Correzione di bozze e saggio di riparazione del DNA usando l'analisi di spettrometria di massa di singolo Nucleotide estensione e MALDI-TOF

Riepilogo

Un metodo non-radio-isotopica non etichettata per correzione di bozze della polimerasi del DNA e un saggio di riparazione del DNA è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF ad alta risoluzione e una strategia di estensione di singolo nucleotide. Il test ha dimostrato di essere molto specifico, semplice, rapida e facile da eseguire per la correzione di bozze e riparare le patch inferiore 9-nucleotidi.

Abstract

Il mantenimento del genoma e suo fedele replica è di primaria importanza per la conservazione di informazioni genetiche. Per valutare la replica ad alta fedeltà, abbiamo sviluppato un semplice non marcato e analisi di spettrometria (MS) per uno studio di correzione di bozze di massa non-radio-isotopica metodo utilizzando un'ionizzazione di matrix-assisted laser desorption con tempo di volo (MALDI-TOF). Qui, una polimerasi del DNA [per esempio, il frammento di Klenow della polimerasi di DNA di Escherichia coli (KF) ho (pol io) in questo studio] in presenza di tutti e quattro i trifosfati dideoxyribonucleotide viene utilizzato per elaborare un duplex non corrispondenti primer-modello. Il primer non corrispondente è quindi esteso Rileggi e sottoposti a MALDI-TOF MS. I prodotti si distinguono per la variazione della massa del primer fino a variazioni di singolo nucleotide. Importante, una correzione di bozze può anche essere determinato per interno singolo disadattamento, seppur alle efficienze diverse. Mancate corrispondenze in posizione 2-4-nucleotidi (nt) dall'estremità 3' sono stati efficacemente corretto da pol io, e una mancata corrispondenza alle 5 nt dal capolinea primer ha mostrato solo una parziale correzione. Nessuna correzione di bozze si è verificato per le mancate corrispondenze interne, situate al 6-9 nt da estremità 3' primer. Questo metodo può essere applicato anche ai test di riparazione del DNA (per esempio, valutare una riparazione di base-lesione dei substrati per la via di riparazione endo V). Primer contenenti 3' penultimo deoxyinosine (dI) lesioni potrebbe essere corretto da pol io. Infatti, penultimo T-I, G-I e A-ho substrati ha avuto loro ultimo 2 nucleotidi contenenti dI asportato da pol io prima di aggiungere un corretta ddN 5'-monofosfato (ddNMP) mentre la penultima C-mi mancate corrispondenze sono state tollerate da pol I, permettendo il primer per essere esteso senza riparazione, che dimostrano che la sensibilità e la risoluzione del MS test per misurare la riparazione del DNA.

Introduzione

Le funzioni di correzione di bozze di polimerasi del DNA durante la replicazione del DNA sono essenziali per garantire l'alta fedeltà dell'informazione genetica che deve essere trasferito alla progenie^{1,2,3,4, 5,6,7}. Essendo in grado di valutare il contributo della polimerasi esonucleasi correzione di bozze sarebbe chiarire i meccanismi di salvaguardia della stabilità genetica.

Etichettatura del radioisotopo e gel a base di saggi in combinazione con analisi densitometriche del autoradiogrammi o fosforo imaging^8,9,10 sono stati usati tradizionalmente per rilevare attività di correzione delle bozze del DNA polimerasi. Mentre funzionale, queste analisi sono laborioso, costoso e non suscettibili di formati ad alta velocità. In più, radioisotopi soffrono di problemi di sicurezza, compreso lo smaltimento dei rifiuti. In alternativa, correzione di bozze di attività sono stati analizzati mediante tecniche fluorometriche. Ad esempio, 2-aminopurine (2-AP) possa essere incorporati nei prodotti di estensione durante in vitro della polimerasi Revisione saggi per produrre un segnale fluorescente^11,12. Purtroppo, questi approcci soffrono di una bassa specificità, poiché 2-AP può abbinare con timina e citosina. Approcci più recenti includono una sensibile basati su G-quadruplex luminescente accensione sonda per una polimerasi 3' - 5' esonucleasi dosaggio¹³ come pure una sonda fluorescente etichettati singolarmente per una polimerasi correzione bozze di dosaggio che supera alcuni del suddetti inconvenienti¹⁴. Entusiasmo per questi metodi fluorimetrici è diminuita a causa della necessità per l'etichettatura specifica dei substrati di DNA.

