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要約

非標識、ラジオ-同位体 DNA ポリメラーゼの校正と DNA 修復アッセイ法は高分解能 MALDI-TOF 質量分析法および単一のヌクレオチドの拡張戦略を使用して開発されました。アッセイは、非常に特定、簡単、迅速かつ簡単に校正を実行し、修復するパッチ 9-ヌクレオチドより短いを証明しました。

要約

ゲノムとその忠実なレプリケーションのメンテナンスは、遺伝情報を節約するため重要です。忠実度の高いレプリケーションを評価するには、ラジオ-同位体比を用いたマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間 (MALDI-TOF) 質量分析法 (MS) 分析校正に関すると単純な非標識を開発しました。ここでは、DNA ポリメラーゼ [例えばエシェリヒア属大腸菌DNA ポリメラーゼの Klenow のフラグメント (KF) 私 (ポル私) 本研究で] すべての 4 dideoxyribonucleotide 三リン酸塩の存在下で不一致プライマー テンプレート二重の処理に使用します。不一致のプライマーは校正/拡張し、MALDI-TOF MS を受けます。製品は、単一のヌクレオチドのバリエーションにプライマーの質量の変化によって区別されます。重要なは、校正も決定できます内部単一不一致の異なる効率ではあります。3' 末端から 2-4-ヌクレオチド (nt) にある不一致が効率的に、pol で校正し、5 での不一致のプライマーの末端から nt を示した部分の補正のみ。プライマー 3' 末端から 6-9 nt にある内部不一致のため校正なかった。このメソッドは、DNA 修復アッセイ (例えば遠藤 V 修復経路のための基板のベース病巣修復の評価) にも適用できます。3' 終わりから二番目 deoxyinosine (dI) 病変を含むプライマーは、pol によって正されるかもしれない私。確かに、最後から二番目の T-私は、G-、私と -私基板があった最後の 2 ・ ディ ・含むヌクレオチド切除 pol で私、正しい ddN 5'-モノリン酸 (ddNMP) を追加する前に最後から二番目の C 中-私の不一致はポルで容認されたなし拡張するプライマーをできるように私修復、DNA 修復を測定するアッセイの感度と MS の分解能を発揮します。

概要

DNA の複製の時に DNA ポリメラーゼの校正関数子孫1,2,3,4に転送する必要があります遺伝情報の高忠実性を確保するために不可欠です。 5,6,7。Exonucleases の校正のポリメラーゼの貢献を評価することができるという遺伝的安定性の保護メカニズムを明らかにするでしょう。

放射性同位元素標識と autoradiograms または蛍光イメージング8,9,10のデンシトメトリーの分析と組み合わせてゲルに基づく試金 DNA の校正活動を検出する使用されている伝統的ポリメラーゼ。中機能、これらの試金は骨の折れる、高価、高スループットの形式に従わないです。さらに、放射性廃棄物処理を含む安全上の問題に苦しみます。また、蛍光法による校正活動を分析されています。などによる 2-アミノプリン (2 AP) は体外ポリメラーゼ蛍光信号11,12を生成するアッセイを校正中に拡張製品に組み込むことができます。残念ながら、2 AP はシトシンとチミンとペアすることができますので、これらのアプローチは低特異性と苦しみます。最近のアプローチにはいくつかを克服してアッセイを校正のポリメラーゼのため単独でラベルの蛍光プローブと同様に、3'-5' エキソヌクレアーゼ アッセイ13敏感 G ベースから発光スイッチにプローブ ポリメラーゼにはが含まれます、前述の欠点の14。Dna の特定の分類のため必要があるのためこれらの蛍光メソッドのための熱意は低下します。

対照的に、DNA 解析の MALDI-TOF MS は、PinPoint アッセイ、ラベルのない 4 ddNTPs のプライマー拡張反応を与えられた軌跡15,16,17遺伝子多型を識別するために使用できますで採用されている、突然変異の検出の臨床アプリケーションで採用されているがん診断18。これらの基本原則を使用して、我々 は校正活動の高解像度、高い特異性と MALDI-TOF さんを利用した大腸菌の高スループット能力を悪用する DNA ポリメラーゼの体外定量ラベル無料アッセイを作成しています。大腸菌基板は、単一のヌクレオチドの拡張を介してMALDI-TOF MS (図 1) 後製品を校正の「スナップショット」取ることができるモデルの酵素、dideoxyribonucleotide 三リン酸塩 (ddNTPs) として私 Klenow の断片 DNA ポリメラーゼ。

