ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

Summary

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca^{2 +} זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca^{2 +} ייבוא assay באמצעות של Ca^{2 +} רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca^{2 +} לצבוע רוד-2/AM.

Abstract

Ca^{2 +} טיפול על ידי המיטוכונדריה היא פונקציה קריטית ויסות תהליכים פיזיולוגיים והן pathophysiological, בקשת רחבה של תאים. היכולת למדוד במדויק את זרם ואת בזרימת של Ca^{2 +} של המיטוכונדריה חשובה לקביעת בתפקיד מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} טיפול בתהליכים אלה. בדו ח זה, אנו מציגים שתי שיטות המדידה של Ca^{2 +} טיפול מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד והן תאים בתרבית. אנחנו קודם פירוט פלטפורמה מבוססת-קורא צלחת למדידת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} ספיגת באמצעות של Ca^{2 +} צבע רגיש סידן הירוק-5N. הפורמט מבוסס על הקורא צלחת עוקף את הצורך ציוד מיוחד, הצבע הירוק-5N סידן מתאימה באופן אידיאלי למדידת Ca^{2 +} של המיטוכונדריה רקמה מבודדת. עבור היישום שלנו, אנו מתארים את המדידה של Ca^{2 +} ספיגת מיטוכונדריאלי בתוך המיטוכונדריה מבודד מן העכבר רקמת הלב; עם זאת, ניתן להחיל הליך זה למדוד מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} ספיגת בתוך המיטוכונדריה מבודד לרקמות אחרות כגון הכבד, שרירי השלד, המוח. שנית, אנו מתארים assay מבוסס-מיקרוסקופ קונפוקלי למדידת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} תאים permeabilized באמצעות Ca^{2 +} רגיש לצבוע רוד-2/AM והדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקה בלייזר 2-ממדי. פרוטוקול permeabilization זה מבטל זיהום צבע cytosolic, המאפשר הקלטה ספציפית של שינויים ב Ca מיטוכונדריאלי^{2 +}. יתר על כן, מיקרוסקופיה סריקה בלייזר מאפשר קצב גבוה ללכוד את השינויים המהירים מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} בתגובה סמים או ריאגנטים ליישם את הפתרון חיצוניים שונים. פרוטוקול זה ניתן להחיל כדי למדוד מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} ספיגת סוגי תאים רבים, כולל ראשי תאים כגון של תאי שריר הלב ונוירונים, שורות תאים מונצח.

Introduction

המיטוכונדריה הם אתרים קריטיות של Ca תאיים^{2 +} אחסון איתות. עשורים של מחקרים הוכיחו כי המיטוכונדריה יש את היכולת לייבא sequester Ca^{2 + 1,2}. המיטוכונדריה, לעומת זאת, הם לא רק פסיבי אתרים של Ca^{2 +} אחסון. Ca^{2 +} -תא מיטוכונדריאלי מבצע היסוד פונקציות איתות לרבות ויסות חילוף החומרים פלט, הפעלה של מסלולים מוות תא מיטוכונדריאלי בתיווך, אשר כבר נבדקו בעבר³. עבור רגולציה חילוף החומרים, Ca^{2 +} מגביר את הפעילות של שלוש dehydrogenases מטריקס מותאם לשפות אחרות של מחזור חומצה tricarboxylic, כמו גם קומפלקסי שרשרת הנשימה, כדי להגדיל את האנרגיה מיטוכונדריאלי ייצור^4,5 . Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} עומס, dysregulated מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} טיפול, Ca^{2 +} גורמים מפעילים חדירות מיטוכונדריאלי המעבר הנקבוביות הפתיחה (MPTP), המוביל אל permeabilization מיטוכונדריאלי הממברנה הפנימית, אובדן פוטנציאל ממברנה, תפקוד מיטוכונדריאלי, נפיחות, קרע וסלולרי בסופו של דבר, למוות^6,7,8,9. לפיכך, Ca^{2 +} איתות מיטוכונדריאלי משפיעה במישרין על החיים הסלולר והן מוות שבילים דרך בקרה מטבולית וציר MPTP-מוות.

בשנים האחרונות, שם במהירות הרחבה עניין במחקר של מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} דינמיקה עקב חלק גדול לזיהוי של המרכיבים מולקולרית מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} uniporter מורכבים, של הפנימית מיטוכונדריאלי טרנספורטר קרום זה מצב ראשי של Ca^{2 +} לייבא לתוך מטריצה מיטוכונדריאלי ^10,11,12. זיהוי של אלה subunits מבנית ותקינה של uniporter לדרדר את האפשרות של פילוח גנטי מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} זרם לווסת מיטוכונדריאלי ותפקוד לקוי, יעברו חקר התרומה של uniporter מיטוכונדריאלי ומורכבת Ca^{2 +} זרם המחלה^13,14,15. אכן, Ca^{2 +} איתות מיטוכונדריאלי היה מעורב של פתולוגיות של מערך מגוון של מחלות ועד מחלות לב הקשורים ניוון מוחיים, וסרטן^{16,17,18, 19,20}.

