교정 및 DNA 복구 분석 결과 단일 뉴클레오티드 확장 및 TOF MALDI 질량 분석 분석을 사용 하 여

요약

교정 하는 DNA 중 합 효소와 DNA 수리 분석 결과 대 한 비 표시, 라디오 동위-방법 고해상도 TOF MALDI 질량 분석 및 단일 뉴클레오티드 확장 전략을 사용 하 여 개발 되었다. 분석 결과 매우 특정, 간단 하, 빠른, 고 교정에 대 한 수행 하 여 복구 패치 9-뉴클레오티드 보다 짧은 입증 했다.

초록

게놈의 충실 한 복제의 유지 보존 유전 정보에 대 한 최고 이다. 높은 충실도 복제, 평가 비 라는 간단한 개발 했습니다 하 고 매트릭스 보조 레이저 탈 착 이온화 시간의 비행 (TOF MALDI)와 함께 사용 하 여 라디오 동위-방법 질량 분석 (MS) 교정 연구에 대 한 분석. 여기, DNA 중 합 효소 [예를 들면, 대장균 DNA 중 합 효소의 Klenow 파편 (KF) 나 (폴 나)이 연구에서] 모든 4 개의 dideoxyribonucleotide 된 존재 일치 뇌관-템플릿 이중 처리 하는 데 사용 됩니다. 일치 하지 않는 입문서 다음 교정/확장 하 고 MALDI TOF MS를 받게. 제품은 단일 염기 변이 내려 뇌관의 질량 변화에 의해 구별 된다. 중요 한 것은, 한 교정 또한 확인할 수 있습니다 내부 단일 불일치에 대 한 다른 효율성에도 불구 하 고. 3' 끝에서 2-4-뉴클레오티드 (nt)에 있는 불일치 효율적으로 했다, 폴에 의해 교정 그리고 5에서 불일치 뇌관 종점에서 nt만 부분 수정. 아니 교정 뇌관 3' 끝에서 6-9 nt에 있는 내부 불일치에 대 한 발생 했습니다. 이 메서드는 또한 DNA 수리 분석 실험 (예를 들어, 엔 V 복구 경로 대 한 기판의 기본 병 변 수리 평가)에 적용할 수 있습니다. 뇌관 어 deoxyinosine (디) 병 변 3'를 포함 하는 폴에 의해 해결 될 수 나. 실제로, penultimate T-I, G-나, 그리고 A-나 기판 했다 그들의 마지막 2 디 포함 된 뉴클레오티드 excised 폴에 의해 나는 올바른 ddN 5'-monophosphate (ddNMP)를 추가 하기 전에 어 C 동안-나 불일치는 폴에 의해 용납 했다 나 뇌관 없이 확장 될 수 있도록 수리, 감도 및 해상도 MS의 DNA 복구를 측정 하는 분석 결과 보여주는.

서문

DNA 복제 시 DNA polymerases의 교정 기능 자손^1,2,3,4,^{로 전송 하는 유전 정보의 높은 충실도 보장 하기 위해 필수적입니다. 5,,67}. 중 합 효소 exonucleases 교정의 기여를 평가 하기 위해 수 있는 유전적 안정성을 보호 하는 메커니즘을 명확히 것.

방사성 표지와 젤 기반 분석 autoradiograms 또는 형광 이미징^8,,910 의 densitometric 분석을 함께 전통적으로 DNA의 교정 활동을 탐지 하는 데 사용 되었습니다. polymerases입니다. 기능을 하는 동안 이러한 분석 실험, 비싼, 힘들고 높은 처리량 포맷 하지 의무가 있습니다. 또한, radioisotopes 폐기물 처리 등 안전 문제를 겪고 있습니다. 또는, 교정 활동 fluorometric 기술에 의해 분석 되어 있다. 예를 들어 2-aminopurine (2-AP) 생체 외에서 중 합 효소 분석 실험 생산 형광 신호^11,12교정 동안 확장 제품에 통합할 수 있습니다. 2 AP thymine와 시 토 신 쌍 수 이후 불행 하 게도, 이러한 접근 낮은 특이성에서 고통. 더 최근의 접근 프로브를 포함 중요 한 G-quadruplex-기반 발광 스위치에는 중 합 효소에 대 한 중 합 효소의 일부를 극복 하는 분석 결과 교정에 대 한 단독으로 표시 된 형광 프로브로 서 3'-5' exonuclease 분석 결과¹³ 는 상기 단점¹⁴. 이러한 fluorometric 방법에 대 한 열정 DNA 기판의 특정 라벨에 대 한 필요 때문에 점감 된다.

