Revisión y análisis de la reparación de ADN usando análisis de extensión de un solo nucleótido y MALDI-TOF espectrometría de masa

Resumen

Se desarrolló un método no etiquetados, radio-isotópico para la corrección de la polimerasa de la DNA y un ensayo de reparación del ADN mediante espectrometría de masas MALDI-TOF alta resolución y una estrategia de extensión de un solo nucleótido. El ensayo demostró ser muy específico, simple, rápido y fácil de realizar para corregir y reparar los parches menor 9 nucleótidos.

Resumen

El mantenimiento del genoma y su fiel replicación es fundamental para conservar la información genética. Para evaluar la replicación de alta fidelidad, hemos desarrollado un simple no etiquetados y método radio-isotópica con una ionización de desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) de tiempo de vuelo total análisis de espectrometría (MS) para un estudio de revisión. Aquí, una polimerasa de ADN [por ejemplo, el fragmento de Klenow (KF) de polimerasa de la DNA de Escherichia coli I (pol I) en este estudio] en presencia de los cuatro trifosfatos de dideoxyribonucleotide se utiliza para procesar un duplex cartilla-plantilla. La cartilla es entonces revisado/ampliado y sometida a MS de MALDI-TOF. Los productos se distinguen por el cambio de masa de la cartilla a las variaciones de un solo nucleótido. Lo importante, una corrección también puede ser determinado por desajustes individuales internos, aunque a diferentes eficiencias. Situado en 2-4-nucleótidos (nt) desde el extremo 3' de desajustes fueron eficientemente corregido por pol I, y un desajuste en el 5 nt de la terminal de cartilla demostró solamente una corrección parcial. Sin corrección se produjo de desajustes internos ubicados en 6-9 nt desde el extremo 3' del primer. Este método puede aplicarse también al análisis de reparación de ADN (por ejemplo, evaluando una reparación de la lesión de base de sustratos para la vía de reparación endo V). Cartillas que contienen 3' penúltimo deoxyinosine (dI) lesiones podrían corregirse por pol I. De hecho, penúltima T-I, G-I y A-sustratos tuvieron su último 2 nucleótidos que contienen dI suprimido por pol I antes de agregar un correcta ddN 5'-monofosfato (ddNMP) al penúltimo C-desajustes fueron tolerados por pol I, permitiendo que la cartilla para extenderse sin reparación, demostrando que la sensibilidad y la resolución de la Sra. de ensayo para medir la reparación del ADN.

Introducción

Las funciones de corrección de polimerasas de la DNA durante la replicación del ADN son esenciales para asegurar la alta fidelidad de la información genética que debe ser transferido a la progenie^{1,2,3,4, 5,6,7}. Ser capaz de evaluar las contribuciones de polimerasa corrección situados aclara los mecanismos de salvaguarda de la estabilidad genética.

Etiquetado de radioisótopo y ensayos de gel en combinación con análisis densitométricos del fósforo de^8,9,10 autoradiograms tradicionalmente se han utilizado para detectar actividad de corrección de ADN polimerasas. Mientras que funcional, estos ensayos son laboriosos, costosos y no susceptibles de formatos de alto rendimiento. Además, radioisótopos sufren problemas de seguridad, incluyendo la eliminación de residuos. Por otra parte, actividades de corrección han sido analizadas por técnicas fluorométrica. Por ejemplo, 2-aminopurina (AP-2) puede ser incorporado en productos de la extensión durante en vitro polimerasa corrección ensayos para producir una señal fluorescente^11,12. Lamentablemente, estos enfoques sufren de una baja especificidad, ya que 2-AP puede emparejarse con la timina y citosina. Enfoques más recientes incluyen una sensible basada en G-quadruplex luminiscente encendido Sonda para una polimerasa 3' - 5' exonucleasa ensayo¹³ así como una sonda fluorescente etiquetado individualmente para una polimerasa corrección ensayo que supera algunas de las inconvenientes ya mencionados¹⁴. Entusiasmo por estos métodos fluorométrico es disminuido debido a la necesidad de que el etiquetado específico de substratos DNA.

Por el contrario, se ha empleado un MALDI-TOF MS para el análisis de ADN en el ensayo de punta, donde las reacciones de extensión de la cartilla con 4 ddNTPs pueden utilizarse para identificar polimorfismos en un locus dado^15,16,17 y ha sido adoptado ampliamente en aplicaciones clínicas para la detección de la mutación y diagnósticos de cáncer de¹⁸. Usando estos principios básicos, hemos creado un ensayo libre de etiqueta para la determinación en vitro de ADN polimerasa corrección actividad aprovechando la alta resolución, alta especificidad y alto rendimiento potencial de uso de MALDI-TOF MS. E. coli DNA polimerasa I Klenow fragmento como enzima modelo, dideoxyribonucleotide trifosfatos (ddNTPs) como sustratos pueden tomar una "instantánea" de revisión de productos después de un nucleótido simple extensión mediante MALDI-TOF MS (figura 1).

