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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Une méthode non marqué, non-radio-isotopiques pour la relecture de l’ADN polymérase et un test de réparation de l’ADN a été développée à l’aide de haute résolution spectrométrie de masse MALDI-TOF et une stratégie d’extension de nucléotide. Le test s’est avéré être très précis, simple, rapide et facile à réaliser pour la relecture et réparer les correctifs inférieure à 9-nucléotides.

Résumé

Le maintien du génome et sa reproduction fidèle est primordial pour la conservation des données génétiques. Pour évaluer la réplication haute fidélité, nous avons mis au point un simple non marqué et méthode non-radio-isotopique avec une désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF) temps de vol de masse analyse de spectrométrie (SM) pour une étude de relecture. Ici, une ADN polymérase [par exemple, le fragment de Klenow d’ADN polymérase d’Escherichia coli (KF) j’ai (pol je) dans cette étude] en présence de tous les quatre dideoxyribonucleotide triphosphates est utilisé pour traiter un duplex modèle primer ne correspondent pas. L’apprêt ne correspondent pas est puis relire/étendu et soumis à MALDI-TOF MS. Les produits sont distinguent par la variation de la masse du primaire vers le bas pour des variations nucléotidiques. Ce qui est important, une relecture peut aussi être déterminé pour inadéquation unique interne, quoiqu’à des rendements différents. Incompatibilités situées à 2-4-nucléotides (nt) de l’extrémité 3' ont été efficacement corrigé par pol I et une incompatibilité à 5 nt depuis le terminus de l’apprêt a montré seulement une correction partielle. Aucune relecture s’est produite pour les non-correspondances internes situés au 6-9 nt de l’extrémité 3' apprêt. Cette méthode peut également être appliquée aux dosages de réparation d’ADN (par exemple, évaluer une réparation de base-lésion de substrats pour la voie de réparation endo V). Amorces contenant 3' avant-dernier désoxyinosine (dI) lésions pourraient être corrigées par pol j’ai. En effet, avant-dernier T-I, G-I et A-j’ai les substrats présentaient leurs derniers 2 nucléotides contenant dI excisés par pol I avant d’ajouter un ddN correct 5'-monophosphate (ddNMP) tout en avant-dernière C-j’ai incompatibilités ont été tolérées par pol I, ce qui permet l’amorce d’étendre sans réparation, démontrant que la sensibilité et la résolution de la MS d’analyse permettant de mesurer la réparation de l’ADN.

Introduction

Les fonctions de relecture des polymérases d’ADN au cours de la réplication de l’ADN sont essentielles pour garantir la haute fidélité de l’information génétique qui doit être transférée aux descendants1,2,3,4, 5,6,7. Être en mesure d’évaluer les contributions de la polymérase relecture exonucleases préciserait les mécanismes de sauvegarde de la stabilité génétique.

Radio-isotope étiquetage et gel à base de tests en combinaison avec des analyses densitométriques des autoradiogrammes ou phosphore d’imagerie8,9,10 ont traditionnellement été utilisées pour détecter les activités de relecture de l’ADN polymérases. Bien que fonctionnel, ces tests sont laborieux et coûteux ne se prêtent pas à des formats de haut débit. En outre, radio-isotopes souffrent de problèmes de sécurité, y compris l’élimination des déchets. Alternativement, relecture des activités ont été analysées par des techniques de dosage fluorimétrique. Par exemple, 2-aminopurine (2-AP) peut être incorporé dans les produits d’extension au cours de la polymérisation in vitro en relecture d’épreuves pour produire un signal fluorescent11,12. Malheureusement, ces approches souffrent d’une faible spécificité, puisque 2-AP peut appairer avec thymine et cytosine. Des approches plus récentes incluent une base G-quadruplexe luminescente marche sonde sensible pour une polymérase 3' - 5' exonucléase dosage13 ainsi qu’une sonde fluorescente marquée individuellement pour une polymérase relecture analyse qui surmonte certaines de la les inconvénients susmentionnés14. L’enthousiasme pour ces méthodes fluorimétrique est diminuée en raison de la nécessité pour l’étiquetage précis de substrats de l’ADN.