同様に、この法を開発した DNA 修復アッセイを含む 3' 終わりから二番目・ ディ ・病変が修復 pol にさらされるプライマーがどの模倣遠藤 V 傷修復中間体を分析します。完全には理解されて、遠藤 V 修復経路は病変切除19,20の exonuclease の作業を校正私 pol を採用する知られている唯一の修復システムです。MALDI-TOF MS を使用するを示す明確に定義された修復パッチによってポル ・ ディを摘出することができます私は、最後の 2 で発生した場合正しい補完ヌクレオチドを追加する前にプライマーの nt。

校正と DNA 修復の研究のため、このメソッドは、高速で、従来よりも少ない骨の折れる、メカニズムと機能に対する追加情報を提供します。

プロトコル

1. プライマー/テンプレートの準備

  1. シーケンスまたは PCR のプライマー デザインのように 60% と 40% の間のバランスの取れた G + C コンテンツを持つプライマー/テンプレートを設計します。18、21 のプライマーを使用して適切なアニーリングをおよびよりよい MS 信号のための nt。
  2. 最低少なくとも 7 二重地域の融点 50 ° C を設定して、テンプレートをデザイン テンプレートとプライマー信号を分離する 5' 突出部分の nt。
    注: たとえば、基板表 1に P21/T28、21 nt プライマーと共に 28 nt テンプレート。オプション: テンプレートの 3' 端に最後の 4 のリン酸ジエステル結合を置換するヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエート結合など代替の核酸の使用テンプレート (の非特異的 3' 端分解による誤動作を防ぐことができます。例えば、表 1に T28S4)、テンプレートの準備のためのいくつかのコストが追加されます。
  3. さらに精製することがなく標準脱塩オリゴヌクレオチドを使用しては、この研究のため満足です。在庫として 100 pmol/μ L H2O での濃度のオリゴヌクレオチドのプライマー/テンプレートを使用し、-20 ° C で保存MALDI-TOF MS (手順 4 ~ 7) ユニークなピーク信号と、良好な信号対雑音比を確保するためのオリゴヌクレオチドを実行して、品質とプライマーおよびテンプレートの純度を確認してください。
  4. 校正と濃度の正規化 (図 2) の反応に関連するシーケンスの等しいモル プライマーの相対的な MALDI-TOF MS 信号強度 (ステップ 7) を決定します。

2. 反応の校正

注: 同じ校正反応条件とプロトコル A の DNA 修復に適用されます-私は、G-私は、C-私と T-私。

  1. P21 のプライマーおよびテンプレート T28 H2O; 12.5 pmol/μ L に希釈例として表 1の校正用基板 P21/T28 T G が一致を使用して、1.5 mL 滅菌遠心チューブに希釈プライマーの 12 μ L と 12 μ L の希釈のテンプレートを転送します。
    注: テンプレート/プライマー ミックスの量は 2 反応には十分試薬の量も比例して増えます複数の反作用のため。
  2. チューブをしっかりと閉じます。37 ° C 水お風呂で 30 分続いて、カバー 65 ° C の水風呂で 30 分間インキュベートし、最終的に適切なアニーリングように氷の上。
  3. 1.5 mL 滅菌遠心チューブ、プライマーの 8 μ L を追加し、テンプレート ミックス (50 pmol)、2 μ L 反応バッファー、4 ddNTPs ミックス (各 4 dNTPs の 2 mM) と H2O 18 μ L. までの 4 μ L を校正 x 10 のフリックを混在させる管。
    注: 1 x 校正反応バッファーには、10 mM トリス-HCl (pH 7.9 25 ° c)、1 mM ジチオトレイトール 10 mM MgCl250 mM NaCl が含まれています。反応バッファーを校正 x 10 の商業のソースの材料の表を参照してください。各 ddNTP 反応の最終濃度は、0.1 mM です。
  4. 校正希望の濃度に反応バッファー x 冷たい 1 の DNA ポリメラーゼを希釈 [例えば、1.5 mL 遠心チューブに校正反応バッファーと 1 μ L 商業ソースから 5 U Klenow ポリメラーゼの x 1 の 4 μ L を追加 (テーブルのMaterials)]。すべての回で氷に希釈した酵素を保存します。
    注: 希釈した DNA ポリメラーゼの量が 2 反応には十分酵素の量も比例して増えます複数の反作用のため。Klenow ポリメラーゼの 2.0 ユニットを含む、2.0 μ L のボリュームは T G ターミナル不一致 P21/T28 5 分の 50 pmol の半分以上を校正できます。
  5. ステップ 2.3 から望ましい反作用の温度 (例えば、通常 37 ° C Klenow ポリメラーゼと T4 DNA ポリメラーゼの 25 ° C) に基板ミックスと遠心チューブを prewarm します。Prewarmed 基板の混合物にステップ 2.4 から 2.0 μ L の希釈の DNA ポリメラーゼを転送し、その内容をミックスするチューブをフリックします。
  6. 反応の部品を回転させる常温 3,200 x g で数秒間酵素と基質とチューブを遠心します。暖房のブロックまたは 2.5 の手順と必要な潜伏温水浴への反応をすぐに転送します。
  7. 反応を停止させます
    1. バッファリングされたフェノールの等しい量を追加、ボルテックスによって、数秒間それをミックス、5 分間常温 3,200 × g で遠心機で遠心分離機します。
      1. きれいな遠心管に水相を転送しクロロホルムの等しい量を追加、きれいおよび microfuge の管と水相を転送 3 分常温 3,200 x g でおよび microfuge のいくつかの秒と遠心分離機のボルテックスでそれをミックスcubate で 95 ° C、5 分。氷の上に置きます。
        注意: フェノールおよびクロロホルムは、有害化学物質です。処理、廃棄物処理は、制度上の規則に従う必要があります。
    2. また、プロトコルを急冷酸を使用します。このため、反作用を停止し、6 分間氷の上 1 M ジエタノールアミン (DEA) 反応混合物の pH を中和し 5 分; 95 ° C でインキュベートの 0.64 μ L を追加し 1 M HCl の 2 μ L を追加します。氷の上に置きます。