Al contrario, un MALDI-TOF MS per l'analisi del DNA è stata impiegata nell'analisi della PinPoint, dove le reazioni di estensione del primer con adenoide 4 ddNTP possono essere utilizzate per identificare i polimorfismi a un dato locus^15,16,17 e è stato ampiamente adottato in applicazioni cliniche per i rilevamenti di mutazione e di diagnosi di cancro¹⁸. Utilizzando questi principi di base, abbiamo creato un'analisi senza etichetta per la determinazione in vitro del DNA polimerasi bozze attività sfruttando l'alta risoluzione, alta specificità e alto-rendimento potenziale di utilizzo di MALDI-TOF MS. E. coli DNA polimerasi ho Klenow frammento come un enzima di modello, dideoxyribonucleotide trifosfati (ddNTP) come substrati possono prendere un "snapshot" di correzione di bozze prodotti dopo un singolo nucleotide estensione tramite MALDI-TOF MS (Figura 1).

Allo stesso modo, questo metodo è stato sviluppato anche per un dosaggio di riparazione del DNA dove primer contenenti 3' penultima dI lesioni sono sottoposti a una pol che riparare dosaggio che imita endo V scalfito riparazione intermedi. Mentre non pienamente compreso, la via di riparazione endo V è l'unico sistema di riparazione conosciuto ad impiegare il pol ho correzione bozze attività esonucleasi per lesione asportazione^19,20. Mediante MALDI-TOF MS, vi mostriamo una patch di riparazione chiaramente definiti dove dI possono essere asportate da pol io quando che si verificano sulle ultime 2 nt del primer prima di aggiungere il nucleotide accompagnato corretto.

Per lo studio della revisione e riparazione del DNA, questo metodo è più veloce e meno laborioso rispetto ai metodi precedenti e fornisce informazioni aggiuntive verso meccanismo e funzione.

Protocollo

1. primer/template preparazione

1. Disegno primer/template con un equilibrato contenuto di G + C tra 40% e 60% come in un sequenziamento o disegno dell'iniettore di PCR. Utilizzare il primer di 18 a 21 nt per un appropriato ricottura e meglio MS segnali.
2. Progettazione del modello impostando 50 ° C come il minimo di temperatura per la regione duplex con almeno 7 di fusione nt di 5'-sporgenza per separare i segnali tra il primer e il modello.
   Nota: ad esempio, per il substrato P21/T28 nella tabella 1, il primer 21-nt è accoppiato con un modello 28-nt. Opzione: l'uso di acidi nucleici alternativi quali obbligazioni fosforotioato nucleasi-resistente per sostituire le ultime 4 fosfodiesterico all'estremità 3' del modello può prevenire possibili interferenze da una degradazione di fine aspecifici 3' dei modelli ( ad esempio, T28S4 in tabella 1), anche se questo aggiungerà alcuni costi per la preparazione del modello.
3. Utilizzo di oligonucleotidi standard dissalate senza ulteriore purificazione è soddisfacente per questo studio. Uso del oligonucleotide primer/modelli ad una concentrazione di 100 pmol / µ l in H₂O come uno stock e conservare a-20 ° C. Controllare la qualità e la purezza del primer e modelli eseguendo i oligonucleotides su MALDI-TOF MS (passaggi da 4 a 7) per garantire l'unico picco segnali e un buon rapporto segnale-rumore.
4. Determinare le intensità relative di segnale MALDI-TOF MS (passaggio 7) dei primer molare uguale delle sequenze rilevanti nella reazione per la calibrazione e la concentrazione normalizzazione (Figura 2).

2. reazioni di correzione di bozze

Nota: La stessa condizione di reazione correzione di bozze e il protocollo si applica a una riparazione del DNA della A-I, G-I, C-I e T-ho.