반면, DNA 분석을 위한 TOF MALDI MS 뇌관 연장 반응 레이블이 없는 4 ddNTPs와 지정된 로커 스^15,,1617 에 동 질 다 상 식별 하 사용 될 수 있는 정밀한 분석 결과에서 고용은 고 돌연변이 탐지에 대 한 임상 응용에 널리 채택 되었습니다 및 암 진단¹⁸. 이러한 기본 원칙을 사용 하 여, 우리는 높은 해상도, 높은 특이성 및 MALDI TOF 양 사용 중 의 높은 처리량 잠재력을 악용 하는 활동을 교정 하는 DNA 중 합 효소의 생체 외에서 결정에 대 한 레이블 없는 분석 결과 만든 대장균 DNA 중 합 효소 나 Klenow 모델 효소, dideoxyribonucleotide 된 (ddNTPs)으로 조각 기판 제품을 단일 뉴클레오티드 확장 통해 MALDI TOF MS (그림 1) 후 교정의 "스냅숏" 걸릴 수 있습니다.

마찬가지로,이 방법은 또한이 어디 포함 3' 어 디 병 변 복구 나 폴을 복종 된다 뇌관 시험 어떤 모방도 긁어 V 수리 중간체 DNA 수리 분석 결과 대 한 개발 되었다. 완전히 이해 하는 동안 엔 V도 수리 통로 교정 exonuclease 활동 병 변의 절단^19,20대 나는 폴을 알려진 유일한 복구 시스템입니다. 표시 사용 하 여 MALDI TOF MS, 우리는 명확 하 게 정의 된 수리 패치 어디 디 폴에 의해 excised 수 마지막 2에서 발생 하는 경우 나 올바른 보충된 뉴클레오티드를 추가 하기 전에 뇌관의 nt.

교정 및 DNA 복구의 연구를 위해이 방법은 빠르고 덜 이전 방법 보다는 힘이 드는 이며 메커니즘 및 기능으로 추가 정보를 제공 합니다.

프로토콜

1. 뇌관/서식 파일 준비

1. 프라이 머/시퀀싱 또는 PCR 뇌관 디자인 60%와 40% 사이 균형된 G + C 함량 된 서식 파일을 디자인 합니다. 18-21의 뇌관을 사용 하 여 적절 한 열 처리 및 더 나은 MS 신호에 대 한 nt.
2. 용융 온도 이상 7 이중 지역에 대 한 최소 50 ° C를 설정 하 여 서식 파일을 디자인 뇌관와 템플릿 간의 신호 분리 5'-오버행의 nt.
   참고: 예를 들어 기판 P21/T28 표 1에 대 한 21-nt 뇌관은 짝을 28-nt 서식 파일. 옵션: nuclease 저항 phosphorothioate 채권 대체 서식 파일의 3' 끝에 마지막 4 phosphodiester 채권 등 다른 핵 산의 사용 서식 파일 ( 의 일반적인 3' 끝 저하에 의해 가능한 방해를 방지할 수 있습니다. 예를 들어, 표 1에서 T28S4), 비록 서식 파일 준비에 대 한 약간의 비용이 추가 됩니다.
3. 더 이상 정화 없이 표준 desalted oligonucleotides를 사용 하 여이 연구에 대 한 만족 이다. 주식으로 pmol 100 µ H₂O/L의 농도에서 oligonucleotide 뇌관/서식 파일을 사용 하 고-20 ° c.에 그것을 저장합니다 oligonucleotides 독특한 피크 신호 및 좋은 신호 대 잡음 비 MALDI TOF MS (4-7 단계) 실행 하 여 품질 및 뇌관 및 서식 파일의 순도 확인 합니다.
4. 교정 및 농도 정규화 (그림 2)에 대 한 반응에 관련 시퀀스의 동등 어 금 니 뇌관의 상대 MALDI TOF MS 신호 강도 (7 단계)를 결정 합니다.