En revanche, une MALDI-TOF-MS pour l’analyse de l’ADN a été utilisée dans l’essai de PinPoint, où les réactions d’extension amorce avec 4 ddNTPs sans étiquette peuvent être utilisées pour identifier des polymorphismes à un locus donné15,16,17 et a été largement adopté dans des applications cliniques pour la détection de la mutation et cancers diagnostiqués18. À l’aide de ces principes de base, nous avons créé un test exempte d’étiquette pour la détermination in vitro de l’ADN polymérase relecture activité exploitant la haute résolution, haute spécificité et haut débit potentiel de MALDI-TOF Mme utilisant la E. coli DNA polymérase I Klenow fragment comme enzyme modèle, dideoxyribonucleotide triphosphates (ddNTPs) comme substrats peuvent prendre un « instantané » de relecture des produits après un nucléotide simple extension par MALDI-TOF MS (Figure 1).

De même, cette méthode a été également développée pour un test de réparation de l’ADN où amorces contenant 3' avant-dernier dI lésions font l’objet d’un PPS que j’ai réparer dosage qui imite endo V entaillé réparation intermédiaires. Bien que pas entièrement compris, la voie de réparation endo V est le seul système de réparation connu pour employer la pol I correction activité exonucléasique pour lésion excision19,20. À l’aide de MALDI-TOF MS, nous montrons un patch de réparation clairement défini où dI peut être excisé par pol I quand survenant dans les 2 dernières nt de l’apprêt avant d’ajouter le nucléotide correctement complété.

Pour l’étude de la relecture et la réparation de l’ADN, cette méthode est plus rapide et moins laborieux que les méthodes précédentes et fournit des informations supplémentaires vers le mécanisme et la fonction.

Protocole

1. préparation d’amorce/modèle

  1. Créer des amorces/modèles avec une teneur en G + C équilibrée entre 40 % et 60 % comme un séquençage ou la conception d’amorces PCR. Utiliser les amorces de 18 à 21 nt pour un recuit approprié et de meilleurs signaux MS.
  2. Concevoir le modèle en définissant les 50 ° C étant le minimum de température pour la région de duplex au moins 7 de fusion nt du 5'-porte-à-faux pour séparer les signaux entre le primaire et le modèle.
    NOTE : par exemple, pour le substrat P21/T28 dans le tableau 1, l’amorce de 21-nt est couplé avec un modèle 28-nt. Option : l’utilisation d’autres acides nucléiques comme les obligations phosphorothioate nucléase-résistante pour remplacer les 4 dernières liaisons phosphodiester à l’extrémité 3' du modèle peut empêcher les interférences possibles par une dégradation non spécifique 3' extrémité des modèles ( par exemple, T28S4 dans le tableau 1), bien que cela va ajouter quelques frais pour la préparation du modèle.
  3. En utilisant des oligonucléotides de morue dessalées standards sans toute autre purification est satisfaisante pour cette étude. Utiliser des oligonucléotide amorces/modèles à une concentration de 100 pmol/µL en H2O comme un stock et conserver à-20 ° C. Vérifier la qualité et la pureté des amorces et les modèles en exécutant les oligonucléotides sur MALDI-TOF MS (étapes 4 à 7) pour assurer des signaux de pointe unique et un bon rapport signal sur bruit.
  4. Déterminer les intensités relatives du signal MALDI-TOF MS (étape 7) des amorces molaires égales des séquences pertinentes dans la réaction à la normalisation de l’étalonnage et la concentration (Figure 2).

2. réactions de relecture

Remarque : La même condition de réaction relecture et le protocole s’applique à une réparation de l’ADN de l’A-I, G-I, C-I et T-je.