1. Utilizzando una mancata corrispondenza di T-G del substrato P21/T28 per la correzione di bozze in tabella 1 come esempio, diluire primer P21 e modello T28 a 12,5 pmol / µ l con H₂O; poi trasferimento 12 µ l di primer diluito e 12 µ l del modello diluito in una provetta da 1,5 mL sterilizzato microcentrifuga.
   Nota: La quantità di miscela modello/primer è sufficiente per 2 reazioni; proporzionalmente aumentare di conseguenza il volume dei reagenti per le reazioni multiple.
2. Chiudere saldamente la provetta. Incubare per 30 min in un bagno coperto 65-° C acqua, seguito da 30 min in un bagno di acqua di 37 ° C e, infine, sul ghiaccio per garantire una corretta ricottura.
3. In una provetta sterilizzata microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 8 µ l di primer e mix di modello (50 pmol), 2 µ l di 10 x correzione bozze tampone di reazione, 4 µ l di miscela di 4 ddNTP (2 mM di ogni 4 dNTP) e H₂O fino a 18 µ l. Flick il tubo per mescolare.
   Nota: 1 x correzione di bozze reazione buffer contiene 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitol e 10 mM Tris-HCl (pH 7.9 a 25 ° C). Vedi la Tabella materiali per la fonte commerciale di 10X tampone di reazione di correzione di bozze. La concentrazione finale di ogni ddNTP nella reazione è di 0,1 mM.
4. Diluire la DNA polimerasi nella gelida 1x tampone di reazione fino alla concentrazione desiderata di correzione di bozze [ad es., un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL, aggiungere 4 µ l di 1 x correzione di bozze tampone di reazione e 1 µ l della polimerasi di Klenow 5-U da una fonte commerciale (tabella di Materials)]. Conservare l'enzima diluito su ghiaccio a tutti i tempi.
   Nota: La quantità di polimerasi del DNA diluita è sufficiente per 2 reazioni; proporzionalmente aumentare di conseguenza il volume degli enzimi per reazioni multiple. Un volume di 2.0 µ l, contenente 2,0 unità della polimerasi di Klenow, può correggere le bozze di più della metà dei 50 pmoli di T-G terminal non corrispondenti P21/T28 in 5 min.
5. Preriscaldare il tubo del microcentrifuge con il mix di substrato dal passaggio 2.3 per la temperatura di reazione desiderata (ad esempio, in genere 37 ° C per Klenow della polimerasi e 25 ° C per T4 DNA polimerasi). Quindi trasferire la miscela di substrato preriscaldati 2.0 µ l della polimerasi del DNA diluita dal passaggio 2.4 e flick il tubo per mescolare il contenuto.
6. Centrifugare le provette con enzima e substrato per pochi secondi a 3.200 x g a temperatura ambiente a rotazione verso il basso i componenti delle reazioni. Trasferire immediatamente la reazione a un blocco riscaldante o un bagno di acqua alla temperatura di incubazione desiderato come descritto al punto 2.5.
7. Terminare la reazione
   1. Aggiungere un volume equivalente di fenolo tamponato e mescolare nel Vortex per pochi secondi e centrifugare in una microcentrifuga a 3.200 x g a temperatura ambiente per 5 min.
      1. Trasferire la fase acquosa ad un tubo del microcentrifuge pulito e aggiungere un volume equivalente di cloroformio, mescolare nel Vortex per pochi secondi e centrifugare in un microfuge a 3.200 x g a temperatura ambiente per 3 min. trasferire la fase acquosa in una provetta pulita microfuge e in cubate esso a 95 ° C per 5 min; poi metterlo sul ghiaccio.
         Attenzione: Fenolo e cloroformio sono sostanze chimiche pericolose. Manipolazione e smaltimento dovrebbe seguire regolamenti istituzionali.
   2. In alternativa, utilizzare un acido tempra protocollo. Per questo, aggiungere 2 µ l di 1 M HCl per fermare la reazione in ghiaccio per 6 minuti, quindi aggiungere 0,64 µ l di 1 M dietanolamina (DEA) per neutralizzare il pH della miscela di reazione e incubare a 95 ° C per 5 min; poi metterlo sul ghiaccio.