2. 반응 교정

참고: 동일한 교정 반응 조건 및 프로토콜 A의 DNA 복구에 적용 됩니다-난, G-I, C-, 및 T-나.

1. 예를 들어 표 1 에서 교정에 대 한 기판 P21/T28의 불일치를 T-G를 사용 하 여, 희석 뇌관 P21 및 템플릿을 T28 µ L pmol 12.5/H₂O; 그런 다음 멸 균된 microcentrifuge 1.5 mL 튜브 희석된 뇌관의 12 µ L와 12 µ L 희석된 서식 파일의 전송.
   참고: 템플릿/뇌관 믹스의 금액은 2 반응;에 대 한 충분 한 따라는 시 약의 볼륨을 증가 비례 여러 반응에 대 한.
2. 튜브를 단단히 닫습니다. 대상된 65 ° C 물 목욕, 37 ° C 물 욕조에 30 분 뒤에 30 분 동안 품 어 그리고 마지막으로 적절 한 어 닐 링을 보장 하기 위해 얼음에.
3. 멸 균된 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 뇌관의 8 µ L을 추가 하 고 템플릿 믹스 (50 pmol), 교정 반응 버퍼, 4 ddNTPs 믹스 (각 4 dNTPs의 2 m m), 및 H₂O 18 µ L.까지 4 µ L x 10의 2 µ L를 섞어 튜브 영화.
   참고: 1 x 교정 반응 버퍼에 50 mM NaCl, 10 m m MgCl₂, 1 m m dithiothreitol, 및 10 mM Tris HCl (25 ° C에서 pH 7.9)가 포함 되어 있습니다. 10x 반응 버퍼 교정의 상용 소스에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 각 ddNTP는 반응에서의 최종 농도 0.1 m m 이다.
4. 원하는 농도에 반응 버퍼 교정 x 얼음 1에 DNA 중 합 효소를 희석 [예를 들어, microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 반응 버퍼 및 상업적인 소스에서 5 U Klenow 중 합 효소의 1 µ L 교정 x 1의 4 µ L을 추가 (테이블의 Materials)]. 모든 시간에 얼음에 희석된 효소를 저장 합니다.
   참고: 희석된 DNA 중 합 효소의 양 만으로는 2 반응; 비례에 따라 효소의 볼륨을 증가 여러 반응에 대 한. Klenow 중 합 효소의 2.0 단위를 포함 하는 2.0 µ L의 볼륨의 T-G 터미널 일치 P21/T28 5 분에 50 pmol의 절반 이상을 교정 수 있습니다.
5. 2.3 단계에서 원하는 반응 온도 (예를 들어, 일반적으로 37 ° C Klenow 중 합 효소 및 T4 DNA 중 합 효소에 대 한 25 ° C) 기판 믹스와 함께 microcentrifuge 튜브를 prewarm. Prewarmed 기판 혼합물에 단계 2.4에서에서 2.0 µ L 희석된 DNA 중 합 효소의 전송 그리고 그 내용을 혼합 튜브 영화.
6. 반응의 구성 요소를 회전 하는 주위 온도에 3200 x g에서 몇 초 동안 효소와 기질 튜브 원심. 즉시 전송 난방 블록 또는 단계 2.5에서 원하는 외피 온도에 물 욕조에 반응.
7. 반응 종료
   1. 버퍼링 된 페 놀의 동등한 볼륨을 추가 하 고 몇 초 동안 그것을 vortexing에 의해 혼합 5 분 주위 온도에 3200 x g에서 microcentrifuge에서 원심.
      1. 수성 단계 깨끗 한 microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가, 몇 초 동안 원심 분리기에 깨끗 한 microfuge 관을 3 분에 대 한 주위 온도에 3200 x g에서 microfuge에 수성 단계 전송 vortexing에 의해 혼합 cubate; 5 분 동안 95 ° C에서 다음 얼음에 그것을 장소.
         주의: 페 놀과 클로 프롬은 유해 화학 물질입니다. 처리 및 폐기물 처리 제도 규정을 따라야 한다.
   2. 또는 사용 하는 프로토콜을 냉각 하는 산. 이 위해 6 분 동안 얼음에 반응을 중지 후 1 M diethanolamine (마약)을 반응 혼합물의 pH를 중화 하 고 5 분; 95 ° C에서 그것을 품 어의 0.64 µ L을 추가 1 M HCl의 2 µ L를 추가 다음 얼음에 그것을 장소.