את החשיבות הבסיסית של מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} איתות של חילוף החומרים, מוות של תאים, בשילוב רחב של מערכות ביולוגיות הזה Ca^{2 +} איתות מיטוכונדריאלי משפיע, שיטות להערכת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} זרם הם עניין רב. באופן לא מפתיע, פותחו מגוון רחב של טכניקות וכלים למדידת Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} . אלה כוללים שיטות לנצל כלים כגון Ca פלורסנט^{2 +}-צבעי רגיש^21,22 ו מקודד גנטית Ca^{2 +} חיישנים ממוקד המיטוכונדריה, כגון cameleon ו aequorin^{23, 24}. המטרה של מאמר זה היא כדי להדגיש שיטות שונות ומערכות מודל שבו ניתן למדוד Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} ספיגת. אנו מציגים שתי שיטות נסיוניות להעריך Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} זרם קיבולת. באמצעות הלב המיטוכונדריה כדוגמה, אנחנו פירוט פלטפורמה מבוססת-קורא צלחת למדידת Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} ספיגת באמצעות של Ca^{2 +} רגיש לצבוע סידן ירוק-5N זה מתאים באופן אידיאלי עבור רקמה מבודדת המיטוכונדריה¹⁴ . שימוש בתרבית תאים 3T3 NIH, נתאר גם וזמינותו של דימות מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} בתאים permeabilized באמצעות Ca^{2 +} רגיש לצבוע רוד-2/AM²⁵.

Protocol

כל השיטות המתוארות פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה של אוניברסיטת אמורי.

הערה: החלק הראשון הוא ההליך ניסיוני. למדידת מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} זרם בתוך המיטוכונדריה לב מבודד שימוש בקורא צלחת.

1. נוגדנים ופתרונות

1. להפוך 500 מ"ל של MS-EGTA מאגר לבידוד מיטוכונדריאלי: 225 מ מ מניטול, 75 מ מ סוכרוז, 5 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), 1 מ"מ אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N', N'-חומצה tetraacetic (EGTA), pH להתאים ל- 7.4 עם קו. לעקר אותה דרך פילטר μm 0.22 ואחסן אותו ב 4 º C. ודא כי המאגר MS-EGTA טרום מקורר עד 4 ° C לפני השימוש.
2. להכין 100 מ של אשלגן כלורי מאגר: 125 מ"מ אשלגן כלורי, 20 מ"מ HEPES, 1 מ מ ח'₂PO₄, 2 מ מ MgCl₂, 40 μM EGTA ' ו pH להתאים ל- 7.2 עם קו. אחסן אותו בטמפרטורת החדר.
3. להכין סידן 1 מ מ ירוק-5N מניות של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד). המניה ירוק-5N סידן ניתן aliquotted ומאוחסנים ב-20 ° C.
4. להכין מצעים Ca^{2 +} ספיגת.
   1. להכין 1 מ' נתרן פירובט, pH 7.4. לאחסן אותו aliquots ב-20 ° C.
   2. הכנת 500 מ מ בנויים, pH 7.4. לאחסן אותו aliquots ב-20 ° C.

