Revisão e ensaio de reparo de DNA usando extensão de nucleotídeo único e análise de espectrometria de massa MALDI-TOF

Resumo

Foi desenvolvido um método não-rotulados, não-rádio-isótopos para revisão de DNA polimerase e um ensaio de reparo de DNA usando espectrometria de massa MALDI-TOF de alta resolução e uma estratégia de extensão de nucleotídeo único. O ensaio provou ser muito específico, simples, rápida e fácil de executar para revisão e reparação patches menor que 9-nucleotídeos.

Resumo

A manutenção do genoma e sua replicação fiel é de suma importância para a conservação de informação genética. Para avaliar a replicação de alta fidelidade, nós desenvolvemos um simples não-rotulados e análise de espectrometria (MS) para um estudo de revisão de massa não-rádio-isótopos método usando uma ionização de dessorção do laser assistida por matriz com tempo-de-voo (MALDI-TOF). Aqui, uma DNA polimerase [por exemplo, o fragmento de Klenow (KF) de Escherichia coli DNA polimerase eu (pol eu) neste estudo] na presença de todos os quatro dideoxyribonucleotide trifosfatos é usado para processar um duplex de primeira demão-modelo incompatíveis. O primer incompatível é então estendido/revisado e submetido a MALDI-TOF MS. Os produtos distinguem-se pela variação da massa do primer até variações de nucleotídeo único. Importante, uma revisão pode também ser determinado para incompatibilidades única internas, embora a diferentes eficiências. Localizado em 2-4-nucleotídeos (nt) da extremidade 3' de incompatibilidades foram eficientemente revisado por pol eu, e um descompasso em 5 nt o terminus da primeira demão de mostrou apenas uma correção parcial. Nenhuma revisão ocorreu para incompatibilidades internas localizadas em 6-9 nt da extremidade 3' da primeira demão. Esse método também pode ser aplicado a ensaios de reparo do DNA (por exemplo, avaliar uma reparação da base-lesão de substratos para o caminho de reparação endo V). Cartilhas contendo 3' lesões penúltima deoxyinosine (dI) podem ser corrigidas por pol eu. Com efeito, penúltimo T-eu, G-eu e A-eu substratos tinham sua última 2 dI-contendo nucleotídeos extirpado por pol eu antes de adicionar um ddN correta 5'-monofosfato (ddNMP) enquanto o penúltimo C-eu incompatibilidades foram toleradas por pol eu, permitindo que o primer ser estendido sem reparação, demonstrando que a sensibilidade e a resolução do MS do ensaio para medir a reparação do DNA.

Introdução

As funções de revisão de polimerases de DNA durante a replicação do DNA são essenciais para garantir a alta fidelidade da informação genética que precisa ser transferido para progênie^{1,2,3,4, 5,6,7}. Ser capaz de avaliar as contribuições da polimerase revisão se exonucleases gostaria de esclarecer os mecanismos para salvaguardar a estabilidade genética.

Radioisótopo rotulagem e ensaios baseados em gel em combinação com análises densitométricos do autoradiograms ou do fósforo de imagem^8,9,10 tem sido tradicionalmente usados para detectar a atividade de revisão de DNA polimerases. Embora funcional, estes ensaios são trabalhoso, caro e não passível de formatos de alta produtividade. Além disso, radioisótopos sofrem de problemas de segurança, incluindo a eliminação de resíduos. Alternativamente, as atividades de revisão foram analisadas por técnicas fluorométrica. Por exemplo, 2-aminopurina (2-AP) pode ser incorporado em produtos de extensão durante a polimerase em vitro revisão ensaios para produzir um sinal fluorescente^11,12. Infelizmente, essas abordagens sofrem uma baixa especificidade, desde 2-AP pode emparelhar com timina e citosina. Abordagens mais recentes incluem uma sensível baseados em G-quadruplex luminescente ligar sonda para um polymerase 3' - 5' exonuclease ensaio¹³ , bem como uma sonda fluorescente-etiquetadas individualmente para um polymerase revisão ensaio que supera alguns do desvantagens acima de¹⁴. Entusiasmo para esses métodos fluorométrica é diminuído devido à necessidade da rotulagem específica de substratos de DNA.

Em contraste, uma MALDI-TOF MS para análise de DNA tem sido utilizada no ensaio de PinPoint, onde as reações de extensão da primeira demão com 4 ddNTPs sem rótulo podem ser usadas para identificar polimorfismos em um determinado locus^15,16,17 e foi adotado extensamente em aplicações clínicas para a detecção de mutações e câncer diagnostica¹⁸. Usando estes princípios básicos, nós criamos um rótulo livre ensaio para a determinação em vitro da DNA polimerase revisão atividade explorando a alta resolução, alta especificidade e potencial de alto rendimento de MALDI-TOF MS. usando o E. Coli DNA polimerase eu Klenow fragmento como uma enzima modelo, dideoxyribonucleotide trifosfatos (ddNTPs) como substratos podem tomar um "instantâneo" de revisão de produtos depois de um único nucleotídeo extensão através de MALDI-TOF MS (Figura 1).