3. 수 지 뿐만 아니라 소금 오염 제거

1. 상용 담 수 지 국자를 사용 하 여 키트 ( 재료의 표참조), 384-보조 개, 6 mg 수 지 시료 접시의 보조 개를 충당 하기 위해 충분 한 수 지.
2. 수 지 모든 보조 개에 걸쳐 균등 (6 mg/보조 개) 접시의 위쪽에 된다고 하 여. 어떤 과잉 수 지를 복구 하 고 병에 합니다.
3. 384-잘 접시 microfuge 관에서 2.7 단계에서 최종 반응 제품을 전송. 16 µ L H₂O 각 잘에서 최종 반응 제품을 희석 하 고 접시 인감 모든 거품을 제거 하는 그것을 원심의 분배.
4. 물개를 제거, 수 지 가득 보조 개 접시를 거꾸로 반응 제품 384-잘 접시.
5. 우물-보조 번호판 샌드위치를 뒤집어 고 주의깊게 384-잘 접시에 수 지 (384-잘 접시 수 지 가득 보조 개 접시에 금속 말뚝에 대 한 플러시 되었는지 수).
6. 위에 보조 플레이트를 제거, 반응 제품의 혼합물을 포함 하는 384-잘 접시 인감 및 수 지, 잠시 모든 거품을 제거 하 고 그 내용을 담 대 한 실내 온도에 적어도 15 분 동안 회전에 3200 x g에서 원심.
7. 수 지 정리 후 원심 우물의 바닥에 수 지를 압축 하려면 5 분 동안 3200 x g에서 384-잘 접시.

4. 전송 반응 제품 매트릭스 칩을

1. Nanoliter 디스펜서에 샘플 접시를 설정 (nanodispenser, 테이블의 자료를 참조).
2. 넣어 매트릭스 칩 ( 테이블의 자료참조)와 해당 트레이에 섹션 3.7에서에서 384-잘 접시.
3. 칩; 반응 제품 자리를 nanodispenser 운영 시작 하는 nanodispenser의 터치 스크린에 실행 버튼을 눌러.
4. 확인 채도 정보를 칩에 전체 목격된 볼륨을 보장 하기 위해 화면에 포함 된 샘플 명소의 자동화 된 캡처된 이미지 주위 5-10 nL. 볼륨이 충분 하지 않으면 샘플 안보 반복 합니다.

5. 설치 질량 분석에 분석 결과 정보

1. .Xls 형식 가져오기에 대 한 예상된 신호 정보를 포함 하는 파일을 준비 합니다. 예를 들어 2, 3, 4 단계에서 P21/T28의 교정 반응에 대 한 "P21_T28.xls" (표 2)의 설정을 사용 합니다.
2. 만들고 응용 프로그램에서 정의 하는 새로운 분석 결과 ( 재료의 표참조)으로 디자이너 형식에서 가져오기 분석 결과 그룹 을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 (예를 들어, "P21_T28.xls" 단계 5.1에서에서).xls 파일 선택.
3. 나무의 상단을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 파일 이름을 여는 대상 분석 결과 판 트리를 통해 고객: 프로젝트: 플레이트 옵션 화면의 왼쪽에 설정 (예를 들어, "CTT20171201" 분석 결과 코드와 날짜 나타냅니다).
4. 384-잘 접시 유형을 선택 하 고 눌러 확인; 빈 접시를 나타납니다.
5. 스크린의 왼쪽에 (예를 들어, P21_T28)에 적절 한 분석 결과 선택 합니다.
6. 잘 강조 하 고 추가 플렉스를 선택 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 칩 샘플 위치를 발견 하는 각 샘플에 대 한 (예, P21_T28) 선택 된 분석 결과 할당 합니다.
7. (예를 들어, 표 3의 1201.xlsx) 아니 헤더와.xlsx 형식에서 칩에 모든 테스트 작업 목록을 준비 합니다. 작업 목록 옵션을 통해 추가 새 샘플 프로젝트 를 가져옵니다.
8. P21_T28 분석 결과의 각 위치에 (예를 들어, 1201.xlsx에서) 작업 목록에 테스트를 할당 하 고 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 선택 합니다.