2. בידוד של המיטוכונדריה הלב

1. המתת חסד את העכבר על פי סטנדרטים מוסדיים.
   הערה: עבור השיטה שלנו המאושרות כמוסד של המתת חסד, עכברים ומורדמת באמצעות אינהלציה isofluorane, הוקרב על ידי נקע בצוואר הרחם.
2. לאסוף את הלב על ידי פתיחת חלל החזה, חיתוך לאורך צדי הצלעות, איגוף הלב, חיתוך של הסרעפת excising את רקמת הלב.
   הערה: ב פרוטוקול זה, בידוד מיטוכונדריאלי מבוצע מתוך לב שלם שנאסף על העכבר למבוגרים (כ 120 מ ג), אשר צריכה להיות מספיק עבור 3-4 ניסויים. בידוד מיטוכונדריאלי רקמות אחרות המיטוכונדריה עשיר כמו הכבד, עד 200 מ ג של רקמות ניתן בעקבות הפרוטוקול המתואר.
3. יש לשטוף את הרקמה ביסודיות ב 25 מ ל 1 קרה כקרח x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) להבטיח כי כל הדם הוא סחוט מתוך החדרים.
   הערה: הלב מספיק לשטוף כאשר הנוזל נסחטת הלב פועל ברורים.
4. מינצ הלב לחתיכות קטנות ב 5 מ של PBS קר כקרח 1 x בעזרת זוג מספריים חדים.
5. למחוק את PBS ולהעביר רקמת הלב טחון מהמגן דאונס זכוכית-ציפוי טפלון טרום מקורר mL 7 עם אישור 0.10 כדי 0.15 mm.
6. הוסף 5 מ של מאגר MS-EGTA קר כקרח, homogenize את הדגימה עד חתיכות רקמה כבר אינם גלויים (קווים 11 בקירוב).
   הערה: לא יתר homogenize כהלכה את רקמת המטרה היא להשיג המיטוכונדריה שלמים ולא פונקציונלי.
7. להעביר את homogenate צינור 15 מ"ל.
8. Centrifuge את homogenate ב g x 600 ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות כדי הצניפה גרעינים ותאים רצופה.
9. להעביר את תגובת שיקוע צינור טריים 15 מ"ל, centrifuge זה ב g x 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות הצניפה המיטוכונדריה.
10. למחוק את תגובת שיקוע ולשמור בגדר מיטוכונדריאלי על קרח.
11. לשטוף את צניפה מיטוכונדריאלי פעמיים באמצעות מאגר MS-EGTA קר כקרח. עבור כל כביסה, resuspend בגדר מיטוכונדריאלי ב 5 מ של MS-EGTA מאגר, centrifuge זה ב g x 10,000 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ולמחוק את תגובת שיקוע.
12. לאחר השטיפה הסופית למחוק את תגובת שיקוע, resuspend המיטוכונדריה ב 100 μL מאגר MS-EGTA קר קרח. שמור את המיטוכונדריה על קרח.
    הערה: המיטוכונדריה אמור לשמש לניסויים בתוך 1 h.
13. למדוד ריכוז חלבון מיטוכונדריאלי באמצעות שיטת ברדפורד²⁶.

3. הצלחת המבוסס על הקורא מדידת ספיגת הסידן מיטוכונדריאלי

הערה: כאן, זה תיאר את הפרוטוקול עבור ניתוח מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} ספיגת שימוש בקורא צלחת כינוייהם מצויד מרססים. כל צלחת קורא עם יכולת לקרוא סידן ירוק-5N קרינה פלואורסצנטית (עירור/פליטה של 506/532 ננומטר) במצב קינטי עם ריאגנט אוטומטיות ניתן להשתמש מרססים לשמור את התגובה מוגן מפני אור.

1. תוכנית לקורא את הצלחת לבצע קינטי לקרוא של סידן ירוק-5N קרינה פלואורסצנטית עם המידות נלקח כל שנייה במשך זמן assay סך של 1,000 s. בנוסף, לתכנת את מזרקי ריאגנט לוותר μL 5 בפתרון₂ CaCl בשלושים s, 150 s, 300 s , 480 s, ואת נקודות זמן s 690.
   הערה: תזמון הזריקות₂ CaCl המשתמש הגדיר, ניתן לכוונן את בהתאם לצרכים ניסיוני.
2. פריים של מרססים מגיב עם הפתרון₂ CaCl כדי לשמש.
   הערה: הריכוז של הפתרון₂ CaCl המשתמש הגדיר, יכול להיות מותאם ב עוקבות כדי titrate את הסכום של Ca^{2 +} נדרש להפעיל MPTP הפתיחה.
3. להוסיף 200 μg של המיטוכונדריה טוב בודדים של צלחת טוב 96.
4. להוסיף נפח מתאים של אשלגן כלורי מאגר לבאר כך הנפח הכולל של המיטוכונדריה ומאגר אשלגן כלורי מגיע 197 μL.
5. להוסיף התערובת המיטוכונדריה μL 1 של 1 מ' פירובט, 1 μL של 500 מ מ בנויים. Pipet בעדינות כדי לערבב, דגירה המיטוכונדריה עם סובסטרטים למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאפשר המיטוכונדריה להפוך אנרגיה.
6. להוסיף 1 μL 1 מ מ סידן ירוק-5N מניות. מערבבים בעדינות על-ידי pipetting.
   הערה: להגן על התגובה אור בעקבות התוספת של צבע ירוק-5N סידן.
7. התחל את מחיישנים קינטי פרוטוקול וצג סידן ירוק-5N זריחה.