3. resina aggiunta per eliminare la contaminazione salina

1. Utilizzando la paletta a resina dalla desalificazione commerciale kit (vedere la Tabella materiali), prendere la resina sufficiente a coprire le fossette di piastra di resina 384-fossetta, 6 mg.
2. Distribuire uniformemente la resina in tutti le fossette (6 mg/fossetta) da raschiare la parte superiore della piastra. Recuperare eventuali eccessi di resina e sostituirlo nella bottiglia.
3. Trasferire i prodotti di reazione finale dal passo 2.7 dai tubi microfuge ad una piastra 384 pozzetti. Dispensare 16 µ l di H₂O per diluire i prodotti di reazione finale in ciascun pozzetto e poi sigillare la piastra e centrifugare per rimuovere eventuali bolle.
4. Rimuovere il sigillo, ruotare la piastra 384 pozzetti con i prodotti di reazione sottosopra per coprire la piastra piena di resina.
5. Capovolgere il panino di piastre bene-a e lasciar attentamente la resina cadere nella piastra 384 pozzetti (assicurarsi che la piastra 384 pozzetti è a filo contro un perno di metallo piastra di resina-riempito).
6. Rimuovere la piastra sulla parte superiore, sigillare la piastra 384 pozzetti contenenti miscele dei prodotti di reazione e resina, centrifugare brevemente esso a 3.200 x g per rimuovere tutte le bolle e inserirlo in un rotatore per almeno 15 min a temperatura ambiente per il contenuto di desalificazione.
7. Dopo la pulitura di resina, centrifugare la piastra 384 pozzetti a 3.200 x g per 5 min compattare la resina sul fondo dei pozzetti.

4. trasferire i prodotti di reazione a un Chip Matrix

1. Impostare le piastre campione del distributore nanolitro (nanodispenser, vedere la Tabella materiali).
2. Mettere la matrice di chip (Vedi la Tabella materiali) e la piastra 384 pozzetti da sezione 3.7 nel vassoio corrispondente.
3. Operare il nanodispenser per individuare i prodotti di reazione al chip; spingere il pulsante Esegui sul touch screen di nanodispenser per iniziare.
4. Controllo l'immagine catturata automatizzato dei punti campione contenente informazioni sullo schermo per garantire il volume complessivo maculato sul chip di saturazione è di circa 5-10 nL. Ripetere l'esempio spotting se il volume è insufficiente.

5. impostare le informazioni di analisi sulla spettrometria di massa

1. Preparare un file in formato. xls contenente le informazioni di segnale atteso per l'importazione. Ad esempio, è possibile utilizzare l'impostazione di "P21_T28.xls" (tabella 2) per la correzione di bozze reazione di P21/T28 nei passaggi 2, 3 e 4.
2. Creare e definire un nuovo dosaggio nel programma applicativo (Vedi la Tabella materiali) da clic destro Gruppo dosaggio importa in formato di progettazione e selezionare il file. xls (ad es., "P21_T28.xls" dal passaggio 5.1).
3. Stabilire la destinazione saggio piastra tramite l'albero di opzione del Cliente: progetto: piastra sul lato sinistro dello schermo facendo clic destro la cima dell'albero e dandogli un nome di file (ad esempio, "CTT20171201" rappresenta il codice di analisi e data).
4. Selezionare il tipo di piastra 384 pozzetti e premere OK; un piatto vuoto verrà visualizzato.
5. Selezionare il dosaggio appropriato (ad esempio, P21_T28) sul lato sinistro dello schermo.
6. Assegnare il test selezionato (ad esempio, P21_T28) per ogni campione ha notato la posizione del campione sul chip evidenziando il pozzo e cliccando col tasto destro per selezionare Aggiungi Plex.
7. Preparare una lista di lavoro di tutti i test sul chip in formato xlsx senza l'intestazione (ad es., 1201.xlsx della tabella 3). Importare il lavoro elenco tramite l'opzione Aggiungi nuovo progetto di esempio .
8. Assegnare il test nell'elenco di lavoro (ad es., da 1201.xlsx) a ciascuna posizione del dosaggio P21_T28 e scegliere cliccando col tasto destro.