Además, este método fue desarrollado también para un ensayo de reparación del ADN en cartillas que contienen 3' penúltimo dI las lesiones son sometidas a un pol que reparar ensayo que imita endo V Mellado reparación intermedios. Mientras que no completamente entendida, la vía de reparación endo V es el único sistema de reparación a emplear la pol I corrección actividad exonucleasa por lesión supresión^19,20. Mediante MALDI-TOF MS, mostramos un parche de reparación claramente definidos donde dI puede ser suprimido por pol que cuando ocurre en los 2 últimos nt de la cartilla antes de agregar el nucleótido correcto complementa.

Para el estudio de revisión y reparación del ADN, este método es más rápido y menos laborioso que los anteriores métodos y proporciona información adicional hacia el mecanismo y función.

Protocolo

1. plantilla de cartilla de preparación

1. Diseño de primers/plantillas con un equilibrado contenido de G + C entre 40% y 60% como en una secuencia o un diseño de la cartilla PCR. Usar primers de 18 a 21 nt para mejor señales de MS y un recocido adecuado.
2. Diseño de la plantilla mediante el establecimiento de 50 ° C la mínima temperatura para la región duplex con al menos 7 de fusión nt de proyección 5' para separar las señales entre la cartilla y la plantilla.
   Nota: por ejemplo, para el substrato P21/T28 en la tabla 1, el primer de 21 nt se empareja con una plantilla de 28-nt. Opción: el uso de los ácidos nucleicos alternativos tales como nucleasa resistente fosfotioato bonos para reemplazar los 4 últimos enlaces fosfodiéster en el extremo 3' de la plantilla puede prevenir posibles interferencias por una degradación inespecífica 3' final de las plantillas ( por ejemplo,, T28S4 en la tabla 1), aunque esto añadirá algún costo para la preparación de la plantilla.
3. Utilizando oligonucleótidos desaladas estándar sin más purificación es satisfactoria para este estudio. Uso de oligonucleótidos iniciadores/plantillas en una concentración de 100 pmol/μl de H₂O como un stock y almacenar a-20 ° C. Compruebe la calidad y pureza de las cartillas y las plantillas mediante la ejecución de los oligonucleótidos en MALDI-TOF MS (pasos 4-7) para las señales de pico único y una buena relación señal a ruido.
4. Determinar las intensidades relativas de señal MS MALDI-TOF (paso 7) de los cebadores molares igual de las secuencias correspondientes en la reacción para la normalización de la calibración y la concentración (figura 2).

2. reacciones de corrección

Nota: La misma condición de reacción corrección y Protocolo se aplica a una reparación de la DNA de la A-I, G-I, C-I y T-I.