  1. À l’aide d’un décalage de T-G du substrat P21/T28 pour la relecture dans le tableau 1 , à titre d’exemple, diluer l’apprêt P21 et modèle T28 à 12,5 pmol/µL avec H2O ; puis transfert 12 µL du primer dilué et 12 µL du modèle dilué dans un tube de 1,5 mL microcentrifugeuse stérilisé.
    Remarque : La quantité de modèle/apprêt mix est suffisante pour 2 réactions ; augmenter proportionnellement le volume des réactifs en conséquence pour plusieurs réactions.
  2. Bien refermer le tube. Il incuber 30 min à couvert 65-° C bain-marie, suivi de 30 min dans un bain d’eau de-37 ° C et enfin sur la glace pour assurer un bon recuit.
  3. Dans un tube de microcentrifuge stérilisé de 1,5 mL, ajouter 8 µL d’apprêt et mélange de modèle (50 pmol), 2 µL de 10 x relecture tampon de réaction, 4 µL du mélange 4 ddNTPs (2 mM de chaque 4 dNTPs) et H2O jusqu'à 18 µL. Flick le tube pour mélanger.
    Remarque : 1 tampon de réaction relecture x contient 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, dithiothréitol 1 mM et 10 mM Tris-HCl (pH de 7,9 à 25 ° C). Voir la Table des matières pour la source commerciale de 10 x relecture tampon de réaction. La concentration finale de chaque ddNTP dans la réaction est de 0,1 mM.
  4. Diluer l’ADN polymérase dans glacée 1 x tampon de réaction à la concentration voulue de relecture [par exemple, à un tube de microtubes de 1,5 mL, ajouter 4 µL de 1 x relecture tampon de réaction et de 1 µL de polymérase Klenow 5-U provenant d’une source commerciale (Table de Materials)]. Stocker l’enzyme dilué sur la glace en permanence.
    Remarque : La quantité de dilué ADN polymérase est suffisante pour 2 réactions ; augmenter proportionnellement le volume des enzymes en conséquence pour plusieurs réactions. Un volume de 2,0 µL, contenant des 2,0 unités de Klenow polymérase, peut relire plus de la moitié des 50 pmol de T-G terminal dépareillées P21/T28 en 5 min.
  5. Préchauffer le tube de microcentrifuge avec le mélange de substrat de l’étape 2.3 à la température de la réaction souhaitée (par exemple, généralement 37 ° C pour Klenow polymérase et 25 ° C pour T4 ADN polymérase). Puis transférer 2,0 µL de l’ADN polymérase dilué de l’étape 2.4 dans le mélange de substrat préchauffée et feuilleter le tube pour mélanger son contenu.
  6. Centrifuger les tubes avec l’enzyme et le substrat pendant quelques secondes à 3 200 g à la température ambiante pour filer vers le bas les composants des réactions. Transférer immédiatement la réaction à un bloc chauffant ou un bain d’eau à la température d’incubation désiré comme au point 2.5.
  7. Mettre fin à la réaction
    1. Ajouter un volume égal de phénol tamponné, mélanger au Vortex pendant quelques secondes et il centrifuger dans une microcentrifugeuse à 3 200 g à la température ambiante pendant 5 min.
      1. Transférer la phase aqueuse dans un tube de microcentrifuge propre et ajouter un volume égal de chloroforme, mélanger au Vortex pendant quelques secondes et centrifugeuse dans un microtube à 3 200 g à la température ambiante pendant 3 min. transférer la phase aqueuse dans un tube à centrifuger propre et en cubate il à 95 ° C pendant 5 min ; puis placez-le sur la glace.
        ATTENTION : Phénol et le chloroforme sont des produits chimiques dangereux. Manutention et d’évacuation doit suivre les règlements institutionnels.
    2. Sinon, utiliser un acide trempe de protocole. Pour ce faire, ajoutez 2 µL de 1 M HCl pour arrêter la réaction sur la glace pendant 6 min, puis ajouter 0,64 µL de 1 M, diéthanolamine (DEA) pour neutraliser le pH du mélange réactionnel et il incuber à 95 ° C pendant 5 min ; puis placez-le sur la glace.