6. MALDI-TOF MS funzionamento

1. Collegare lo spettrometro di massa per il chip utilizzando il programma di applicazione (vedere la Tabella materiali).
2. Selezionare l'impostazione predefinita sul lato destro dello schermo.
3. Inserire il nome di analisi dal punto 5.3 (ad esempio, CTT20171201), chip ID all'angolo del chip e salvare le impostazioni.
4. Avviare il programma di controllo di MS (Vedi la Tabella materiali).
5. Premere il tasto In/Out e togliere la piastra di scout. Posizionare il chip macchiato dal punto 4.4 sulla piastra di scout e premere il tasto In/Out per il chip macchiato di entrare lo spettrometro di massa.
6. Fare clic sul pulsante Acquisisci del programma applicativo (Vedi la Tabella materiali) per avviare la spettrometria di massa e acquisire dati.

7. analisi dei dati

1. Aprire il programma per l'analisi dei dati (Vedi Tabella materiali).
2. Esplorare la struttura del database all'angolo superiore sinistro e selezionare l'ID chip dal punto 6.3. Aprire il file di dati sul lato destro dello schermo.
3. Fare clic sull'icona di spettro per visualizzare lo spettro di massa. Per ritagliare un intervallo specifico di m/z, fare clic destro per selezionare la Finestra di dialogo personalizzazione e nella nuova finestra fare clic su asse x e impostare il limite superiore e inferiore desiderato e premere OK per mostrare l'intervallo specificato dello spettro.
4. Esportare lo spettro per mantenere facendo clic su Esportarecord.
   Nota: Utilizzando una scala di 1.600 larghezza/1.200 unità è di dimensioni ragionevoli per l'ispezione di dati sullo schermo del computer.
   1. Selezionare il tipo di file JPEG, clicca sulla destinazione, selezionare Sfoglia disco (ad esempio, disco flash e:), digitare il nome del file (ad es., 1201-1. jpg) e quindi fare clic su Esporta.
5. Per la quantificazione dei dati, utilizzare il cursore e clicca sulla cima per mostrare l'altezza di picco nell'angolo di sinistra superiore.
   1. In alternativa, stampare un file JPEG esportato e misurare l'altezza di picco con un righello manualmente.

Risultati

Modelli e primer:

Utilizzando la procedura presentata qui, uguale modelli molare oligonucleotide sintetico e primer di rilevanti sequenze ottenute da fonti commerciali sono stati controllati per la loro purezza e qualità (Figura 3A; notare che i segnali abbinato la massa designata e il basso fondo) così come per il rapporto tra l'intensità di picco e la massa di analita (

Discussione

Questo studio ha descritto una dettagliate analisi di attività correzione di bozze analizzata mediante lo strumento commerciale prescelto (Vedi la Tabella materiali) mediante MALDI-TOF MS. I vantaggi principali sono che il primer e il modello sono etichetta gratuito e facile da eseguire, permettendo una maggiore flessibilità nella progettazione di esperimenti. Un flusso-calce completa elaborazione di 30 correzione test avrebbe preso 4 h, tra cui 3 h per eseguire manualmente la correzione di bozze reazi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotides	Mission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotides	Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment	New England Biolabs, MA	M0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-)	New England Biolabs, MA	M0212L
NEBuffer 2.1 (10X)	New England Biolabs, MA	B7202S
2', 3' ddATP	Trilink Biotechnologies, CA	N4001
2', 3' ddGTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4002
2', 3' ddTTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4004
2', 3' ddCTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set	Clubio, Taiwan	CB-R0315
SpectroCHIP array	Agena Bioscience, CA	#01509
MassARRAY	Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 software	Agena Bioscience, CA	#10145
Clean Resin Tool Kit	Agena Bioscience, CA	#08040