Da mesma forma, este método também foi desenvolvido para um ensaio de reparo de DNA onde cartilhas contendo 3' penúltimo dI lesões são submetidas a uma pol que reparar o ensaio que imita endo V roubada reparação intermediários. Enquanto não são totalmente conhecidas, o caminho de reparação endo V é o único sistema de reparação conhecido para empregar o pol eu revisão atividade do exonuclease para excisão de lesão^19,20. Usando o MALDI-TOF MS, mostramos um remendo de reparação claramente definidos onde dI pode ser extirpado por pol eu quando ocorrem no último 2 nt do primer antes de adicionar o nucleotídeo complementado correto.

Para o estudo de revisão e reparação do ADN, este método é mais rápido e menos trabalhoso do que métodos anteriores e fornece informações adicionais para o mecanismo e função.

Protocolo

1. modelo de primer/preparação

1. Projetar primers/modelos com um conteúdo de G + C equilibrado entre 40% e 60% como em uma sequência ou projeto da primeira demão PCR. Use as primeiras demão de 18 a 21 nt para um recozimento apropriado e melhores sinais de MS.
2. O modelo de design, definindo a 50 ° C como o mínimo de temperatura para a região de frente e verso pelo menos 7 de fusão nt de 5'-saliência para separar os sinais entre o primer e o modelo.
   Nota: por exemplo, para o substrato P21/T28 na tabela 1, o primer 21-nt é emparelhado com um modelo 28-nt. Opção: o uso de alternativos ácidos nucleicos tais como resistente a nuclease phosphorothioate títulos para substituir a última 4 ligações fosfodiéster na extremidade 3' do modelo pode impedir a interferência possível, uma degradação de extremidade 3' não-específica dos modelos ( por exemplo,, T28S4 na tabela 1), embora isto irá adicionar algum custo para a preparação de modelo.
3. Usar o padrão oligonucleotides demolhados, sem qualquer outra purificação é satisfatória para este estudo. Uso do oligonucleotide cartilhas/modelos em uma concentração de 100 pmol / µ l em H₂O como um estoque e armazená-lo a-20 ° C. Verificar a qualidade e a pureza das primeiras demão e modelos executando os oligonucleotides na MALDI-TOF MS (passos 4-7) para garantir o único pico sinais e um bom sinal à relação de ruído.
4. Determine o relativo intensities de MALDI-TOF MS sinal (passo 7) dos primers molares iguais das sequências relevantes na reação para calibração e concentração normalização (Figura 2).

2. revisão de reações

Nota: O protocolo e a mesma condição de reação correcção aplica-se a uma reparação do ADN da-eu, G-eu, C-I e T-eu.