4. ריאגנטים ופתרונות

הערה: החלק השני הוא הליך ניסיוני עבור הדמיה קונאפוקלית של מיטוכונדריאלי Ca^{2 +} בתאים בתרבית

1. להפוך את הפתרון של Tyrode (130 מ מ NaCl, 4 מ מ אשלגן כלורי, 2 מ מ CaCl₂, 1 מ MgCl₂, גלוקוז 10 מ מ, ו 10 מ מ HEPES, pH 7.2 עם קו). אחסן אותו ב 4 º C. חממו אותו לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
2. להכין פתרון לשטוף (100 מ מ אשלגן אצטט, 15 מ מ אשלגן כלורי, 5 מ מ ח'₂PO₄, 5 מ מ ג-ATP, 0.35 mM EGTA, 0.12 מ"מ CaCl₂, 0.75 מ"מ MgCl₂, phosphocreatine 10 מ מ, 10 מ מ HEPES, pH 7.2 עם קו). אחסן אותו ב 4 º C. חממו אותו לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
3. להכין פתרון Permeabilization, אשר מכיל 0.005% סאפונין בפתרון לשטוף. להכינו טרי מדי יום.
4. להכין 0 Ca^{2 +} הפתרון הפנימי (100 מ מ אשלגן אצטט, 15 מ מ אשלגן כלורי, 0.35 mM EGTA, 0.75 מ מ MgCl₂, 10 מ מ HEPES, pH להתאים ל- 7.2 עם קו). אחסן אותו ב 4 º C. חממו אותו לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
5. להכין פתרון פנימי המכיל Ca^{2 +}. להוסיף CaCl₂ הפתרון פנימית מעל כדי להגיע אל הריכוז הרצוי של Ca חינם^{2 +}. כמות CaCl₂ כדי להוסיף מחושבת באמצעות התוכנית MaxChelator (maxchelator.stanford.edu).
6. להכין 1 מ"מ רוד-2/אם מניות של דימתיל סולפוקסיד ואחסן אותו ב-20 ° C עד השימוש.
7. להכין 1 מ"מ MitoTracker מניות ירוק של דימתיל סולפוקסיד ואחסן אותו ב-20 ° C עד השימוש.

5. ציפוי תאים עבור הדמיה

1. לשטוף 22 פרק 22 ס מ² coverslips זכוכית דקה עם 100% אתנול ולאפשר את coverslips מהאוויר יבש.
2. מקם את coverslips זכוכית דקה לתוך בארות בודדים של תבשיל תרביות רקמה 6-. טוב.
   הערה: יכול להיות מצופה Coverslips laminin, פולי-L-ליזין או מטריצות דומות כדי לקדם את התא מצורף.
3. Trypsinize, לוחית רישוי התאים אל coverslips מכוון כ-70% למפגש ביום של הדמיה.

6. טעינת תאים עם רוד-2/AM, MitoTracker גרין

1. להכין רוד-2/AM-MitoTracker ירוק הפתרון עובד. הוסף 20 μL רוד-2/AM 1 מ מ מניות, μL 0.2 MitoTracker ירוק 1 מ מ מניות, 2.5 μL של 20% pluronic F-127 1 מ של הפתרון של Tyrode. הריכוז הסופי של רוד-2 בהפתרון עובד 20 מיקרומטר ויש הריכוז הסופי של MitoTracker ירוק 200 ננומטר.
2. הסר בעדינות התקשורת צמיחה coverslip.
   הערה: צעד שטיפת אינה הכרחית בנוסף פתרון לצבוע.
3. הוסף את רוד-2/AM-MitoTracker פתרון ירוק בצורה dropwise על גבי coverslip עד coverslip פשוט מכוסה (כ 3-4 טיפות לכל coverslip).
4. דגירה זה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור כדי לאפשר את התאים לטעון עם הצבעים.
5. דה-esterify רוד-2/AM. הסר בעדינות את רוד-2/AM-MitoTracker ירוק פתרון להחליף אותו עם הפתרון של טמפרטורת החדר טרי Tyrode, דגירה זה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור.