1. Usando un desajuste de la T G de sustrato P21/T28 para la corrección en la tabla 1 como un ejemplo, diluir P21 la cartilla y la plantilla T28 a 12.5 pmol/μl con H₂O; Luego traslado 12 μl del primer diluido y 12 μl de la plantilla diluida a un tubo de 1,5 mL estériles microcentrífuga.
   Nota: La cantidad de mezcla de plantilla/imprimación es suficiente para 2 reacciones; aumentar proporcionalmente el volumen de los reactivos por consiguiente para reacciones múltiples.
2. Cierre el tubo herméticamente. Incubar por 30 min en cubierto 65 ° C baño de agua, seguido por 30 min en un baño de 37 ° C y finalmente en hielo para un recocido correcto.
3. A un tubo de microcentrífuga esterilizada de 1,5 mL, añadir 8 μl de cebador y el tubo para mezclar la película mezcla de plantilla (50 pmol), 2 μl de 10 x corrección tampón de reacción, 4 μL de mezcla de 4 ddNTPs (2 mM de cada 4 dNTPs) y H₂O hasta 18 μL..
   Nota: 1 x corrección tampón de reacción contiene 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, Ditiotreitol 1 mM y 10 mM Tris-HCl (pH 7.9 a 25 ° C). Vea la Tabla de materiales para la fuente comercial de 10 x buffer de reacción de corrección. La concentración final de cada ddNTP en la reacción es de 0,1 mM.
4. Diluir la polimerasa de la DNA en la helada 1 x buffer de reacción para la concentración deseada de corrección [por ejemplo, a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 4 μL de 1 x corrección reacción tampón y 1 μl de polimerasa de Klenow 5 U de un origen comercial (tabla de Materials)]. Almacenar la enzima diluida en hielo en todo momento.
   Nota: La cantidad de ADN polimerasa diluida es suficiente para 2 reacciones; aumentar proporcionalmente el volumen de las enzimas por consiguiente para reacciones múltiples. Un volumen de 2.0 μL, que contiene 2,0 unidades de polimerasa de Klenow, puede corregir más de la mitad de 50 pmol de T-G terminal incompatible P21/T28 en 5 minutos.
5. Precaliente el tubo de microcentrífuga con la mezcla de sustrato del paso 2.3 a la temperatura de reacción deseada (por ejemplo, normalmente a 37 ° C para que la polimerasa de Klenow y 25 ° C para la polimerasa de la DNA de T4). Luego transferir 2.0 μL de la polimerasa de ADN diluida del paso 2.4 a la mezcla de sustrato precalentado y flick el tubo para mezclar su contenido.
6. Centrifugar los tubos con la enzima y el substrato durante unos segundos a 3.200 x g a temperatura ambiente a la desactivación de los componentes de las reacciones. Transferir inmediatamente la reacción a un bloque de calentamiento o baño de agua a la temperatura deseada de la incubación como en el paso 2.5.
7. Terminar la reacción
   1. Añadir un volumen igual de fenol tamponado, mezclar con un vórtex durante unos segundos y centrifugar en una microcentrífuga a 3.200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      1. Transferir la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio y añadir un volumen igual de cloroformo, mezclar con un vórtex durante unos segundos y centrifugar en una microcentrífuga a 3.200 x g a temperatura ambiente por 3 minutos transferir la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga limpio y en cubate a 95 ° C por 5 min; luego coloque en el hielo.
         PRECAUCIÓN: Fenol y cloroformo son productos químicos peligrosos. Eliminación de residuos y manejo debe seguir regulaciones institucionales.
   2. Como alternativa, utilizar un ácido apagando el protocolo. Para ello, añadir 2 μl de 1 M de HCl para detener la reacción en hielo por 6 min, luego añadir 0.64 μl de 1 M de dietanolamina (DEA) para neutralizar el pH de la mezcla de reacción e incubar a 95 ° C por 5 min; luego coloque en el hielo.

3. resina además de eliminar la contaminación de sal

1. Con la cucharada de resina de la desalinización comercial kit (véase la Tabla de materiales), tomar suficiente resina para cubrir las hendiduras de la placa de resina 384-hoyuelo, 6 mg.
2. Distribuir uniformemente la resina a través de las hendiduras (6 mg/hoyuelo) por raspado en la parte superior de la placa. Recuperar cualquier exceso de resina y vuelva a colocarla en la botella.
3. Transferencia de los productos de la reacción final de paso 2.7 de los tubos de microcentrífuga a una placa de 384 pozos. Añada 16 μl de H₂O para diluir los productos de la reacción final en cada pozo y sellar la placa y centrifugar para eliminar las posibles burbujas.
4. Retire el sello, gire la placa de 384 pocillos con los productos de reacción boca abajo para cubrir la placa llena de resina.
5. Voltee el sándwich de placas de bien a hoyuelo y cuidadosamente deje que la resina caiga en la placa de 384 pozos (Asegúrese de que la placa de 384 pozos quede al ras de la clavija de metal de la placa de relleno de resina).
6. Quitar la placa en la parte superior, sellar la placa de 384 pocillos que contienen las mezclas de los productos de reacción y de la resina, brevemente la centrífuga a 3.200 x g para eliminar las posibles burbujas y colocar en un agitador durante al menos 15 min a temperatura ambiente para su contenido de la desalación.
7. Después de la limpieza de resina, centrifugar la placa de 384 pozos a 3.200 x g durante 5 min compactar la resina en el fondo de los pozos.

4. transferencia de productos de la reacción a un Chip Matrix

1. Fijar las placas de muestra en el depósito del nanoliter (nanodispenser, ver la Tabla de materiales).
2. Puesto que la matriz de la viruta (véase la Tabla de materiales) y la placa de 384 pozos de sección 3.7 en la bandeja correspondiente.
3. Utilice el nanodispenser para ver los productos de reacción a la viruta; Presione el botón Ejecutar en la pantalla táctil de la nanodispenser para empezar.
4. Control de la imagen capturada automatizada de los puntos de muestra que contiene información de saturación en la pantalla para el volumen general de manchado en el chip está alrededor de 5-10 nL. Repetir la observación de la muestra si el volumen es insuficiente.