3. 樹脂添加塩の汚染を除去するために

  1. 商業脱塩から樹脂スクープを使用してキット (材料の表を参照してください)、384 ディンプル、6 mg 樹脂ディンプル プレートの窪みをカバーする十分な樹脂を取る。
  2. すべての窪みの樹脂を均等に分散 (6 mg/ディンプル) によってプレートの上部をこするします。任意の余分な樹脂を回復し、ボトルでそれを置き換えます。
  3. 384 ウェル プレート microfuge の管からの 2.7 段階から最終反応生成物を転送します。16 μ H2O 各ウェルの最終反応生成物を希釈し、プレート シールし、遠心分離機の任意の気泡を取除くためにそれを分配します。
  4. 384 ウェル プレート カバー樹脂充てんディンプル プレート逆さまに反応生成物をオンに、シールを削除します。
  5. まあ-ディンプル プレート サンドイッチを裏返してドロップ 384 ウェル プレートに樹脂を慎重にさせる (384 ウェル プレートが樹脂で満たされたディンプル プレートの金属のペグに対して必ず)。
  6. 上ディンプル プレートを取り外して、反応生成物の混合物を含む 384 ウェル プレート シール、樹脂、簡単に任意の泡を削除し、その内容を脱塩のため室温で少なくとも 15 分間回転子に配置 3,200 × g で遠心。
  7. ガレージの掃除の後で井戸の底に樹脂をコンパクトに 5 分間、3,200 x g 384 ウェル プレートを遠心します。

4. マトリックス チップに反応生成物を転送します。

  1. ナノリッター ディスペンサーのサンプル板を設定 (nanodispenser、材料の表を参照してください)。
  2. マトリックス チップ (材料の表を参照) を入れて、対応するトレイにセクション 3.7 から 384 ウェル プレート。
  3. チップ; 反応生成物のスポットに nanodispenser を動作します。開始する nanodispenser のタッチ スクリーンの実行ボタンを押します。
  4. チップの全体的な斑点を付けられたボリュームを確保するのには、画面の彩度情報を含むサンプル スポットの自動キャプチャした画像の周りはチェック 5 10 nL。ボリュームが十分な場合は、サンプルのスポッティングを繰り返します。

5. セットアップ法質量分析法について

  1. インポートの予想される信号情報を含む .xls 形式のファイルを準備します。たとえば、手順 2、3、および 4 で P21/T28 の校正の反応に"P21_T28.xls"(表 2) の設定を使用します。
  2. 作成し、アプリケーションの新しいアッセイを定義 (材料の表を参照してください) でデザイナーの形式でインポートの試金グループを右クリックし、.xls ファイルを (例えば5.1 のステップから"P21_T28.xls") を選択します。
  3. ツリーの最上部を右クリックし、ファイル名を与えることによって、ターゲットのアッセイ プレートを介して画面の左側にある顧客: プロジェクト: プレートオプション ツリーを確立 (例えば、"CTT20171201"分析コードと日付を表します)。
  4. 384 ウェル プレートの種類を選択し、 [ok]をクリックしてくださいブランク プレートが表示されます。
  5. 画面の左側にある適切な試金 (例えばP21_T28) を選択します。
  6. 井戸を強調表示し、プレックスの追加を選択します右クリックによってチップのサンプル位置を発見の各サンプルに対して選択した試金 (例えばP21_T28) を割り当てます。
  7. (例えば表 3の 1201.xlsx) ヘッダー無しで .xlsx 形式でチップ上のすべてのテストの作業リストを準備します。作業リスト経由で新しいサンプル プロジェクトの追加オプションをインポートします。
  8. P21_T28 試金の各位置に (例えば、1201.xlsx から) 作業] の一覧でテストを割り当てるしを右クリックして選択します。