6. MALDI TOF MS 가동

1. 응용 프로그램을 사용 하 여 칩을 질량 분석기를 연결 ( 재료의 표참조).
2. 화면 오른쪽에서 기본 설정을 선택 합니다.
3. 분석 결과 이름 단계의 5.3 (예, CTT20171201), 칩, 칩의 ID와 설정을 저장.
4. MS 제어 프로그램을 시작 ( 재료의 표참조).
5. In/Out 버튼 누르고 스카우트 접시를 꺼내. 스카우트 접시에 4.4 단계에서 발견된 칩 놓고 질량 분석기를 입력 발견된 칩에 대 한 In/Out 버튼을 누르십시오.
6. 응용 프로그램의 인식 버튼을 클릭 ( 재료의 표참조) 질량 분석을 시작 하 고 데이터를.

7. 데이터 분석

1. 데이터 분석을 위한 프로그램 ( 재료의 표참조).
2. 왼쪽된 상단에 데이터베이스 트리를 단계 6.3에서에서 칩 ID를 선택 합니다. 스크린의 오른쪽에 데이터 파일을 엽니다.
3. 질량 스펙트럼을 표시 하려면 스펙트럼 아이콘을 클릭 합니다. 특정 범위의 m/z를 자르려면, 사용자 지정 대화 상자를 선택 하 고 새 창에서 클릭 x 축 에 원하는 위와 더 낮은 제한을 설정 하 고 스펙트럼의 지정된 된 범위를 표시 하려면 확인 을 누릅니다을 마우스 오른쪽 단추로.
4. 수출을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여 유지 하는 기록에 대 한 스펙트럼을 내보냅니다.
   참고: 컴퓨터 화면에 데이터 검사에 대 한 합리적인 크기는 1600 폭/1200 단위의 규모를 사용 하 여.
   1. JPEG 파일 형식을 선택 대상에 클릭 합니다, 그리고 찾아보기 디스크 (예를 들어, 플래시 디스크 e:), 파일 이름을 입력 합니다 (예를 들어, 1201-1.jpg), 선택한 내보내기클릭.
5. 데이터 정량에 대 한 커서를 사용 하 고 피크 피크 높이 왼쪽 상단에 표시 클릭 합니다.
   1. 또는 내보낸된 JPEG 파일을 인쇄 하 고 수동으로 통치자와 피크 높이 측정.

결과

서식 파일 및 뇌관:

제시 하는 절차를 사용 하 여 여기, 어 금 니 합성 oligonucleotide 서식 파일이 고 상업적인 소스에서 얻은 관련 시퀀스의 뇌관 그들의 순수성 및 (그림 3A; 참고 지정된 질량을 일치 하는 신호 품질에 대 한 확인 그리고 낮은 배경) 뿐만 아니라 피크 강도와 실정이 질량 (

토론

이 연구는 선택한 상업 계기에 의해 분석 단계별 교정 활동 분석 결과 설명 ( 테이블의 자료를 참조) MALDI TOF MS를 사용 하 여. 주요 장점 포함 뇌관 및 템플릿 레이블 무료로 쉽게 수행 하는 실험 설계에서 더 큰 유연성을 허용 합니다. 스트림-석 회 완전 한 테스트를 교정 하는 30의 처리 등 수동으로 교정 반응을 수행 하기 위한 3 h 4 h 고 MALDI TOF MS 분석 위에서 언급 한 프로토콜을 사용 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligonucleotides	Mission Biotech (Taiwan)
phosphorothioate modified oligonucleotides	Integrated DNA Technologies (Taiwan)
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment	New England Biolabs, MA	M0210L
Klenow fragment (3'→5' exo-)	New England Biolabs, MA	M0212L
NEBuffer 2.1 (10X)	New England Biolabs, MA	B7202S
2', 3' ddATP	Trilink Biotechnologies, CA	N4001
2', 3' ddGTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4002
2', 3' ddTTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4004
2', 3' ddCTP	Trilink Biotechnologies, CA	N4005
dATP, dGTP, dCTP, dTTP set	Clubio, Taiwan	CB-R0315
SpectroCHIP array	Agena Bioscience, CA	#01509
MassARRAY	Agena Bioscience, CA
Typer 4.0 software	Agena Bioscience, CA	#10145
Clean Resin Tool Kit	Agena Bioscience, CA	#08040