1. Usando uma incompatibilidade de T-G de substrato P21/T28 para a revisão na tabela 1 , por exemplo, diluir a primeira demão P21 e modelo T28 para 12,5 pmol / µ l com H₂O; Então transferi 12 µ l da primeira demão diluída e 12 µ l do modelo diluído para um tubo esterilizado microcentrifuga 1,5 mL.
   Nota: A quantidade de mistura modelo/primer é suficiente para 2 reações; proporcionalmente, aumentar o volume dos reagentes conformemente para várias reações.
2. Feche o tubo firmemente. -Incubar durante 30 min num coberto-65 ° C banho de água, seguido por 30 min em um banho de água de 37 ° C e finalmente no gelo para garantir uma adequada recozimento.
3. Para um tubo esterilizado microcentrifuga 1,5 mL, adicionar 8 µ l de primer e mistura de modelo (50 pmol), 2 µ l de 10 x revisão amortecedor da reação, 4 µ l de mistura de 4 ddNTPs (2 mM de cada 4 dNTPs) e H₂O até 18 µ l. Agite o tubo para misturar.
   Nota: 1 x revisão reação buffer que contém o 50mm NaCl, 10 mM MgCl₂, ditiotreitol 1 mM e 10 mM Tris-HCl (pH 7.9 a 25 ° C). Consulte a Tabela de materiais da fonte comercial de 10 x revisão amortecedor da reação. A concentração final de cada ddNTP na reação é de 0,1 mM.
4. Diluir a DNA polimerase na gelada 1x tampão de reação para a concentração desejada de revisão [por exemplo, para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, adicionar 4 µ l de 1 x revisão amortecedor da reação e 1 µ l de polymerase de Klenow 5-U de uma fonte comercial (tabela de Materials)]. Armazene a enzima diluída no gelo em todos os momentos.
   Nota: A quantidade de diluídos DNA polimerase é suficiente para 2 reações; proporcionalmente, aumentar o volume das enzimas em conformidade para várias reações. Um volume de 2,0 µ l, contendo 2,0 unidades de Klenow polimerase, pode revisar mais de metade dos 50 pmol de T-G terminal incompatíveis P21/T28 em 5 min.
5. Escaldar o tubo de microcentrifugadora com a mistura de substrato da etapa 2.3 para a temperatura de reação desejada (por exemplo, tipicamente 37 ° C para Klenow polimerase e 25 ° C para T4 DNA polimerase). Em seguida, transferir 2,0 µ l da DNA polimerase diluída de passo 2.4 para a mistura de substrato escaldadas e agite o tubo para misturar seu conteúdo.
6. Centrifuga os tubos com enzima e substrato durante alguns segundos a 3.200 x g, à temperatura ambiente a girar para baixo os componentes das reações. Transferi imediatamente a reação a um bloco de aquecimento ou um banho de água à temperatura de incubação desejado como na etapa 2.5.
7. Terminar a reação
   1. Adicionar um volume igual de fenol tamponado, misture-o vortexing por alguns segundos e centrifugá-lo numa microcentrifuga a 3.200 x g, à temperatura ambiente por 5 min.
      1. Transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrifugadora limpa e adicionar um volume igual de clorofórmio, misture-o pela utilização do Vortex durante alguns segundos e centrifugar em uma microcentrífuga a 3.200 x g, à temperatura ambiente por 3 min. transferir a fase aquosa para um tubo de microcentrífuga limpos e em cubate que a 95 ° C por 5 min; Coloque-o no gelo.
         Cuidado: Fenol e clorofórmio são produtos químicos perigosos. Eliminação de resíduos e manuseio deve seguir regulamentos institucionais.
   2. Como alternativa, use um ácido extinguendo o protocolo. Para isso, adicionar 2 µ l de 1 M HCl para parar a reação no gelo por 6 min, em seguida, adicione 0,64 µ l de 1m dietanolamina (DEA) para neutralizar o pH da mistura de reação e incube-a 95 ° C por 5 min; Coloque-o no gelo.

3. resina além de eliminar a contaminação de sal

1. Usando a colher de resina da dessalinização comercial kit (veja a Tabela de materiais), levar a resina suficiente para cobrir as ondulações da placa covinha 384-dimple, 6 mg de resina.
2. Distribuir a resina entre todas as ondulações uniformemente (6 mg/covinha) por raspagem na parte superior da placa. Recuperar qualquer excesso de resina e substituí-lo na garrafa.
3. Transferi os produtos da reacção final do passo 2.7 dos tubos de microcentrífuga para um placa de 384. Dispense a 16 µ l de H₂O para diluir os produtos de reação final em cada poço e, em seguida, selar a placa e centrifugar para remover quaisquer bolhas.
4. Remover o selo, vire a placa com os produtos de reação de cabeça para baixo para cobrir o prato cheio de resina covinha 384.
5. Vire o sanduíche de placas bem-para-dimple e cuidadosamente, deixe a resina cair a placa de 384 (certifique-se de que a placa de 384 é rente o pino de metal no prato cheio de resina covinha).
6. Retire a placa de covinha no topo, selar a placa 384 contendo as misturas dos produtos da reação e da resina, brevemente, centrifugue-a 3.200 x g para remover quaisquer bolhas e colocá-lo em rotacao pelo menos 15 min à temperatura ambiente para dessalinização de seu conteúdo.
7. Após a limpeza da resina, centrifugar a placa de 384 a 3.200 x g por 5 min compactar a resina no fundo dos poços.

4. transferir produtos de reacção a um Chip Matrix

1. Definir as placas de amostra no compartimento nanolitros (nanodispenser, consulte a Tabela de materiais).
2. Colocar o chip matrix (consulte a Tabela de materiais) e a placa de 384 de seção 3.7 na bandeja do correspondente.
3. Operar o nanodispenser para identificar os produtos de reação para o chip; Pressione o botão executar na tela de toque da nanodispenser para começar.
4. Veja se a imagem capturada automatizada das manchas de amostra contendo informações de saturação na tela para garantir o volume global de manchado no chip está em torno de 5-10 nL. Repita a amostra manchar se o volume for insuficiente.

