisant le tissu cardiaque.
   NOTE : Dans ce protocole, isolement mitochondriale est effectuée à partir d’un coeur entier provenant d’une souris adulte (environ 120 mg), qui doit être suffisante pour des expériences de 3-4. Pour l’isolation mitochondriale provenant d’autres tissus riches en mitochondries comme le foie, jusqu'à 200 mg de tissu peut être utilisé en suivant le protocole décrit.
3. Rincer le tissu soigneusement dans 25 mL de glacée 1 x une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) veiller à ce que tout le sang est évincé les ventricules.
   NOTE : Le cœur sera être suffisamment rincé lorsque le liquide évincé de cœur soit limpide.
4. Émincer le cœur en petits morceaux dans 5 mL de PBS glacée 1 x à l’aide d’une paire de ciseaux pointus.
5. Jeter les PBS et transférer des tissus cardiaques hachées dans un homogénéisateur de dounce préalablement réfrigérées 7 mL verre-téflon avec un dégagement de 0,10 à 0,15 mm.
6. Ajouter 5 mL de tampon de MS-EGTA glacée et homogénéiser l’échantillon jusqu'à ce que les morceaux de tissus n’est plus visibles (environ 11 coups).
   Remarque : Ne pas trop homogénéiser les tissus car l’objectif est d’obtenir la mitochondrie intacte et fonctionnelle.
7. Transférer l’homogénat dans un tube de 15 mL.
8. Centrifuger l’homogénat à 600 g à 4 ° C pendant 5 min granuler des noyaux et des cellules ininterrompues.
9. Transférer le surnageant dans un tube frais 15 mL et il centrifuger à 10 000 g à 4 ° C pendant 10 min granuler des mitochondries.
10. Jeter le surnageant et garder le diabolo mitochondrial sur la glace.
11. Laver le culot mitochondrial deux fois à l’aide de tampon de MS-EGTA glacée. Pour chaque lavage, resuspendre le culot mitochondrial dans 5 mL de tampon de MS-EGTA, il centrifuger à 10 000 g à 4 ° C pendant 10 min et éliminer le surnageant.
12. Après le lavage final, éliminer le surnageant et remettre en suspension les mitochondries dans 100 μl de tampon de MS-EGTA froid de glace. Garder la mitochondrie sur la glace.
    Remarque : Les mitochondries devraient servir d’expérimentation au sein de 1 h.
13. Mesurer la concentration de protéine mitochondriale à l’aide d’une analyse de protéine de Bradford²⁶.

3. plaque axée sur le lecteur de mesure de l’absorption de Calcium mitochondrique

Remarque : Il est ici décrit le protocole pour l’analyse mitochondriale capture de Ca^{2 +} à l’aide d’un lecteur de plaque multimode équipé d’injecteurs. Une plaque de lecteur avec la capacité de lecture de fluorescence vert-5N calcium (excitation/émission de 506/532 nm) en mode cinétique avec réactif automatisé injecteurs pour maintenir la réaction à l’abri de la lumière peuvent être utilisés.

1. Programme le lecteur pour effectuer une cinétique lire de fluorescence vert-5N de calcium avec les mesures effectuées chaque seconde pendant une période d’essai totale de 1 000 s. en outre, les injecteurs de réactifs à ajouter 5 μL de solution₂ ACIC au 30 de programme s, 150 s, 300 s , 480 s et 690 s temps points.
   NOTE : Le calendrier de l’ACIC₂ injections sont définies par l’utilisateur et peuvent être ajustées pour selon besoins expérimentaux.
2. Apprêter les injecteurs réactif avec la CaCl₂ solution à utiliser.
   Remarque : La concentration de la solution de CaCl₂ est défini par l’utilisateur et peut être ajustée dans les exécutions suivantes de titrer la quantité de Ca^{2 +} requis pour déclencher l’ouverture du MPTP.
3. Ajouter 200 μg de mitochondries dans un puits individuel d’une plaque 96 puits.
4. Ajouter le volume suffisant de tampon de KCl dans le puits tels que le volume total des mitochondries et tampon KCl vient à 197 μL.
5. Ajoutez 1 μL de pyruvate de 1 M et 1 μL de malate de 500 mM pour le mélange de mitochondries. Pipette doucement pour mélanger et incuber les mitochondries avec les substrats pendant 2 min à température ambiante pour permettre des mitochondries à devenir excité.
6. Ajouter 1 μL de stock de vert-5N calcium 1 mM. Mélanger doucement de pipetage.
   NOTE : Protéger la réaction de la lumière après l’ajout du colorant vert-5N calcique.
7. Commencer la préprogrammé cinétique protocole et moniteur calcium vert-5N fluorescence.