6. MALDI-TOF MS 操作

  1. アプリケーション プログラムを使用してチップに質量分析計をリンク (材料の表を参照してください)。
  2. 画面の右側にある既定の設定を選択します。
  3. ステップ 5.3 (例えばCTT20171201)、チップ ID チップの端からアッセイ名を入力し、設定を保存します。
  4. MS の制御プログラムを起動 (材料の表を参照してください)。
  5. スカウト プレートを/アウトボタンを押して取り出してください。スカウト プレート ステップ 4.4 から斑点を付けられたチップを置き、質量分析計を入力する斑点を付けられたチップの/アウト] ボタンを押します。
  6. アプリケーション プログラムの取得ボタンをクリックして (参照材料表) 質量分析法を開始し、データを取得します。

7. データ解析

  1. データ分析のためのプログラムを開く (材料の表を参照してください)。
  2. 左上隅にあるデータベースのツリーを参照し、ステップ 6.3 からチップの ID を選択します。画面の右側にある上のデータ ファイルを開きます。
  3. 質量スペクトルを表示するスペクトルのアイコンをクリックします。M/z の特定の範囲をトリミングするには、カスタマイズ ダイアログを選択、新しいウィンドウで [ x 軸] をクリックして、目的の上限と下限の制限を設定およびスペクトルの指定された範囲を表示する[ok]を押して右クリックします。
  4. エクスポートを右クリックして記録のスペクトルをエクスポートします。
    注: 1,600 幅/1,200 単位のスケールを使用して、コンピューターの画面上のデータの検査の合理的なサイズです。
    1. JPEG ファイルの種類を選択して、宛先をクリックして、参照ディスク(例えば、フラッシュ ディスク e:) を選択、(例えば1201-1.jpg この)、ファイル名を入力、[エクスポート] をクリックします。
  5. データ定量、カーソルを使用して、左上隅にピーク高さを表示するピークにクリックします。
    1. または、エクスポートされた JPEG ファイルをプリント アウトし、手動で定規でピーク高さを測定します。

結果

テンプレートとプライマー:

示す手順を使用してここで、モルの合成オリゴヌクレオチド テンプレートを等しいし、商業ソースから得られた関連する配列のプライマーはその純度と品質 (図 3 a; 信号は、指定質量を一致するメモでチェックされました。・低バック グラウンドだけでなく?...

ディスカッション

本研究は商業の選ばれた器械を用いてステップバイ ステップ校正活性を説明 (材料の表を参照してください) MALDI-TOF MS を使用しています。主要な利点がありますプライマーとテンプレートが無料で簡単に行うには、ラベルである実験の設計の柔軟性を可能にします。ストリーム-石灰 30 校正テストの処理は、校正の反応を手動で実行するため 3 時間を含む 4 時間を取るだろうし、...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

機能ゲノム学 (台湾台北) とテクニカル サポートのための NRPB ファーマコゲノミクス研究室 (台湾)、NCFPB 統合中核施設に感謝しますこの作品は、台湾健康財団 (L ロス) と省科学技術、台北、台湾、中華民国 [最も 105-2320-B-002-047] 魏八尾胡錦濤に対してからの研究補助金によって支えられた [最も 105-2628-B-002-051-MY3] - カンイー Su と [MOST-105-2320-B-002-051-MY3] 梁でリンの。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
OligonucleotidesMission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNew England Biolabs, MAM0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-)New England Biolabs, MAM0212L
NEBuffer 2.1 (10X)New England Biolabs, MAB7202S
2', 3' ddATPTrilink Biotechnologies, CAN4001
2', 3' ddGTPTrilink Biotechnologies, CAN4002
2', 3' ddTTPTrilink Biotechnologies, CAN4004
2', 3' ddCTPTrilink Biotechnologies, CAN4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP setClubio, TaiwanCB-R0315
SpectroCHIP arrayAgena Bioscience, CA#01509
MassARRAYAgena Bioscience, CA
Typer 4.0 softwareAgena Bioscience, CA#10145
Clean Resin Tool KitAgena Bioscience, CA#08040

参考文献

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