5. configurar as informações de ensaio sobre a espectrometria de massa

1. Prepare um arquivo no formato. xls que contém as informações de sinal antecipado de importação. Por exemplo, use a configuração de "P21_T28.xls" (tabela 2) para a reação de correcção de P21/T28 nas etapas 2, 3 e 4.
2. Criar e definir um novo ensaio no programa aplicativo (consulte a Tabela de materiais) pelo botão direito do mouse o Grupo de ensaio de importação no formato de Designer e selecione o arquivo. xls (por exemplo, "P21_T28.xls" da etapa 5.1).
3. Estabelecer o alvo ensaio placa através da árvore de opção do Cliente: Projeto: placa no lado esquerdo da tela, clicando com o topo da árvore e dando-lhe um nome de arquivo (por exemplo, "CTT20171201" representa o código de ensaio e data).
4. Selecione o tipo de placa 384 e prima Okey; uma placa em branco será exibida.
5. Selecione o ensaio apropriado (por exemplo, P21_T28) no lado esquerdo da tela.
6. Atribua o ensaio selecionado (por exemplo, P21_T28) para cada amostra, visto a posição da amostra no chip destacando o poço e botão direito do mouse para selecionar Adicionar Plex.
7. Prepare uma lista de trabalho de todos os testes do chip no formato. xlsx com nenhum cabeçalho (por exemplo, 1201.xlsx do quadro 3). Importe o trabalho lista através da opção de Adicionar novo projeto de amostra .
8. Atribuir o teste na lista de trabalho (por exemplo, de 1201.xlsx) para cada posição do ensaio do P21_T28 e escolha clicando.

6. MALDI-TOF MS operação

1. Link o espectrômetro de massa para o chip usando o programa de aplicação (veja a Tabela de materiais).
2. Selecione a configuração padrão no lado direito da tela.
3. Preencha o nome de ensaio da etapa 5.3 (por exemplo, CTT20171201), ID do chip no canto do chip e salvar as configurações.
4. Iniciar o programa de controle de MS (ver a Tabela de materiais).
5. Pressione o botão de In/Out e retire a placa de escoteiro. Coloque o chip manchado da etapa 4.4 na chapa de escoteiro e pressione o botão de In/Out para o chip manchado entrar o espectrômetro de massa.
6. Clique no botão de aquisição do programa aplicativo (consulte a Tabela de materiais) para iniciar a espectrometria de massa e aquisição de dados.

7. análise de dados

1. Abra o programa para a análise de dados (consulte a Tabela de materiais).
2. Procurar na árvore do banco de dados no canto superior esquerdo e selecione o ID da microplaqueta da etapa 6.3. Abra o arquivo de dados no lado direito da tela.
3. Clique no ícone de espectro para exibir o espectro de massa. Para cortar um intervalo específico de m/z, botão direito do mouse para selecionar a Caixa de diálogo personalização e na nova janela, clique no eixo x e definir o limite superior e inferior desejado e pressione Okey para mostrar o intervalo especificado do espectro.
4. Exporte o espectro para registos clicando em Exportar.
   Nota: Usando uma escala de unidade de largura/1.200 1.600 é um tamanho razoável para inspeção de dados em uma tela de computador.
   1. Selecione o tipo de arquivo JPEG, clique no destino, selecione Browse disco (por exemplo, disco flash e:), digite o nome do arquivo (por exemplo, 1201-1. jpg) e, em seguida, clique em Exportar.
5. Para quantificação de dados, use o cursor e clique sobre o pico para mostrar a altura do pico no canto superior esquerdo.
   1. Alternativamente, imprima um arquivo JPEG exportado e medir a altura do pico com uma régua manualmente.

Resultados

Primers e modelos:

Usando o procedimento apresentado aqui, igual modelos molar do oligonucleotide sintéticas e primers de sequências relevantes obtidas de fontes comerciais foram verificadas por sua pureza e qualidade (Figura 3A; note que os sinais combinados a massa designada e o baixo fundo) bem como para a relação entre o pico de intensidade e a massa do analito (

Discussão

Este estudo descreveu um ensaio revisão passo a passo da atividade analisado pelo instrumento comercial escolhido (consulte a Tabela de materiais) usando MALDI-TOF MS. As principais vantagens incluem que o primer e o modelo são etiqueta grátis e fácil de executar, permitindo maior flexibilidade na criação de experiências. Uma fluxo-Cal completa de processamento de 30 testes de revisão levaria 4 h, incluindo 3 h para executar manualmente as correcção reações e sua limpeza, enquanto as análise...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotides	Mission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotides	Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment	New England Biolabs, MA	M0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-)	New England Biolabs, MA	M0212L
NEBuffer 2.1 (10X)	New England Biolabs, MA	B7202S
2', 3' ddATP	Trilink Biotechnologies, CA	N4001
2', 3' ddGTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4002
2', 3' ddTTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4004
2', 3' ddCTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set	Clubio, Taiwan	CB-R0315
SpectroCHIP array	Agena Bioscience, CA	#01509
MassARRAY	Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 software	Agena Bioscience, CA	#10145
Clean Resin Tool Kit	Agena Bioscience, CA	#08040