3. résine Addition pour éliminer la Contamination saline

  1. Utilisant le scoop de la résine du dessalement commerciale nécessaire (voir la Table des matières), prendre la résine suffisante pour couvrir les fossettes de la plaque réactionnelle de la résine 384-Fossette, 6 mg.
  2. Répartir la résine à travers tous les fossettes (6 mg/fossette) en grattant dans la partie supérieure de la plaque. Récupérer n’importe quel excès de résine et remplacez-le dans la bouteille.
  3. Transférer les produits de la réaction finale d’étape 2.7 des microtubes à une plaque 384 puits. Distribuer 16 µL d’H2O à diluer les produits de la réaction finale dans chaque puits sceller la plaque, puis centrifuger pour éliminer toutes les bulles.
  4. Enlever le joint, tourner la plaque 384 puits avec les produits de la réaction à l’envers pour couvrir la plaque de résine remplis réactionnelle.
  5. Retournez le sandwich de plaques bien-à-Fossette et soigneusement laisser la résine chuter dans la plaque 384 puits (n’oubliez pas la plaque 384 puits affleure la cheville métallique sur la plaque de résine remplis réactionnelle).
  6. Retirez la plaque de la fossette sur le dessus, sceller la plaque 384 puits contenant des mélanges de produits de la réaction et de résine, il centrifuger brièvement à 3 200 g pour enlever les bulles et le placer sur un agitateur pendant au moins 15 minutes à température ambiante pour dessalement son contenu.
  7. Après le nettoyage de résine, centrifuger la plaque 384 puits à 3 200 g pendant 5 min compacter la résine jusqu’au fond des puits.

4. transfert des produits de réaction à une puce Matrix

  1. Mettre les plaques de l’échantillon dans le distributeur nanolitres (nanodispenser, voir la Table des matières).
  2. Mettre la matrice chip (voir la Table des matières) et la plaque 384 puits de section 3.7 dans le bac correspondant.
  3. Utiliser le nanodispenser pour repérer les produits de la réaction à la puce ; Appuyez sur le bouton exécuter sur l’écran tactile de la nanodispenser pour commencer.
  4. Vérifiez l’image saisie automatisée des taches échantillon contenant des informations à l’écran pour s’assurer que le volume global tacheté sur la puce saturation est d’environ 5-10 nL. Répétez l’échantillon repérer si le volume est insuffisant.

5. configurer les informations d’analyse sur la spectrométrie de masse

  1. Préparer un fichier au format .xls contenant les informations de signal prévu pour l’importation. Par exemple, utilisez le paramètre de « P21_T28.xls » (tableau 2) pour la réaction de relecture de P21/T28 en étapes 2, 3 et 4.
  2. Créer et définir une nouvelle méthode de dosage dans le programme d’application (voir la Table des matières) par un clic droit sur le Groupe test Import au Format Designer et sélectionnez le fichier .xls (p. ex., « P21_T28.xls » de l’étape 5.1).
  3. Mettre en place la cible test plaque via l’arborescence d’option Client : projet : plaque sur le côté gauche de l’écran par un clic droit sur le haut de l’arborescence et en lui donnant un nom de fichier (par exemple, « CTT20171201 » représente le code de test et la date).
  4. Sélectionnez le type de plaque 384 puits, puis appuyez sur OK; une plaque vierge s’affiche.
  5. Sélectionnez le test approprié (par exemple, P21_T28) sur le côté gauche de l’écran.
  6. Affecter le dosage sélectionné (par exemple, P21_T28) pour chaque échantillon repéré la position de l’échantillon sur la puce en sélectionnant le puits, puis un clic droit pour sélectionner Ajouter Plex.
  7. Préparer une liste de travail de tous les essais sur le circuit au format .xlsx avec aucun en-tête (par exemple, 1201.xlsx du tableau 3). Importer le travail liste via l’option Ajouter un nouveau projet échantillon .
  8. Le test dans la liste de travail (par exemple, de 1201.xlsx) d’affecter à chaque poste du dosage P21_T28 et choisissez par un clic droit.