7. קונאפוקלית הדמיה של מיטוכונדריאלי רוד-2/AM, זריחה MitoTracker ירוק

1. להעביר coverslip את המיקרוסקופ הדמיה קאמרית ולמלא את התא עם שטיפת פתרון.
2. תחת הגדרות עבור התבוננות תאים לעומת שלב בגיל 40 X, התאם המוקד עד תאים גלויים ולא בפוקוס.
3. Permeabilize קרום הפלזמה של רוד-2/AM-MitoTracker ירוק טעון תאים כדי להסיר רוד מותאם לשפות אחרות ציטוזול-2, תוך שמירה על צבע מותאם לשפות אחרות המיטוכונדריה.
   1. הסר את הפתרון לשטוף coverslip.
   2. להחליף אותו Permeabilization פתרון עבור-1 דקות.
   3. מבחינה ויזואלית לפקח על המורפולוגיה קרום פלזמה לאורך כל תהליך permeabilization. תאים permeabilized יפתחו משטח roughened.
   4. עם השלמת permeabilization, מיד להסיר את הפתרון Permeabilization ולהחליף אותו עם Ca 0^{2 +} פתרון פנימי.
4. במקביל תמונה רוד-2 קרינה פלואורסצנטית (עירור באמצעות ננומטר לייזר קו 559 פליטה שנאספו באורכי גל בין 575-675 nm), MitoTracker ירוק קרינה פלואורסצנטית (עירור באמצעות קו לייזר 488nm פליטה שנאספו באורכי גל בין 505-525 ננומטר). מתמקדים תאים permeabilized הצגה של colocalization ברור של רוד-2 ו MitoTracker ירוק.
5. להקטין את הלייזר מיקרוסקופ ולהשיג הגדרות כך מיטוכונדריאלי רוד-2 הוא עמום וגלוי רק.
6. בחר הגדרות מיקרוסקופ כדי לרכוש 2-ממדי סריקות בקורס קצב וזמן מסגרת מתאימה עבור היישום הספציפי. קצב מסגרות לפחות 30/s מומלץ לתפוס במדויק את קינטיקה של שינויים ב- Ca מיטוכונדריאלי^{2 +}.
7. . הסר את 0 Ca^{2 +} פתרון פנימי מבלי להפריע את התאים או מיקרוסקופ המוקד.
8. התחל ייבוא תמונות.
9. להוסיף Ca^{2 +}-הפתרון הפנימי גדושה בזמנו s 10 הצבע באופן ידני או באמצעות מערכת זלוף.
10. בחר אזורים מעניינים (ROIs) ולחלוש מחוזות colocalization בין מיטוכונדריאלי רוד-2 MitoTracker ירוק אות בתוכנה רכישת התמונה.
    הערה: זריחה שרירותי (נ) ערכים עבור כל נקודת זמן ההקלטה מתקבלים עבור כל רואי. ערכים אלה הם הרקע המופחת, מנורמל ל ידי קרינה פלואורסצנטית הראשונית (לפני Ca^{2 +} תוספת; F₀), התווה F/F₀ לאורך זמן עבור מסדי נתונים וכימות משרעת של השינוי של Ca מיטוכונדריאלי^{2 +}.

תוצאות

איור 1 מציג Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} ספיגת מדידות מבודד המיטוכונדריה הלב באמצעות הפלטפורמה המבוססת על הקורא צלחת, Ca^{2 +} סידן ירוק-5N צבע. בתנאים שליטה (איור 1 א'), המיטוכונדריה הלב היו מושעה אשלגן כלורי מאגר המכיל סידן ירוק-5N והזמנו ואז עם ?...

Discussion

כאן, אנו מתארים שתי גישות שונות כדי למדוד Ca מיטוכונדריאלי^{2 +} זרם. הצלחת סידן המבוסס על הקורא ירוק-5N שיטת צגים extramitochondrial Ca^{2 +} רמות, Ca^{2 +} ספיגת assay זה גם מתאים מידות המיטוכונדריה מבודד. בעוד אנחנו הראו תוצאות נציג מבודד מאתר המיטוכונדריה הלב, וזמינותו הזה יכול להיות מותאם בקלות ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olympus FV1000 Laser Scanning confocal microscope	Olympus	FV1000
Synergy Neo2 Multimode microplate reader with injectors	Biotek
Tissue Homogenizer	Kimble	886000-0022
22 x 22 mm coverslips	Corning	2850-22
96 well plate	Corning	3628
6 well plate	Corning	3506
Calcium Green-5N	Invitrogen	C3737
MitoTracker green FM	Invitrogen	M7514
Rhod-2, AM	Invitrogen	R1244
DMSO	Invitrogen	D12345
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
D-Mannitol	Sigma	M9546
Sucrose	EMD Millipore	8510
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E8145
Potassium chloride	Fisher	BP366-500
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P0662
Magnesium chloride	Sigma	M2670
Sodium pyruvate	Sigma	P2256
L-malic acid	Sigma	M1125
Calcium chloride	Sigma	C4901
Potassium acetate	Fisher	BP364-500
Adenosine 5′-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187
Phosphocreatine disodium salt	Sigma	P7936
Saponin	Sigma	S7900
Ru360	Calbiochem	557440