4. les réactifs et Solutions

Remarque : La deuxième partie est une procédure expérimentale pour l’imagerie confocale des mitochondries Ca^{2 +} dans les cellules cultivées

1. Faire une solution de Tyrode (130 mM NaCl, KCl 4 mM, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM de glucose et 10 mM HEPES, pH 7,2 avec KOH). Conserver à 4 ° C. Réchauffer à température ambiante avant utilisation.
2. Préparer la Solution de lavage (acétate de potassium 100 mM, 15 mM KCl, 5 mM KH₂PO₄, 5 mM Mg-ATP, 0,35 mM EGTA, 0,12 mM CaCl₂, 0,75 mM MgCl₂, phosphocréatine 10 mM, 10 mM HEPES, pH 7,2 avec KOH). Conserver à 4 ° C. Réchauffer à température ambiante avant utilisation.
3. Préparer la Solution perméabilisation, qui contient la saponine de 0,005 % en Solution de lavage. Préparez-le frais du jour.
4. Préparer 0 Ca^{2 +} Solution interne (acétate de potassium 100 mM, 15 mM KCl, 0,35 mM EGTA, 0,75 mM MgCl₂, 10 mM HEPES, pH ajusté à 7,2 avec KOH). Conserver à 4 ° C. Réchauffer à température ambiante avant utilisation.
5. Préparer une solution interne contenant du Ca^{2 +}. Ajouter CaCl₂ à la solution interne plus haut pour atteindre la concentration désirée de libre Ca^{2 +}. Le montant de CaCl₂ à ajouter est calculé en utilisant le programme MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
6. Préparation de 1 mM Rhod-2/AM stock dans le DMSO et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
7. Préparation de 1 mM MitoTracker vert stock dans le DMSO et conserver à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.

5. cellules de placage pour l’imagerie

1. Laver 22 x 22 cm² couvre-objet en verre avec 100 % d’éthanol et laisser les lamelles à l’air sec.
2. Placez le couvre-objet en verre dans les puits individuels d’un plat de 6 puits culture de tissus.
   Remarque : Les lamelles peuvent être revêtues de laminine, poly-L-lysine ou matrice semblable à promouvoir la fixation des cellules.
3. Trypsinize et plaque les cellules sur le couvre-objet en visant pour environ 70 % de confluence le jour de l’imagerie.

6. Comment charger les cellules avec le Rhod-2/AM et le MitoTracker vert

1. Préparer Rhod-2/AM-MitoTracker vert solution de travail. Ajouter 20 μL de Rhod-2/AM 1 mM stock, 0,2 μL de stock de MitoTracker vert de 1 mM et 2,5 μL de Pluronique F-127 de 20 % à 1 mL de solution de Tyrode. La concentration finale de Rhod-2 dans la solution de travail est de 20 µM et la concentration finale de MitoTracker vert est de 200 nM.
2. Retirez délicatement le support de la croissance de la lamelle couvre-objet.
   Remarque : Un pas de lavage n’est pas nécessaire avant l’addition de solution de colorant.
3. Ajouter le Rhod-2/AM-MitoTracker solution de vert de façon goutte à goutte sur la lamelle couvre-objet, jusqu'à ce que la lamelle est juste couvert (environ 3-4 gouttes d’huile par lamelle).
4. Il incuber 30 min à température ambiante, abrie de la lumière pour permettre à des cellules à la charge avec les colorants.
5. Hors estérifier le Rhod-2/AM. Retirez doucement le Rhod-2/AM-MitoTracker vert solution, remplacez-le par solution Tyrode fraîche température de la pièce et il incuber 30 min à température ambiante, abrie de la lumière.