6. MALDI-TOF MS opération

  1. Lien vers le spectromètre de masse à la puce en utilisant le programme d’application (voir la Table des matières).
  2. Sélectionnez le paramètre par défaut sur le côté droit de l’écran.
  3. Indiquez le nom de test de l’étape 5.3 (p. ex., CTT20171201), ID de la puce à l’angle de la puce et enregistrer les paramètres.
  4. Démarrez le programme de contrôle de MS (voir la Table des matières).
  5. Appuyez sur le bouton Entrée/sortie et sortez la plaque de scout. Placez le jeton tacheté à l’étape 4.4 sur la plaque de scout et appuyez sur le bouton Entrée/sortie pour la puce tacheté d’entrer dans le spectromètre de masse.
  6. Cliquez sur le bouton acquérir du programme d’application (voir la Table des matières) pour démarrer la spectrométrie de masse et d’acquisition de données.

7. analyse de données

  1. Ouvrez le programme pour l’analyse des données (voir la Table des matières).
  2. Naviguez dans l’arborescence de la base de données dans le coin supérieur gauche, puis sélectionnez l’ID de la puce de l’étape 6.3. Ouvrez le fichier de données sur le côté droit de l’écran.
  3. Cliquez sur l’icône pour afficher le spectre de masse du spectre. Pour rogner une gamme spécifique de m/z, faites un clic droit pour sélectionner la Boîte de dialogue Personnalisation et dans la nouvelle fenêtre cliquez sur axe des abscisses et fixer la limite supérieure et inférieure désirée et appuyez sur OK pour afficher la plage spécifiée du spectre.
  4. Exportation du spectre pour la tenue des registres en cliquant-droit à l’exportation.
    Remarque : En utilisant une échelle de 1 600 largeur/1 200 unité est une taille raisonnable pour l’inspection des données sur un écran d’ordinateur.
    1. Sélectionnez le type de fichier JPEG, cliquez sur la Destination, sélectionnez Parcourir disque (par exemple, flash disque E:), tapez le nom du fichier (par exemple, 1201-1.jpg) et puis cliquez sur Exporter.
  5. Pour le dosage de données, utilisez le curseur et cliquez sur le sommet pour montrer la hauteur du pic à l’angle supérieur gauche.
    1. Vous pouvez également imprimer un fichier JPEG exporté et mesurer la hauteur du pic avec une règle manuellement.

Résultats

Modèles et amorces :

À l’aide de la procédure présentée ici, égale modèles molaire oligonucléotide synthétique et amorces de séquences pertinentes obtenues de sources commerciales ont été vérifiés pour leur pureté et leur qualité (Figure 3 a; note que les signaux correspondant à la masse désignée et le faible bruit de fond) ainsi que pour la relation entre l’...

Discussion

Cette étude décrit une étape par étape analyse d’activité de relecture analysée par l’instrument commercial choisi (voir la Table des matières) à l’aide de MALDI-TOF MS. Les principaux avantages comprennent que l’apprêt et le modèle sont étiquette gratuit et facile à exécuter, ce qui permet une plus grande flexibilité dans la conception des expériences. Un flux bâtards complète transformation de 30 essais de relecture prendrait 4 h, y compris 3 h pour effectuer manuellement les r...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions la NCFPB intégrée Core Facility de génomique fonctionnelle (Taipei, Taiwan) et le laboratoire de la pharmacogénomique NRPB (Taipei, Taïwan) pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation santé de Taiwan (L-I.L.) et le ministère des sciences et technologie, Taipei, Taiwan, ROC [plus 105-2320-B-002-047] pour Hu Wei-Yao, recherche [plus 105-2628-B-002-051-MY3] pour Su Kang-Yi et [ Most-105-2320-B-002-051-My3] pour Liang-en Lin.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
OligonucleotidesMission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotidesIntegrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNew England Biolabs, MAM0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-)New England Biolabs, MAM0212L
NEBuffer 2.1 (10X)New England Biolabs, MAB7202S
2', 3' ddATPTrilink Biotechnologies, CAN4001
2', 3' ddGTPTrilink Biotechnologies, CAN4002
2', 3' ddTTPTrilink Biotechnologies, CAN4004
2', 3' ddCTPTrilink Biotechnologies, CAN4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP setClubio, TaiwanCB-R0315
SpectroCHIP arrayAgena Bioscience, CA#01509
MassARRAYAgena Bioscience, CA
Typer 4.0 softwareAgena Bioscience, CA#10145
Clean Resin Tool KitAgena Bioscience, CA#08040

Références

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