5. configuración de la información análisis de la espectrometría de masas

1. Preparar un archivo en formato .xls que contiene la información de la señal esperada para la importación. Por ejemplo, utilice el ajuste de "P21_T28.xls" (tabla 2) para la reacción corrección de P21/T28 en los pasos 2, 3 y 4.
2. Crear y definir un nuevo ensayo en el programa de aplicación (véase la Tabla de materiales) por clic Importación ensayo grupo diseñador formato y seleccione el archivo .xls (e.g., "P21_T28.xls" en el paso 5.1).
3. Establecer el objetivo ensayo placa mediante el árbol de la opción de Cliente: proyecto: placa en el lado izquierdo de la pantalla haciendo clic en la parte superior del árbol y dándole un nombre de archivo (por ejemplo, "CTT20171201" representa el código de ensayo y la fecha).
4. Seleccione el tipo de placa de 384 pozos y pulse OK; una placa en blanco aparecerá.
5. Seleccionar el análisis apropiado (por ejemplo, P21_T28) en el lado izquierdo de la pantalla.
6. Asignar el ensayo seleccionado (por ejemplo, P21_T28) para cada muestra manchado posición muestra en el chip resaltando el pozo y clic derecho para seleccionar Añadir Plex.
7. Prepare una lista de trabajo de todas las pruebas en el chip en formato .xlsx con ningún encabezado (por ejemplo, 1201.xlsx de la tabla 3). Importar el trabajo lista mediante la opción de Añadir nuevo proyecto muestra .
8. Asignar la prueba en la lista de trabajo (p. ej., de 1201.xlsx) a cada posición de la prueba de P21_T28 y elija haciendo clic derecho.

6. uso de MALDI-TOF MS operación

1. Vincular el espectrómetro de masas con el chip con el programa de aplicación (véase la Tabla de materiales).
2. Seleccione la configuración predeterminada en el lado derecho de la pantalla.
3. Rellene el nombre de ensayo de paso 5.3 (p. ej., CTT20171201), chip de identificación en la esquina de la viruta y guardar la configuración.
4. Iniciar el programa de control de MS (véase la Tabla de materiales).
5. Presione el botón In/Out y sacar la placa del explorador. Coloque la ficha manchada de paso 4.4 en la placa del explorador y presione el botón In/Out para el chip manchado entrar en el espectrómetro de masas.
6. Clic en el botón de la adquisición del programa de aplicación (véase la Tabla de materiales) para iniciar la espectrometría de masas y adquirir datos.

7. Análisis de datos

1. Abrir el programa para el análisis de datos (véase Tabla de materiales).
2. Examinar el árbol de la base de datos en la esquina superior izquierda y seleccione el ID del chip de paso 6.3. Abra el archivo de datos en el lado derecho de la pantalla.
3. Haga clic en el icono de espectro para visualizar el espectro de masas. Para recortar una gama específica de m/z, haga clic para seleccionar el Cuadro de diálogo de personalización y en la nueva ventana haga clic en eje x y establecer el límite superior e inferior deseado y pulse OK para mostrar el rango especificado del espectro.
4. Exportación el espectro de registros pulsando exportar.
   Nota: Utilizando una escala de la unidad ancho/1.200 1.600 es un tamaño razonable para inspección de datos en una pantalla de ordenador.
   1. Seleccione el tipo de archivo JPEG, haga clic en destino, seleccione Examinar disco (por ejemplo, flash disco E:), escriba el nombre del archivo (p. ej., 1201-1.jpg) y luego haga clic en exportar.
5. Para la cuantificación de datos, utilizar el cursor y haga clic en el pico a la altura del pico en la esquina superior izquierda.
   1. También puede imprimir un archivo JPEG exportado y medir la altura con una regla manualmente.

Resultados

Plantillas y cartillas:

Utilizando el procedimiento presentado aquí, igual plantillas molar oligonucleótidos sintéticos y cebadores de secuencias relevantes obtenidas de fuentes comerciales fueron comprobados por su pureza y calidad (Figura 3A; nota que las señales de emparejar la masa señalada y el bajo fondo) así como para la relación entre la intensidad máxima y la masa d...

Discusión

Este estudio describe un ensayo de actividad corrección paso a paso por el instrumento comercial solicitado (ver la Tabla de materiales) utilizando MS de MALDI-TOF. Las principales ventajas son que la cartilla y la plantilla son etiqueta gratuito y fácil de realizar, lo que permite una mayor flexibilidad en el diseño de experimentos. Una corriente-cal completa procesamiento de 30 corrección pruebas llevaría h 4, incluyendo 3 h para realizar manualmente las corrección de las reacciones y su limpieza...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotides	Mission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotides	Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment	New England Biolabs, MA	M0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-)	New England Biolabs, MA	M0212L
NEBuffer 2.1 (10X)	New England Biolabs, MA	B7202S
2', 3' ddATP	Trilink Biotechnologies, CA	N4001
2', 3' ddGTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4002
2', 3' ddTTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4004
2', 3' ddCTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set	Clubio, Taiwan	CB-R0315
SpectroCHIP array	Agena Bioscience, CA	#01509
MassARRAY	Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 software	Agena Bioscience, CA	#10145
Clean Resin Tool Kit	Agena Bioscience, CA	#08040