7. confocal imagerie des mitochondries Rhod-2/AM et Fluorescence vert MitoTracker

1. Transférer la lamelle au microscope imaging chambre et remplir la chambre avec la solution de lavage.
2. Sous paramètres d’observation de cellules en contraste de phase à 40 X, ajuster la mise au point jusqu'à ce que les cellules sont visibles et bien centrées.
3. Permeabilize de la membrane plasmique de Rhod-2/AM-MitoTracker cellules pour enlever le cytosol localisée Rhod-2, tout en conservant la teinture localisée mitochondries chargées de vert.
   1. Supprimer la Solution de lavage de la lamelle.
   2. Remplacez-la par perméabilisation Solution pendant environ 1 min.
   3. Surveillance visuelle de la morphologie de la membrane plasmique durant tout le processus de la perméabilisation. Les cellules perméabilisées développera une surface rugueuse.
   4. Lorsque perméabilisation est terminée, immédiatement enlever la Solution de la perméabilisation et remplacez-la par 0 Ca^{2 +} Solution interne.
4. En même temps l’image Rhod-2 fluorescence (excitation en utilisant la 559 raie laser nm et émissions recueillies aux longueurs d’onde entre 575-675 nm) et la fluorescence verte MitoTracker (excitation à l’aide de la ligne laser 488nm et l’émission recueillis aux longueurs d’onde entre 505-525 nm). Se concentrer sur des cellules perméabilisées affichant une colocalisation claire de Rhod-2 et MitoTracker vert.
5. Diminuer le laser de microscope et réglages de gain, tels que la fluorescence de Rhod-2 mitochondriale est sombre et à peine visible.
6. Sélectionnez Paramètres de microscope d’acquérir 2 dimensions scans à un cours de taux et le temps de cadre approprié pour l’application spécifique. Une cadence d’au moins 30 images/s est recommandée de saisir avec précision la cinétique des changements dans les mitochondries Ca^{2 +}.
7. Supprimer les 0 Ca^{2 +} Solution interne sans déranger les cellules ou la mise au point du microscope.
8. Démarrer l’acquisition d’images.
9. Ajouter Ca^{2 +}-Solution interne remplie au moment s 10 point manuellement ou avec un système de perfusion.
10. Sélectionnez les régions d’intérêt (ROIs) englobe les régions de colocalisation entre mitochondrial Rhod-2 et MitoTracker vert signal dans le logiciel d’acquisition image.
    Remarque : Les valeurs arbitraires fluorescence (F) pour chaque moment de l’enregistrement sont obtenues pour chaque ROI. Ces valeurs sont fond soustraite et normalisée à la fluorescence initiale (avant Ca^{2 +} ajout ; F₀) et tracés comme F/F₀ au fil du temps pour la présentation des données et la quantification de l’amplitude du changement de mitochondrial Ca^{2 +}.

Résultats

La figure 1 illustre mitochondrial Ca^{2 +} mesures d’absorption dans les mitochondries cardiaques isolés à l’aide de la plateforme axée sur le lecteur de plaque et le Ca^{2 +} colorant vert-5N de calcium. Dans des conditions témoins (Figure 1 a), mitochondries cardiaques ont été suspendues dans un tampon de KCl contenant calcium vert-5N et ensuite contestés avec des impulsions séquentielles de CaCl

Discussion

Nous décrivons ici deux approches différentes pour mesurer des influx de Ca^{2 +} mitochondriale. La plaque calcium axée sur le lecteur vert-5N méthode moniteurs extramitochondrial Ca^{2 +} niveaux et est un Ca^{2 +} absorption test qui est utilisé pour des mesures dans les mitochondries isolées. Alors que nous avons montré des résultats représentatifs des mitochondries cardiaques murins isolés, ce test peut être facilement adapté pour les mitochondries isolées de tissus avec grande a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440